一种发酵法高效制备低苦味抗氧化玉米低聚肽的方法

摘要

本发明公开了一种发酵法高效制备低苦味抗氧化玉米低聚肽的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过发酵培养基组成成分的调整和发酵培养条件的优化，得到低苦味且具有抗氧化生物活性的玉米低聚肽，苦味值低于2.53，低聚肽含量可达17.53g/L，苦味较低且多为分子量较小的低聚肽，易于人体吸收；制备获得的玉米低聚肽产品具有理想的抗氧化特性，对·OH、O2·‑、DPPH·自由基的清除率分别可达96.80％、31.17％和80.57％。本发明的方法工艺简单，肽转化率高，副产物少，制备成本较低，可以提高玉米的附加值，实现对玉米蛋白资源的合理利用。

权利要求

1.一种制备低苦味玉米低聚肽的方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌CICC 20030为发酵微生物，利用含50～90g/L玉米黄粉的原料进行发酵；所述发酵在初始pH 7～9、33～41℃发酵36～48h；所述原料还包括6～10g/L蔗糖、1～5g/LNaCl；

所述玉米黄粉进行脱淀粉处理；所述脱淀粉的步骤包括：将玉米黄粉过100～200目筛，按质量比1:2～3称取过筛物与水混匀，糊化，往糊化后玉米黄粉中添加柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH为5.2～5.8，调节料液比为1：(9～11)，加入淀粉酶酶解，灭酶后将酶解液进行洗涤烘干，得到脱淀粉玉米黄粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将玉米黄粉过筛，与水混匀，于80～90℃糊化0.5～1h，加入淀粉酶酶解，酶解后洗涤烘干，得到脱淀粉玉米黄粉；

(2)将步骤(1)处理后的玉米黄粉与蔗糖、NaCl和水混合，接种枯草芽孢杆菌CICC20030进行发酵；

(3)将步骤(3)的发酵液过滤，将过滤后的上清液进行冷冻干燥，得到玉米肽冻干粉。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶解是在温度57～63℃的条件下酶解

4～6h。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶解是用中温α-淀粉酶进行酶解。

5.权利要求1～4任一所述方法在制备含低苦味抗氧化玉米低聚肽产品中的应用。

6.应用权利要求1～4任一所述方法制备获得的低苦味抗氧化玉米低聚肽。

说明书

一种发酵法高效制备低苦味抗氧化玉米低聚肽的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种发酵法高效制备低苦味抗氧化玉米低聚肽的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

[0002] 我国是世界第二大玉米生产国，年产量达1.45亿吨，其中80％的玉米用于湿法淀粉工业。玉米黄粉是玉米湿法生产淀粉的主要副产物，年产量达80万吨以上。玉米黄粉蛋白含量较高，约为60％，但因其口感粗糙、水溶性差、氨基酸组成不均衡等缺点，在我国玉米黄粉主要被用作动物饲料或自然排放，使其经济效益极低。若能利用玉米黄粉蛋白含量高，富含谷氨酸、脯氨酸以及亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸的优点，以玉米黄粉为原料，制备附加值较高的玉米肽产品，则可大大提升玉米产业的经济效益，使玉米资源的到较为充分的利用。

[0003] 玉米低聚肽是以玉米蛋白为原料，经过水解得到的分子量较小的肽混合物。现代营养学研究表明：与蛋白质和氨基酸相比，低聚肽更容易被机体吸收利用。低聚肽与蛋白质相比，对小肠吸收面积减少，在胃内滞留时间较短，使得胃下垂感和腹部肿胀感频度较低。游离氨基酸的转运吸收主要是依靠Na+泵的主动运输体系，而低聚肽的转运吸收主要是依靠H+或Ca+的浓度差而进行的一种转运体系。与游离氨基酸相比，低聚肽的转运吸收具有耗能低、转运速度快、载体不易饱和、渗透压低等优点。

[0004] 目前制备玉米肽的方法主要有化学法、酶解法和微生物发酵法。化学法包括合成法和酸碱水解法。前者成本高，纯度低、毒性大，目前在我国正处于研发阶段；后者氨基酸损失严重，副物较多，在工业化生产中受到限制。酶解法是制备玉米肽最常用的方法。但酶解法制备玉米肽时，对原料要求较高，酶解玉米蛋白所需的酶制剂价格高昂，且酶解结束后玉米肽常出现严重苦味，而去除玉米肽苦味的程序繁琐且成本较高，这些都限制了酶解法制备玉米肽在发展中国家的应用。微生物发酵法制备玉米肽，是通过发酵过程中微生物分泌的蛋白酶将原料蛋白水解为小分子的肽，是一个微生物产酶和蛋白水解同步进行的过程。在发酵过程中，微生物通过自身的代谢将小肽之间的肽键重排、转接、对某些苦味基团进行修饰、转移和重组。在发酵过程中，小肽氨基酸又经过同化、代谢作用，将玉米蛋白转化为具有生物活性的玉米肽。

