重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用

摘要

本发明提供了重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。该重组PCV2 Rep蛋白的制备包括构建PCV2 Rep蛋白基因克隆载体及基因的改造；构建重组PCV2 Rep蛋白表达质粒载体、工程菌；重组PCV2 Rep蛋白的诱导表达及纯化；再用重组PCV2 Rep蛋白制备猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体ELISA检测试剂盒，能检测出猪血清中PCV2野毒感染抗体和PCV2全病毒灭活疫苗或全病毒弱毒疫苗免疫抗体，而对PCV2 Cap蛋白基因工程亚单位疫苗免疫猪血清抗体检测呈阴性反应；结合PCV2 Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒的应用，可区分亚单位疫苗免疫猪与野毒感染猪，便于养猪场的PCV2病毒净化。

权利要求

1.一种重组猪圆环病毒2型Rep蛋白，其特征在于，所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、构建重组猪圆环病毒2型Rep蛋白基因克隆载体：设计巢式PCR引物对所采集的PCV2野毒感染猪病料进行DNA提取和巢式PCR扩增后构建成PCV2 Rep蛋白基因克隆载体；

步骤2、重组猪圆环病毒2型Rep蛋白基因改造：针对步骤1所得的巢式PCR扩增产物设计引物实现PCV2 Rep蛋白基因表达密码子的优化；且通过Over lapping PCR的方法，在PCV2 Rep蛋白基因表达序列的5’端增加编码His的序列，并封闭原序列中的NcoⅠ酶切位点；

步骤3、构建重组猪圆环病毒2型Rep蛋白表达质粒载体，所述表达载体表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

步骤4、构建重组猪圆环病毒2型Rep蛋白表达工程菌；

步骤5、重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的诱导表达及纯化。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中巢式PCR引物如下：PCV2 rep巢式PCR外套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PCV2 rep巢式PCR外套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PCV2 rep巢式PCR内套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，PCV2 rep巢式PCR内套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述步骤2中密码子优化所用的引物如下：

密码子优化上游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

密码子优化下游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中Over lapping PCR包括Over lapping PCR A片段和Over lapping PCR B片段，Over lapping PCR A片段的扩增模板为密码子优化后的扩增产物所构建的加载了PCV2 rep基因的pET28a表达质粒，所述A片段的扩增引物为：A片段的扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

A片段的扩增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

Over lapping PCR B片段的扩增模板为密码子优化后的扩增产物所构建的加载了PCV2 rep基因的pET28a表达质粒，所述B片段的扩增引物为：B片段的扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

B片段的扩增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

Over lapping PCR AB片段的扩增的模板是A片段扩增产物和B片段扩增产物，AB片段扩增引物为：AB片段扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

AB片段扩增下游引物BP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中PCV2 Rep蛋白诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：8M尿素+0.05M pH7.4PBS；淋洗缓冲液：100mM咪唑+上样缓冲液；洗脱缓冲液：300mM咪唑+上样缓冲液。

6.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

7.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白表达工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求6所述的猪圆环病毒2型Rep蛋白表达载体。

8.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒包括：(A)包被有权利要求1所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的ELISA酶标板；

(B)标准阴性血清：PCV2抗体阴性的猪血清；

(C)标准阳性血清：PCV2抗体阴性的猪，用猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株接种后的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗猪IgG或抗豚鼠IgG；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

9.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白的抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：(1)制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白稀释后加到酶标板中吸附，空干包被洗液，加包被用封闭液封闭；

(2)待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

(3)酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗，抗猪IgG或抗豚鼠IgG加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

(4)加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。

说明书

重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法

与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒无囊膜、是单链负股环状DNA病毒，是最小的动物病毒之一。到目前为止，已经发现猪圆环病毒存在3个基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)，和猪圆环病毒3型(PCV3)。其中PCV2和PCV3有致病性，而PCV1无致病性。病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称结构。基因组大小约为1.76kb，含有2个主要开放性阅读框架(ORF)，其中ORFl基因产物与病毒复制酶相关(involved in virus replication，rep)，ORF2基因产物是构成病毒衣壳蛋白(Capsid protein,简称：cap)成分。

[0003] 加拿大科学家John Harding，于1991年报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)，后经研究证实猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2，PCV2)是该综合征的主要病原。主要症状表现为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎等。近年来还发现猪皮炎与肾炎综合症(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)、A2型先天性振颤(congenital tremor,CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferative and necrotizing Pneumonia,PNP)、繁殖障碍(Reproductive failure)等疾病都与PCV2有密切相关。

[0004] PCV2感染能引起一种临床综合征，主要侵害5-12周龄断奶仔猪，PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病呈世界流行，从2000年我国首次发现存在此病以来，已给我国养猪业造成了相当大的经济损失。但由于PCV2在体外培养时不产生细胞病变，病毒增殖能力差，采用传统的方法制备该病毒疫苗非常困难。

