一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法

摘要

本发明提供一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法，首先在嗜水气单胞菌生物被膜形成最佳条件下培养形成生物被膜，收集形成的生物被膜，然后进行高压灭菌，离心收集上清液，再用细菌滤器过滤除去菌体杂质等成分，在上述得到的滤液中加入乙醇溶液，低温沉淀后弃上清液得到生物被膜粗多糖，在上述获得的粗多糖溶液中加入蛋白酶，作用一定时间后离心取上清液，乙醇沉淀得到生物被膜多糖。本发明利用高压灭菌以及细菌滤器过滤等方法，能有效的除去细菌菌体和菌体碎片等成分，提高了多糖的纯度；利用蛋白酶水解多糖糖链上的蛋白质，去除生物被膜中的蛋白质，进一步提高了生物被膜多糖的纯度，减少了蛋白质在多糖功能研究中对结果的影响。

权利要求

1.一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法，其特征在于，通过以下步骤实现： （1）嗜水气单胞菌生物被膜的收集：取嗜水气单胞菌菌种，单菌落接于 LB 培养基，培 养至培养基浑浊，去除培养皿中的 LB 培养基，用 PBS 溶液清洗，然后吹打黏附于培养皿的 生物被膜，离心弃去上清后再用 PBS 溶液清洗，稀释为悬浊液；（2）所得悬浊液高压灭菌，离心收集并合并上清液，将上清液用 0.22μm 的滤菌器过滤， 除去菌体杂质；（3）在上清液中加入无水乙醇，使其 V/V 比为 80%，静置过夜，倾倒上清，无水乙醇 小心洗涤沉淀，用蒸馏水收集，得嗜水气单胞菌生物被膜粗多糖；（4）粗多糖加蛋白酶 E 于 37℃水浴 3h，离心取上清，乙醇沉淀，得嗜水气单胞菌生物 被膜多糖；

步 骤（1）单菌落接于 LB 培养基后，160r/min，37℃培养 4 小时培养至培养基浑浊，用 0.01MpH 7.2 的 PBS 溶液清洗；步 骤（2）所得悬浊液高压灭菌 30min，12000r/min，4℃离心 20min；步 骤（3）加入无水乙醇后，4℃静置过夜，6000r/min，4℃离心 15min。

2.根据权利要求 1 所述的一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法，其特征在于，步骤（1）的嗜水气单胞菌菌种来源于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CVCC 

4003。

说明书

一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物提取方法，涉及一种提取嗜水气单胞菌生物被膜多糖的方法。

背景技术

[0002] 嗜水气单胞菌广泛存在于淡水、土壤、淤泥中，鱼类、哺乳类、两栖类、鸟类等动物中均可检出。其致病性广，感染动物可表现败血症和皮肤溃疡；此外也可引起人类发病，造成人体皮肤和软组织感染，引发急性胃肠炎等。嗜水气单胞菌对水生动物的影响尤为巨大，可对水产养殖业造成严重的经济损失。为防治该疾病，相关疫苗的研究正不断推进。在各类疫苗中，口服疫苗操作简单便捷，但口服疫苗容易被消化降解，因此受到免疫效果的限制，推广应用受限。因此，如何避免抗原被降解，使其保持免疫原性，提高疫苗的免疫效果是水产动物疫病防治迫切需要解决的问题。细菌生物被膜是细菌依靠特有的粘附性，能够在与其接触的表面(或载体表面)上产生纤维蛋白、多糖基质、脂质蛋白等分泌物，这些物质与自身包绕形成细菌聚集膜样物。多糖基质是多糖和蛋白复合形成的，还有沉淀在生物被膜周边的无机物和有机物生物等。生物被膜包括水、自身及其分泌的多糖、肽聚糖、磷脂、DNA、RNA和蛋白质等。实验研究表明，生物被膜可通过保护疫苗免受消化降解，提高相应疫苗对动物的保护力。其中生物被膜基质的多糖组分除了起着包括粘附，保护和固定结构的作用外，可能保护抗原被降解和作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果。因为生物被膜是多种成分的混合膜状物，多糖是其成分之一，因此需要将多糖从生物被膜中提取出来研究起生物学作用。