[0005] 微生物发酵法是目前生产玉米肽比较先进的方法，但微生物发酵法在制备玉米肽时极易受到发酵条件的影响，若发酵条件控制不当，易出现玉米肽产率较低、苦味较重、玉米肽中低聚肽含量偏低且玉米肽生物活性偏低等现象。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种制备低苦味玉米低聚肽的方法，通过发酵培养基组成成分的调整和发酵培养条件的优化，得到低苦味且具有抗氧化生物活性的玉米低聚肽。此方法制备出的玉米肽苦味较低且多为分子量较小的低聚肽，易于人体吸收。除此之外，此方法工艺简单，肽转化率高，副产物少，制备成本较低，可以提高玉米的附加值，实现对玉米蛋白资源的合理利用。

[0007] 本发明的第一个目的是提供一种制备低苦味玉米低聚肽的方法，所述方法是以枯草芽孢杆菌为发酵微生物，以含玉米黄粉的原料进行发酵。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CICC20030，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述玉米黄粉按如下方法制备：将玉米黄粉过100～200目筛，按质量比1:2～3称取过筛物与水混匀，于90℃水浴锅中糊化1h；调节pH为6～11，调节料液比，加入淀粉酶酶解，酶解结束后灭酶，将酶解液进行洗涤烘干，得到脱淀粉玉米黄粉。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

[0011] (1)将玉米黄粉过筛，与水混匀，于80～90℃糊化0.5～1h，加入淀粉酶酶解，酶解后洗涤烘干，得到脱淀粉玉米黄粉；

[0012] (2)将步骤(1)处理后的玉米黄粉与蔗糖、NaCl和水混合，接种枯草芽孢杆菌CICC20030进行发酵；

[0013] (3)将步骤(3)的发酵液过滤，将过滤后的上清液进行冷冻干燥，得到玉米肽冻干粉。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：

[0015] (1)将枯草芽孢杆菌CICC20030于35～37℃培养16～18h，制备枯草芽孢杆菌CICC20030种子液；

[0016] (2)将玉米黄粉过100～200目筛，按质量比1:2称取过筛物与水混匀，于90℃水浴锅中糊化1h；调节pH为6～11，调节料液比，加入淀粉酶酶解，酶解结束后灭酶，将酶解液进行洗涤烘干，得到脱淀粉玉米黄粉；

[0017] (3)将脱淀粉处理后的玉米黄粉与蔗糖、NaCl和去离子水混合配制成液态发酵培养基；在液态发酵培养基内接入对数生长期的枯草芽孢杆菌CICC20030种子液进行发酵；

[0018] (4)将发酵结束后的发酵培养基进行离心分离，去除玉米黄粉残渣和菌体沉淀，得到透明澄清的发酵上清液。

[0019] 在本发明的一种实施方式中，将所述步骤(4)的发酵上清液进行冷冻干燥。

[0020] 在本发明的一种实施方式中，冷冻干燥时间为36～48h，温度为-80℃，得到玉米肽冻干粉。

[0021] 在本发明的一种实施方式中，以柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH和/或料液比。

[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述淀粉酶是中温ɑ-淀粉酶，酶解底物为玉米黄粉，4
购自江苏锐阳生物科技有限公司，酶活力为1×10U/g。

[0023] 本发明的一种实施方式中，所述的中温ɑ-淀粉酶酶解体系pH为5.2～5.8。

[0024] 本发明的一种实施方式中，所述的中温ɑ-淀粉酶酶解温度为57～63℃。

[0025] 本发明的一种实施方式中，所述的中温ɑ-淀粉酶添加量为165～285U/g玉米黄粉。

[0026] 本发明的一种实施方式中，所述的中温ɑ-淀粉酶酶解体系料液比为1:9～1:11。

[0027] 本发明的一种实施中，所述的中温ɑ-淀粉酶酶解时间为4～6h。

[0028] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基成分中，玉米黄粉的添加量为10～90g/L。

[0029] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基成分中，玉米黄粉的添加量为50～90g/L。