[0005] 用基因工程的方法制备猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制该病的重要途径。在重组疫苗研究中PCV2的Cap蛋白基因是最为重要的备选基因，因为Cap蛋白是该病毒主要的结构蛋白，含有型特异性抗原决定簇。有研究资料报道，PCV2的中和性单克隆抗体和多克隆猪抗血清都能与cap蛋白相识别和发生中和反应。在基因工程疫苗中，重组基因工程亚单位疫苗是最为安全的疫苗，而且其免疫的效果也最为确定，只要抗原蛋白的量足够大就能产生相应的特异性抗体。目前国内市场上已有杆状病毒表达的PCV2 cap蛋白生产的基因工程亚单位疫苗，和用大肠杆菌表达的PCV2 Cap蛋白生产的基因工程亚单位疫苗。

[0006] 疫苗免疫猪血清抗体检测是一种重要的免疫效果的评价方法，国内外已有许多检测猪血清PCV2抗体的ELISA检测方法。这些ELISA检测方法都是用重组表达的PCV2 Cap蛋白作为间接ELISA包被抗原。天然PCV2病毒感染和PCV2基因工程亚单位疫苗(Subunit vaccine，又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物—蛋白质或多肽制成疫苗。)免疫都会出现抗体阳性的检测结果。不能区分疫苗免疫猪和自然感染猪。不利于将养殖场里的已经感染猪圆环病毒2型的猪清除或淘汰，导致该病毒在养殖场长期传播，不能达到猪场PCV2病毒净化的目标。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明首先制备得到重组猪圆环病毒2型Rep蛋白，重组PCV2 Rep蛋白分子量约为39kD，经过一次亲和层析的纯化后蛋白纯度在95％以上；然后以PCV2 Rep重组蛋白为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该方法检测PCV2自然感染猪或PCV2全病毒灭活疫苗(或弱毒活疫苗)免疫猪血清，会出现阳性的检测结果；而检测PCV2 cap蛋白亚单位疫苗免疫猪血清则出现阴性结果。因此，用本发明的PCV2 Rep蛋白抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法，结合PCV2 Cap蛋白包被抗原的间接ELISA检测方法，就可以区分PCV2的自然感染抗体(或全病毒疫苗免疫猪抗体)与亚单位疫苗免疫抗体，为猪场中猪圆环病毒的净化提供依据。

[0008] 本发明是这样实现的：

[0009] 本发明的目的之一，在于提供一种重组猪圆环病毒2型Rep蛋白，所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 本发明的目的之二，在于提供重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的制备方法，包括如下步骤：

[0011] 步骤1、构建重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白基因克隆载体：设计巢式PCR引物对所采集的PCV2野毒感染猪病料进行DNA提取和巢式PCR扩增后构建成PCV2 Rep蛋白基因克隆载体；

[0012] 步骤2、重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白基因改造：针对步骤1所得的巢式PCR扩增产物设计引物实现PCV2 Rep蛋白基因表达密码子的优化；且通过Over lapping PCR的方法在PCV2 Rep蛋白基因表达序列的5’-端增加编码His的序列，并封闭原序列中的NcoⅠ酶切位点；

[0013] 步骤3、构建重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白表达质粒载体；构建的猪圆环病毒2型Rep蛋白表达质粒的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

[0014] 步骤4、构建重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白表达工程菌；

[0015] 步骤5、重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白的诱导表达及纯化。

[0016] 具体地，所述步骤1中巢式PCR引物如下：

[0017] PCV2 rep巢式PCR外套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，[0018] PCV2 rep巢式PCR外套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，[0019] PCV2 rep巢式PCR内套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，[0020] PCV2 rep巢式PCR内套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

[0021] 具体地，所述步骤2中密码子优化所用的引物如下：

[0022] 密码子优化上游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

[0023] 密码子优化下游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0024] 具体地，所述步骤2中Over lapping PCR包括Over lapping PCR A片段和Over lapping PCR B片段，

[0025] Over lapping PCR A片段的扩增模板为密码子优化后的扩增产物所构建的加载了PCV2 rep基因的pET28a表达质粒，所述A片段的扩增引物为：

[0026] A片段的扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

[0027] A片段的扩增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

[0028] Over lapping PCR B片段的扩增模板为密码子优化后的扩增产物所构建的加载了PCV2 rep基因的pET28a表达质粒，所述B片段的扩增引物为：

[0029] B片段的扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

[0030] B片段的扩增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

[0031] Over lapping PCR AB片段的扩增的模板是A片段扩增产物和B片段扩增产物，AB片段扩增引物为：

[0032] AB片段扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

[0033] AB片段扩增下游引物BP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

[0034] 综上所述，猪圆环病毒2型Rep蛋白基因改造的结果是：

[0035] (1)将PCV2 Rep蛋白原基因的第8位和第16位编码精氨酸的大肠杆菌稀有密码子，由AGA和AGG都变为CGT，提高PCV2 Rep蛋白表达量；

[0036] (2)将原PCV2 Rep蛋白的第207位His密码子由CAT变为CAC，以封闭原序列的CCATGG(NcoⅠ)酶切位点；

[0037] (3)在原pET28a质粒5’-端的His tag前添加了8个编码His的核苷酸序列，即：CAC CAT CAC CAC CAC CAC CAC CAT，以增强表达蛋白与Ni柱的亲和能力；