[0003] 生物被膜基质中包含多种多样的复杂物质，因此从中提纯单一的多糖成分是比较困难的。目前提取细菌生物被膜多糖的研究较少，而提取细菌荚膜多糖的研究较为成熟。对于细菌荚膜多糖的提取，多数研究学者采用CTAB法，即以CTAB(十二烷基三甲基溴化物)结合多糖后，用一定浓度的NaCl或CaCl2解离，释放结合的多糖，最后无水乙醇沉淀多糖获得多糖粗提物。Scott首先发现CTAB对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季胺络合物而沉淀多糖。多糖是多羟基的醛或酮，在多糖溶液中加入乙醇，可破坏多糖溶液中的氢键，从而降低多糖在水中的溶解度，使多糖沉淀析出。不同浓度的醇沉淀的组分不一样，一般在无水乙醇体积占比80％时，可沉淀绝大多数多糖，而单糖在高浓度醇中有一定的溶解性。

[0004] 因此，为了更好的研究生物被膜多糖在疫苗免疫中的作用，深入了解多糖的作用机理，需要一种简单、实用、高效的生物被膜多糖提取方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法，是一种简单、实用和高效方法。

[0006] 本发明的一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法是首先采用吹打的方法收集嗜水气单胞菌生物被膜，然后进行高压灭菌以释放生物被膜中的多糖成分，离心收集上清液，用细菌滤器过滤除去菌体杂质等沉淀物，在上述得到的上清液中加入乙醇溶液，低温沉淀后弃上清液得到生物被膜粗多糖，在上述提取的粗多糖溶液中加入蛋白酶，作用后离心取上清液，乙醇沉淀得到生物被膜多糖。

[0007] 本发明的提取方法，通过以下步骤实现：

[0008] 1.嗜水气单胞菌生物被膜的收集：取嗜水气单胞菌菌种(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CVCC 4003)，单菌落接于LB培养基，160r/min，37℃培养4小时至培养基浑浊，去除培养皿中的LB培养基，用0.01MpH 7.2的PBS溶液清洗，然后用移液器小心吹打黏附于培养皿的生物被膜，离心弃去上清后再用上述PBS清洗，适度稀释为悬浊液；

[0009] 2.所得悬浊液高压灭菌30min，12000r/min，4℃离心20min，收集并合并上清液，将上清液用0.22μm的滤菌器过滤，除去菌体杂质等；

[0010] 3.在上清液中加入无水乙醇，使其比例为80％(V/V)，4℃静置过夜，6000r/min，4℃离心15min，倾倒上清，无水乙醇小心洗涤沉淀后，用蒸馏水收集，得嗜水气单胞菌生物被膜粗多糖；

[0011] 4.粗多糖加蛋白酶E于37℃水浴3h，离心取上清，乙醇沉淀，得嗜水气单胞菌生物被膜多糖。

[0012] 本发明提取嗜水气单胞菌生物被膜多糖的方法是利用移液器吹打收集黏附在培养皿上的生物被膜，多次PBS清洗并离心，能有效的去除培养基成分及黏附在生物被膜上的杂质；利用高压灭菌、过滤等方法除去生物被膜中的菌体等成分，能有效的保证生物被膜中多糖的纯度；乙醇沉淀得到粗多糖后再用蛋白酶处理，去除了粗多糖中的大部分蛋白成分，进一步提高了多糖的纯度，蛋白去除率达到81.6％，多糖保留率达到91.2％。而Sevage法去除蛋白，脱1次蛋白时多糖保留率为87.8％，但蛋白质去除率为24.6％，脱蛋白6次后，蛋白质去除率为63.5％，但多糖的保留率仅有2.7％。Sevage法与酶解法联用，蛋白质去除率可从81.6％提升到98.8％，但多糖的保留率从91.2％降至61.2％。盐析法去除蛋白，多糖保留率虽可达到94.4％，但蛋白质去除率只有67.4％。本发明提供的一种嗜水气单胞菌生物被膜多糖的提取方法，可为细菌生物被膜及其多糖的生物学功能研究提供帮助。