[0038] (4)去掉了原PCV2 Rep蛋白基因3’-端的终密码子TGA，使表达蛋白C端增加一组6×His Tag，进一步增强表达蛋白与Ni柱的亲和能力。

[0039] 具体地，所述步骤5中PCV2 Rep蛋白诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：8M尿素+0.05M pH7.4PBS；淋洗缓冲液：100mM咪唑+上样缓冲液；洗脱缓冲液：300mM咪唑+上样缓冲液。

[0040] 本发明的目的之三，在于提供一种猪圆环病毒2型Rep蛋白表达载体，所述表达载体表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

[0041] 本发明的目的之四，在于提供一种猪圆环病毒2型Rep蛋白表达工程菌，该工程菌包含所述的猪圆环病毒2型Rep蛋白表达载体。

[0042] 本发明的目的之五在于提供一种猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：

[0043] (A)用所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白包被的ELISA酶标板；

[0044] (B)标准阴性血清：PCV2抗体阴性的猪血清；

[0045] (C)标准阳性血清：PCV2抗体阴性猪,用猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株接种后采集的血清；

[0046] (D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗猪IgG或抗豚鼠IgG；

[0047] (E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

[0048] 本发明的目的之六，在于提供猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

[0049] (1)制备检测用ELISA酶标板：包被缓冲液将所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白稀释后加到酶标板中吸附，空干包被洗液，加包被用封闭液封闭；

[0050] (2)待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

[0051] (3)酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗，抗猪IgG或抗豚鼠IgG，加入ELISA酶标板洗涤液洗涤，甩干；

[0052] (4)加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。

[0053] 本发明的目的之七，在于提供所述的ELISA检测试剂盒在区分亚单位疫苗免疫猪和全病毒感染猪或全病毒疫苗免疫猪中的应用。

[0054] 本发明具有的有益效果是：

[0055] 1、本发明提供猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及检测方法，首先制备得到猪圆环病毒2型Rep蛋白，然后以重组PCV2 Rep蛋白为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该方法检测PCV2自然感染猪或PCV2全病毒灭活疫苗(或弱毒活疫苗)免疫猪血清，会出现阳性的检测结果；而检测PCV2 cap蛋白亚单位疫苗免疫猪血清，则出现阴性结果。因此，用本发明的PCV2 Rep蛋白抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法，结合PCV2 Cap蛋白包被抗原的间接ELISA检测方法，就可以区分PCV2的自然感染抗体(或全病毒疫苗免疫猪抗体)与亚单位疫苗免疫抗体，为猪场中猪圆环病毒的净化提供依据。

[0056] 2、本发明提供的猪圆环病毒2型Rep蛋白的制备方法，

[0057] 步骤1中，设计2套独特引物，通过巢式PCR的方法克隆在湖北地区流行的PCV2病毒株的Rep蛋白基因；

[0058] 步骤2中，通过设计一段长引物，将PCV2 Rep蛋白原基因的第8位和第16位编码精氨酸的大肠杆菌稀有密码子，由AGA和AGG都变为CGT，以提高PCV2 Rep蛋白表达量；PCV2 Rep蛋白基因增加His序列改造的目的，是增大表达蛋白与纯化用亲和层析柱(Ni柱)的亲和力，该项改造通过2个基因操作实验完成。最终猪圆环病毒2型Rep蛋白基因改造的结果是：

[0059] (1)将PCV2 Rep蛋白原基因的第8位和第16位编码精氨酸的大肠杆菌稀有密码子，由AGA和AGG都变为CGT，提高PCV2 Rep蛋白表达量；

[0060] (2)将原PCV2 Rep蛋白的第207位His密码子由CAT变为CAC，以封闭原序列的CCATGG(NcoⅠ)酶切位点；

[0061] (3)在原pET28a质粒5’-端的His tag前添加了8个编码His的核苷酸序列，即：CAC CAT CAC CAC CAC CAC CAC CAT，以增强表达蛋白与Ni柱的亲和能力；

[0062] (4)去掉了原PCV2 Rep蛋白基因3’-端的终密码子TGA，在表达蛋白C端增加一组6×His Tag，进一步增强表达蛋白与Ni柱的亲和能力。

[0063] 所述步骤5中经过诱导表达和纯化的重组PCV2 Rep蛋白，经过SDS-PAGE电泳后，用image J软件进行峰面积分析，计算蛋白纯度，一次亲和层析后蛋白纯度可达到95％以上。