附图说明

[0013] 图1是苯酚-硫酸法测定多糖标准曲线。

[0014] 图2是考马斯亮蓝法测定蛋白质标准曲线。

具体实施方式

[0015] 本发明结合附图和实施例做进一步的说明。

[0016] 本发明提取嗜水气单胞菌生物被膜多糖的方法中涉及的仪器和试剂为：恒温摇HZ-9211KB产品；酶标仪ELx800产品；紫外分光光度计Genesys产品；恒温生化培养箱Safe SPX-350产品、离心机CF16RXII产品。小牛血清、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250均为上海生工生物工程有限公司产品；蛋白酶E为合肥博美生物科技有限公司产品；乙醇、葡萄糖、氯化钙、苯酚均为国产分析纯。

[0017] 实施例1一种提取嗜水气单胞菌生物被膜多糖的方法

[0018] (1)嗜水气单胞菌生物被膜的收集：于-80℃冰箱中取出取嗜水气单胞菌菌种(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CVCC 4003)，复苏后挑取单菌落接于LB培养基，160r/min，37℃培养4小时至培养基浑浊。将菌液与嗜水气单胞菌生物被膜形成培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖20g/L，氯化钙10mmol/L，5％小牛血清，pH7.4)1：100比例加入15cm×15cm培养皿，每个平皿30mL，25℃恒温培养24h；

[0019] (2)嗜水气单胞菌生物被膜的收集：培养24h后，小心倾倒弃去培养皿中的培养基，用0.01M pH 7.2的PBS溶液清洗，清洗3次，用移液器小心吹打洗脱培养皿上形成的生物被膜，制成悬浊液。所得悬浊液高压灭菌30min后分装至离心管中，在12000r/min，4℃条件下离心20min，收集并合并上清液。将上清液用0.22μm的滤菌器过滤，除去菌体杂质等；

[0020] (3)在过滤后的上清液中加入无水乙醇，使其比例为80％(V/V)，4℃静置过夜，6000r/min，4℃离心15min，倾倒上清，无水乙醇小心洗涤沉淀后，用蒸馏水收集，得嗜水气单胞菌生物被膜粗多糖悬液。制备苯酚-硫酸法标准曲线(图1)和考马斯亮蓝法标准曲线(图2)，测定粗提样品中的多糖和蛋白质含量；

[0021] (4)生物被膜多糖中蛋白质的去除：在上述制备的粗多糖悬液中加蛋白酶E，于37℃水浴3h，离心(4000r，5min)取上清，乙醇沉淀，蒸馏水溶解，测定多糖和蛋白质含量，得嗜水气单胞菌生物被膜多糖。

[0022] 实施例2与其它去除蛋白质方法的比较

[0023] (1)Sevage法样品溶液与Sevage试剂(氯仿与正丁醇5：1混合制得)5：1混合，振荡20-30分钟，蛋白质变性不溶于水，位于水层与有机层中间，离心取上清(即水层)，继续相同操作。该方法去除蛋白过程中，脱1次蛋白时蛋白质去除率仅为24.6％，多糖保留率为
87.8％，蛋白质去除率不高，多糖保留率较高。随着脱蛋白次数增加，蛋白质去除率逐步上升，但多糖的保留率却明显下降。脱蛋白6次后，蛋白质去除率可达63.5％，但多糖保留率仅有2.7％。Sevage法多次转移操作会造成多糖的损失，此外还可能因为样品量不够多而使多糖的损耗尤为明显。

[0024] (2)Sevage-酶解法酶解后，样品溶液与Sevage试剂5：1混合，振荡20-30分钟，蛋白质变性不溶于水，位于水层与有机层中间，离心取上清(即水层)。将Sevage法与酶解法联用，Sevage法脱蛋白一次后，蛋白质去除率可从81.6％提升到98.8％，但多糖的保留率从91.2％降至61.2％。

[0025] (3)盐析法在样品溶液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度分别为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，4℃静置过夜，6000r/min离心取上清。实验结果显示，硫酸铵饱和度为50％时，多糖保留率可达94.4％，但蛋白质去除率最高，仅为67.4％。

[0026] 本发明采取的提取嗜水气单胞菌生物被膜多糖的方法，与其他提取方法相比，步骤简单，去除了多糖中的大部分蛋白质，去除率提高了多糖的纯度，可为细菌生物被膜多糖的生物学功能研究提供帮助。