附图说明

[0064] 图1为本发明实施例提供的重组PCV2 Rep蛋白表达工程菌E.coli  BL21/pET28aPCV2 Rep M2诱导表达电泳检测图；其中，

[0065] 泳道1、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1全菌；

[0066] 泳道2、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1上清；

[0067] 泳道3、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品2全菌；

[0068] 泳道4、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品2上清；

[0069] 泳道5、E.coli BL21/pET28a全菌样品；

[0070] 泳道6、Blue Plus Protein Marker(14-100kDa),从下向上分别为：14,25,30,40,50,70,100kDa；

[0071] 图2为本发明实施例提供的图2.重组PCV2 Rep蛋白纯化产物电泳图；其中，[0072] 泳道1、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1包涵体用PBS清洗后加8M尿素+0.05M pH 7.4PBS复溶；

[0073] 泳道2、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品2包涵体用PBS清洗后加8M尿素+0.05M pH 7.4PBS复溶；

[0074] 泳道3、Blue Plus Protein Marker(14-100kDa),从下向上分别为：14,25,30,40,50,70,100kDa；

[0075] 泳道4、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1洗脱液5号收集管；

[0076] 泳道5、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1洗脱液6号收集管；

[0077] 泳道6、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1洗脱液7号收集管；

[0078] 泳道7、E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2样品1洗脱液8号收集管。

具体实施方式

[0079] 实施例1猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白基因的克隆

[0080] 一、病料DNA的提取

[0081] 取猪圆环病毒2型感染后病死猪的腹股沟淋巴结样品0.5g，加无菌生理盐水4.5ml，置于玻璃匀浆器中制成匀浆。取472μl淋巴结匀浆液，加入25μl10％SDS和2.5μl蛋白酶K(25mg/ml)，置于50℃水浴作用2小时，加入500μl饱和酚，涡旋30秒，置12000rpm离心10分钟。将上清移入另外一支离心管中，加500μl的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合后置
12000rpm离心10分钟。取上清，按1/10体积加入3mol/L醋酸钠(pH值5.3)，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃冰箱中30分钟。以15000rpm离心10分钟，弃上清后加入70％乙醇1ml洗涤沉淀，以15000rpm离心10分钟，弃上清，真空干燥DNA沉淀。使用前加入30μl双蒸水溶解，置-
20℃冰箱中保存备用。

[0082] 二、巢式PCR扩增PCV2 Rep蛋白基因

[0083] 1、设计巢式PCR引物如表1所示，有下划线的部分是限制性核酸内切酶位点，通过巢式PCR的方法克隆在湖北地区流行的PCV2病毒株的Rep蛋白基因。

[0084] 表1

[0085]

[0086]

[0087] 2、运用PCV2 rep外套上游引物PF、PCV2 rep外套下游引物PR进行第一轮扩增，扩增体系如表2所示，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,30S,→62℃,45S,→72℃,60S)×30→72℃,10min。扩增产物用于后续内套引物进一步扩增。

[0088] 表2

[0089]

[0090] 3、以上述外套扩增产物作为模板，以PCV2 rep巢式PCR内套上游引物PF、PCV2 rep巢式PCR内套下游引物PR作为引物对进行内套扩增，扩增体系如表3所示，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,30S,→62℃,45S,→72℃,60S)×35→72℃,10min。

[0091] 表3

[0092]

[0093] 4、琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，连接到pTOPO-TA质粒载体上。转化大肠杆菌DH5α，转化菌命名为：E.coli DH5α/pTOPO-PCV2 Rep,经PCR鉴定后送上海生物工程有限公司进行序列测定。测序结果PCV2 Rep野生型蛋白基因序列如SEQ ID NO.15所示。

[0094] 5、经过克隆基因的序列测定和分析比对，发现该基因与在GenBank发布的许多PCV2序列的同源性达到100％，其中具有代表性的序列发布来源地有：河南省、四川省、Budapest(匈牙利)、江西省、福建省、山东省、Kangwon National University(韩国)、河北省、Seoul National University(韩国)、甘肃省、Montevideo(乌拉圭)、江苏省。表明这段序列非常保守，具有广泛的适用性，适合用作检测分析的序列。

[0095] 实施例2PCV2 Rep蛋白基因的改造与表达

[0096] 一、PCV2 Rep蛋白基因的改造

[0097] 1、本申请人将实施例1所构建的质粒DNApTOPO-PCV2 Rep用限制性核酸内切酶BamHⅠ/HindⅢ双酶切后插入表达质粒pET 28a中，构建表达质粒载体。命名为：pET28a PCV2 Rep。用连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子。构建成PCV2 Rep蛋白表达工程菌。命名为：E.coli BL21/pET28a PCV2Rep。然后进行诱导表达实验，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。诱导产物用SDS-PAGE电泳进行检测。结果显示有明显的Rep蛋白表达，但是表达量较低，约为总蛋白的10％-15％。表达蛋白主要为包涵体，不可溶。而且用cOmplet His-Tag purification Resin(Coche产品)变性条件下的蛋白纯化流程，不能挂上Ni柱，无法进行亲和层析分离纯化。为此，我们对原基因进行了如下改造。

[0098] 2、PCV2 Rep蛋白基因的密码子优化

[0099] (1)通过设计新引物(密码子优化引物对如下表4所示)，将原基因第8位和第16位编码精氨酸的大肠杆菌稀有密码子由AGA和AGG都变为CGT，以提高PCV2 Rep蛋白表达量。

[0100] 表4

[0101]

[0102] (2)扩增所用的温度循环参数：94℃，5min→(94℃,30S,→62℃,45S,→72℃,60S)×35→72℃,10min。扩增体系如表5所示：

[0103] 表5

[0104]

[0105]

[0106] (3)琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，连接到pTOPO-TA质粒载体上。转化大肠杆菌DH5α，转化菌命名为：E.coli DH5α/pTOPO-PCV2 Rep M1。从转化菌中提取质粒DNA用限制性核酸内切酶BamHⅠ/HindⅢ双酶切后插入表达质粒pET 28a中，构建表达质粒载体。命名为：pET28a PCV2 Rep M1。用连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选转化子。构建成PCV2 Rep蛋白表达工程菌。命名为：E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M1。

[0107] (4)然后进行诱导表达实验，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。诱导产物用SDS-PAGE电泳进行检测。结果显示有明显的Rep蛋白表达，但是表达量较高，约为总蛋白的25％-35％。表达蛋白主要为包涵体，不可溶。而且用cOmplet His-Tag purification Resin(Coche产品)变性条件下的蛋白纯化流程，也不能挂上Ni柱，无法进行亲和层析分离纯化。为此，我们对原基因进行了增加His序列的改造。

[0108] 3、PCV2 Rep蛋白基因增加His序列的改造

[0109] (1)实施例1的测序结果显示，在PCV2 Rep蛋白基因的第618bp处有一个Nco I酶切点(NcoI：C/CATGG)，用Over lapping PCR的方法封闭该酶切位点。同时合成一个有14个His编码序列的上游引物，以构建一个与Ni柱有强亲和力的Rep蛋白表达序列。Overlapping PCR设计的引物如下表6所示。

[0110] 表6

[0111]

[0112] (2)A片段的扩增

[0113] 表6中，A片段扩增上游引物序列(AP1)：有下划线的序列是添加的8组His密码子，用于增加pET28a的His编码序列表达长度，加强表达蛋白与Ni柱的亲和力。采用如下表7所示的扩增体系进行扩增，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,30S,→62℃,45S,→72℃,60S)×20→72℃,10min。保留扩增产物备用。

[0114] 表7

[0115]

[0116]

[0117] (3)B片段扩增

[0118] B片段扩增下游引物序列(BP2)：在该引物设计中去掉原序列的终止密码子TGA，以备在构建表达质粒时借用载体3’-端的6×His序列和终止密码子。

[0119] 该引物扩增体系如表8，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,30S,→62℃,45S,→72℃,60S)×20→72℃,10min。保留扩增产物备用。

[0120] 表8

[0121]

[0122] (4)AB片段扩增

[0123] 扩增体系如表9，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,30S,→62℃,45S,→72℃,60S)×35→72℃,10min。

[0124] 表9

[0125]

[0126]

[0127] (5)扩增产物回收后用NcoⅠ/HindⅢ双酶切后插入pET 28a质粒中构建表达质粒载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化菌命名为：E.coli BL21/pET28a-PCV2 Rep M2。经过序列测定，表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，及推导的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0128] 本实例的基因改造的结果是：1)将PCV2 Rep蛋白原基因的第8位和第16位编码精氨酸的大肠杆菌稀有密码子，由AGA和AGG都变为CGT。以提高PCV2 Rep蛋白表达量；2)将原PCV2 Rep蛋白的第207位His密码子由CAT变为CAC，以封闭原序列的CCATGG(NcoⅠ)酶切位点；3)在原pET28a质粒5’-端的His tag前添加了8个编码His的核苷酸序列CAC CAT CAC CAC CAC CAC CAC CAT，以增强表达蛋白亲和Ni柱的能力；4)去掉了原PCV2 Rep蛋白基因3’-端的终密码子TGA，使表达蛋白C端增加一组6×His Tag，进一步增强表达蛋白亲和Ni柱的能力。

[0129] 本实例构建的表达质粒命名为pET 28aPCV2 Rep M2。

[0130] 二、重组PCV2 Rep蛋白基因的表达及纯化

[0131] 1、用构建成的重组PCV2 Rep蛋白表达工程菌E.coli BL21/pET28a PCV2Rep M2进行诱导表达实验。诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/L。诱导产物用12％SDS-PAGE电泳进行检测。结果显示有明显的Rep蛋白表达且表达量较高，按照Image J软件的分析结果，2个相同的工程菌平行表达后的目的蛋白含量分别为菌体总蛋白的37.5％和39.4％。表达蛋白主要为包涵体，不可溶(重组PCV2 Rep蛋白表达工程菌E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2诱导表达电泳检测图如图1所示)。而且用cOmplet His-Tag purification Resin(Coche产品)变性条件下的蛋白纯化流程，能连接上Ni柱，可以进行亲和层析分离纯化。

[0132] 2、将E.coli BL21/pET28a PCV2 Rep M2蛋白包涵体用足量PBS清洗后，用8M尿素变性缓冲液溶解沉淀。离心取上清，过滤待用。1.5ml变性蛋白上清过滤后加样于2.5ml cOmplet His-Tagpurification Resin(Coche产品)层析柱。

[0133] 上样缓冲液：8M尿素+0.05M pH 7.4PBS。

[0134] 淋洗缓冲液：上样缓冲液+100mM咪唑

[0135] 洗脱缓冲液：上样缓冲液+300mM咪唑

[0136] 3、分别取5-8号管各洗脱液500μL加上500μL饱和液体硫酸铵4℃过夜离心收集沉淀。然后分别用100μL含8M尿素的PBS液复溶蛋白沉淀，用12％SDS-PAGE电泳检测。结果见附图2。用Image J软件对附图2的结果进行分析，第5号，6号，7号，8号洗脱收集管中的目的蛋白纯度分别为：95.1％，96.6％，95.4％，和97.4％。

[0137] 实施例3猪圆环病毒2型Rep蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒及使用方法[0138] 1、包被酶标板

[0139] (1)包被液：0.05M pH 9.5碳酸缓冲液

[0140]

[0141] (2)包被用洗液：0.01M pH7.2磷酸钾缓冲液

[0142] K2HPO4·3H2O         1.56g

[0143] KH2PO4               0.38g

[0144] 调pH至7.2，定容至1000ml。

[0145] (3)包被方法：取实施例2中纯化的PCV2 Rep重组蛋白，用包被液稀释至蛋白含量为25μg/ml，96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去包被液，包被用洗液洗板3次。

[0146] (4)确定抗原蛋白包被浓度时，先用包被液将纯化的重组PCV2 Rep蛋白稀释至蛋白含量为5μg/ml，10μg/ml,20μg/ml，25μg/ml，30μg/ml,40μg/ml，加至96孔酶标板的微孔中，每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。从中选择一个优化的包被浓度，即25μg/ml。

[0147] 2、封闭：

[0148] (1)包被用封闭液：

[0149]

[0150] (2)封闭操作：空干包被洗液，加包被用封闭液150μL/孔，置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥24小时。

[0151] 3、阴阳性血清的孵育(一抗孵育)

[0152] (1)血清稀释液制备：LB固体培养基平板上挑取E.coli BL21单菌落，转接于含LB液体培养基的试管中，37℃培养12小时，做种子菌液。将该种子菌液按5％的比例接种于250ml LB液体培养基中，37℃培养7小时。置于离心管中，8000转/分离心10分钟，收集菌体。
将菌体按1:10(重量/体积)的比例重悬于PBS液中，进行超声波破菌。置于12000转/分下离心10分钟，弃去沉淀，收集上清液。将上清液进行蛋白含量测定后用PBS液稀释至总蛋白含量为1.2mg/ml。

[0153] (2)标准阴性血清制备：PCV2抗体阴性的母猪所产仔猪，剥离胎衣后进行人工喂养至4-5周龄，采血并分离血清。将分离血清作1:800倍稀释后备用。

[0154] (3)标准阳性血清制备：PCV2抗体阴性的母猪所产仔猪，剥离胎衣后进行人工喂养至3周龄。用猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)接种，每头猪颈部肌肉注射2ml。一免后3周，用同种疫苗相同剂量进行二免。二免后2周，用猪圆环病毒2型FJ株攻毒(病毒含量为106.25TCID50/ml),每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml。攻毒后27天采血，分离血清。用样品稀释液作1:800稀释后备用。

[0155] (4)洗涤液：(10倍浓度)

[0156]

[0157] (5)操作：待检血清(猪血清或替代实验动物豚鼠血清)用PBS液作血清稀释液，按1:400倍的比例稀释，加入包被板孔中，100μL/孔。直接吸取标准阳性血清或标准阴性血清加入包被板孔中，100μL/孔。置酶标板于37℃，30min。

[0158] 空净血清稀释液后用洗涤液洗板5次。

[0159] 4、酶标二抗的孵育

[0160] 用血清稀释液将辣根过氧化物酶标记的酶标二抗(抗猪IgG,或抗豚鼠IgG)稀释至工作浓度，向酶标板孔中加入100μL/孔，置37℃，30min。

[0161] 5、显色：

[0162] 加入底物液A50μL，底物液B 50μL，轻摇混合，37℃反应10min。

[0163] (1)底物溶液A

[0164]

[0165] (2)底物溶液B

[0166]

[0167] 6、终止：

[0168] 终止液：2mol/L H2SO4。

[0169] 显色结束后加终止液100μL/孔。

[0170] 7、读板：

[0171] 在450nm波长下，读取酶标板光吸收值。

[0172] 需要说明的是，本发明提供的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白应用于制备ELISA试剂盒,也可用于制备免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。

[0173] 实施例4猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体的ELISA检测试剂盒的应用

[0174] 一、实验猪血清抗体检测中的应用

[0175] 1、实验猪来源：猪圆环病毒2型抗体阴性母猪所产乳猪，剥离胎衣后进行人工喂养至4周龄。取20头成活小猪,于4周龄采血，并分离血清。将分离血清作1:800倍稀释后备用。用 PCV2抗体检测试剂盒确认为PCV2抗体阴性血清。

[0176] 2、实验猪分组：将实验猪分为4组。第一组，5头猪为阴性对照；第二组，5头猪接种PCV2福建株(青岛易邦生物工程有限公司分离保存)活病毒，病毒代次为第5代，病毒滴度为106.51TCID50/ml,每滴鼻1ml/头猪,肌肉注射2ml；第三组，5头猪肌肉免疫注射青岛易邦生物工程有限公司的猪圆环病毒2型基因工程亚单位(Cap蛋白)疫苗，2ml/头猪；第四组，5头猪免疫注射梅里亚公司PCV2全病毒灭活疫苗(MERIAL  Inactivated oil 
adjuvant vaccine),2ml/头猪。

[0177] 3、实验方法：免疫前和免疫后28天采血，分离血清，用实施例3的方法检测血清中抗PCV2 Rep蛋白抗体。

[0178] 4、实验结果：结果的判定依据是：样品的OD450值(S)/标准阴性OD450值(N)小于1.6为阴性；S/N大于或等于1.6但是小于2.1为可疑；S/N大于或等于2.1为阳性。检测结果如下：

[0179] 表10实验猪PCV2 Rep蛋白抗体检测结果

[0180]

[0181] PCV2 Rep蛋白抗体间接ELISA检测实验猪血清抗体时，接种PCV2活毒感染猪和免疫注射MERIAL PCV2全病毒灭活疫苗后的猪血清抗体为阳性；免疫青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗的猪血清抗体为阴性。

[0182] 以上结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

[0183] 表11实验猪PCV2 Rep蛋白抗体检测结果统计分析表

[0184]

[0185] 注：检测数据用SPSS 17.0统计分析软件的One-Way ANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b,c)的组之间差异显著(P<0.05)。

[0186] 表11统计结果表明：

[0187] (1)4个实验组在免疫前的OD450值和S/N值均无显著性差异；

[0188] (2)疫苗免疫后28天，青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组与阴性对照组之间OD450值和S/N值无显著性差异；

[0189] (3)疫苗免疫后28天，PCV2福建株活病毒接种组显著高于青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组与阴性对照组；

[0190] (4)疫苗免疫后28天，MERIAL PCV2全病毒灭活苗免疫组的OD450值和S/N值，显著高于PCV2福建株活病毒接种组，更高于青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组和阴性对照组。

[0191] 5、为了便于区分亚单位疫苗免疫猪和全病毒感染猪或全病毒疫苗免疫猪，我们用青岛易邦生物工程有限公司生产的PCV2 Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒进行平行对照检测，结果如下：

[0192] 结果的判定依据是：样品的OD450值(S)/标准阴性OD450值(N)小于1.6为阴性；S/N大于或等于1.6但是小于2.1为可疑；S/N大于或等于2.1为阳性。

[0193] 表12实验猪PCV2 Cap蛋白抗体检测结果

[0194]

[0195] 结果显示，PCV2 cap蛋白抗体间接ELISA试剂盒检测实验猪血清抗体结果为：接PCV2活毒感染猪和免疫MERIAL PCV2全病毒灭活疫苗后的猪血清抗体为阳性；免疫青岛易邦生物工程公司PCV2 cap蛋白亚单位疫苗的猪血清抗体也为阳性。

[0196] 以上结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

[0197] 表13实验猪PCV2 Cap蛋白抗体检测结果统计分析表

[0198]

[0199] 注：检测数据用SPSS 17.0统计分析软件的One-Way ANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b,c,d)的组之间差异显著(P<0.05)。

[0200] 表13统计结果显示：

[0201] (1)4个实验组在免疫前的OD450值和S/N值均无显著性差异；

[0202] (2)4个实验组在疫苗免疫后28天，OD450值和S/N值有显著性差异；

[0203] (3)接毒后28天，PCV2福建株活病毒接种组的OD450值和S/N值显著高于阴性对照组；

[0204] (4)疫苗免疫后28天，青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组的OD450值和S/N值显著高于MERIAL PCV2全病毒灭活苗免疫组，二者也显著高于PCV2福建株活病毒接种组和阴性对照组；

[0205] 由此可见，联合PCV2 Rep蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒和PCV2 cap蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，可以区分亚单位疫苗免疫猪和全病毒感染猪或全病毒疫苗免疫猪。

[0206] 二、实验模型动物豚鼠血清抗体检测中的应用

[0207] 因为在自然状态下饲养的猪PCV2抗体阳性的比率较高，抗体阴性的实验猪比较难找。而豚鼠的血清PCV2抗体全为阴性，背景均一，是比较好的实验猪的替代模型动物。用豚鼠的免疫实验可以进一步确认本发明的真实可靠性。

[0208] 1、豚鼠来源：Hartley豚鼠30只，购自湖北省实验动物研究中心。

[0209] 2、实验豚鼠分组：30只豚鼠随机分为3组。第一组10只豚鼠，为阴性对照；第二组10只豚鼠，免疫青岛易邦生物工程有限公司的PCV2 Cap蛋白基因工程亚单位疫苗；第三组10只豚鼠，免疫梅里亚公司PCV2全病毒灭活疫苗(MERIAL  Inactivated oil adjuvantvaccine)。

[0210] 3、结果的判定依据是：样品的OD450值(S)/标准阴性OD450值(N)小于1.6为阴性；S/N大于或等于1.6但是小于2.1为可疑；S/N大于或等于2.1为阳性。

[0211] 表14豚鼠PCV2 Rep蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的检测结果

[0212]

[0213]

[0214] 4、豚鼠PCV2 Rep蛋白抗体间接ELISA检测结果显示，免疫MERIAL PCV2全病毒灭活疫苗后的血清抗体为阳性；免疫青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗的豚鼠血清抗体为阴性。

[0215] 5、统计学分析

[0216] 以上结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

[0217] 表15豚鼠PCV2 Rep蛋白抗体检测结果统计分析表

[0218]

[0219] 注：检测数据用SPSS 17.0统计分析软件的One-Way ANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b)的组之间差异显著(P<0.05)。

[0220] 表15统计结果显示：

[0221] (1)阴性对照组，MERIAL PCV2全病毒灭活苗免疫组，青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组的豚鼠在免疫前血清中抗PCV2 rep蛋白抗体均为阴性，组间OD450和S/N值均无显著性差异；

[0222] (2)免疫后28天，MERIAPCV2全病毒灭活苗免疫组的OD450和S/N值显著高于阴性对照组；

[0223] (3)免疫后28天，青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组的OD450和S/N值与阴性对照组间无显著性差异。

[0224] 6、同样，为了说明本发明在区分亚单位疫苗免疫动物和全病毒疫苗免疫动物中的作用，我们用PCV2 cap蛋白ELISA试剂盒进行了比较实验。结果如下：

[0225] 表16豚鼠PCV2 Cap蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的检测结果

[0226]

[0227]

[0228] 用青岛易邦生物工程有限公司的PCV2 Cap蛋白抗体ELISA试剂盒检测结果显示：免疫MERIAL PCV2全病毒灭活疫苗后的血清抗体为阳性；免疫青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗的猪血清抗体也为阳性。

[0229] 以上结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

[0230] 表17豚鼠PCV2 Cap蛋白抗体检测结果统计分析表

[0231]

[0232] 注：检测数据用SPSS 17.0统计分析软件的One-Way ANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b)的组之间差异显著(P<0.05)。

[0233] 表17统计结果显示：

[0234] (1)阴性对照组，MERIAL PCV2全病毒灭活苗免疫组，青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组的豚鼠在免疫前血清中抗PCV2 cap蛋白抗体均为阴性，组间OD450和S/N值均无显著性差异；

[0235] (2)免疫后28天，MERIAL PCV2全病毒灭活苗免疫组和青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组，抗PCV2 cap蛋白抗体均为阳性，OD450和S/N值均显著高于阴性对照组；

[0236] (3)MERIAL PCV2全病毒灭活苗免疫组与青岛易邦生物工程公司PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫组间的OD450和S/N值无显著性差异。

[0237] 结果表明，联合应用PCV2 Rep蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒和PCV2 Cap蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，可以区分PCV2 cap蛋白亚单位疫苗免疫豚鼠和全病毒疫苗免疫豚鼠。

[0238] 三、田间试验猪血清抗体检测中的应用

[0239] 从山东，河北，福建，四川采集未免疫猪圆环病毒疫苗的猪圆环病毒感染猪血清样品，同时用本发明的PCV2 Rep蛋白抗体ELISA检测方法和青岛易邦公司的PCV2 Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒进行检测。

[0240] 结果的判定依据是：样品的OD450值(S)/标准阴性OD450值(N)小于1.6为阴性；S/N大于或等于1.6但是小于2.1为可疑；S/N大于或等于2.1为阳性。结果如下表：

[0241] 表18田间感染猪血清PCV2 rep蛋白抗体和PCV2 cap蛋白抗体检测结果[0242]

[0243]

[0244] 以上结果显示，猪圆环病毒野毒感染的猪血清样品，用本发明的PCV2 Rep蛋白抗体ELISA检测方法和青岛易邦公司的PCV2 Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果均为阳性,结果判断的符合率为100％。

[0245] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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