[0030] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基成分中，蔗糖添加量2～10g/L。

[0031] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基成分中，蔗糖添加量6～10g/L。

[0032] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基成分中，NaCl添加量1～7g/L。

[0033] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养基成分中，NaCl添加量1～5g/L。

[0034] 本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中发酵培养时间为24～84h。

[0035] 本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中发酵培养时间为36～48h。

[0036] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养条件发酵初始pH为6～11。

[0037] 本发明的一种实施方式中，所述的发酵培养条件接种量2％～10％。

[0038] 本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中发酵温度为29～45℃。

[0039] 本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中发酵温度为37～41℃。

[0040] 本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中摇床转速140～260r/min。

[0041] 本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中摇床转速180～220r/min。

[0042] 本发明的第二个目的是提供应用上述任一所述方法制备获得的低苦味抗氧化玉米低聚肽。

[0043] 本发明还要求保护任一所述方法在制备含低苦味抗氧化玉米低聚肽产品中的应用。

[0044] 有益效果：本发明通过发酵培养基组成成分的调整和发酵培养条件的优化，得到低苦味且具有抗氧化生物活性的玉米低聚肽，苦味值低于2.53，低聚肽含量可达17.53 g/L，制备获得的玉米低聚肽产品具有理想的抗氧化特性，对·OH、O2·-、DPPH·自由基的清除率分别可达96.80％、31.17％和80.57％。

附图说明

[0045] 图1为发酵法制备低苦味抗氧化玉米低聚肽的流程图。

[0046] 图2为不同玉米黄粉添加量下的发酵效果。

[0047] 图3为不同蔗糖添加量下的发酵效果。

[0048] 图4为不同NaCl添加量下的发酵效果。

[0049] 图5为不同发酵时间下的发酵效果。

[0050] 图6为不同发酵pH下的发酵效果。

[0051] 图7为不同接种量下的发酵效果。

[0052] 图8为不同发酵温度下的发酵效果。

[0053] 图9为不同发酵转速下的发酵效果。

具体实施方式

[0054] (1)淀粉含量的测定：采用硫酸蒽酮比色法进行淀粉含量测定。

[0055] (2)可溶性肽含量的测定：考马斯亮蓝显色法。在经典考马斯亮蓝显色法的基础上稍作改进，具体方法如下：

[0056] 绘制标准曲线：取9支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 ml 1 g/L的标准蛋白溶液，补水至2 ml。另取9支试管，分别加入0.1 ml以上溶液，然后各加入5 ml考马斯亮蓝试剂，充分振荡混合，2 min后于波长595 nm，以0号管为空白，测定各管的吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

[0057] 样品测定：吸取样品0.1 ml于试管中，加入5ml考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置2 min，以试剂空白为对照，波长595 nm下比色，测吸光度。从标准曲线上查出相应的肽含量(mg/ml)。

[0058] 式(1)

[0059] 式(2)

[0060] 式(1)中：

[0061] m—样品吸光度从标准曲线上查得的肽质量(g/L)；

[0062] V—样品总的体积；

[0063] 0.1—吸取样品体积(mL)；

[0064] n—样品的稀释倍数。

[0065] (3)肽分子量分布测定：取发酵液在10000r/min的转速下离心10min，取发酵上清肽液，采用HPLC法对发酵上清肽液进行分子量分布的检测。

[0066] (4)苦味值检测：采用日本INSENT公司的味觉分析系统(型号：TS-5000Z)进行检测，该设备使用具有广域选择特异性的人工脂膜传感器，模拟生物活体的味觉感受机理，通过检测各种味物质和人工脂膜之间的静电作用或疏水性相互作用产生的膜电势的变化，实现对苦味的评价，无需借助任何统计分析和建模。

[0067] (5)抗氧化活性检测：主要检测·OH、O2·-、DPPH·的清除能力。

[0068] ·OH清除能力检测：样品组试管中依次加入PBS缓冲液(pH7.4，0.4mol/L)、邻菲罗啉溶液(2.5mmol/L)、样品溶液、硫酸亚铁溶液(2.5mmol/L)、各1ml，H202溶液(20mmol/L,1％，v/v)0.5ml；空白组中用1ml超纯水代替样品溶液；对照组中用1.5ml超纯水代替样品溶液和H202溶液。反应在37℃恒温水浴锅中进行，准确反应1h后，快速记录536nm处的吸光度。
按式(1)计算样品对·OH的清除率：

[0069] ·OH清除率＝[1-(A2-A1)/A0]×100％  (1)

[0070] 式中，A1空白组吸光度；A2值样品组吸光度值；A0对照组吸光度值。

[0071] O2·-清除能力测定：将1ml样品与1.8ml 50mmol/L的Tris－HCl缓冲液(pH8.2)混合均匀,混合液于25℃下保温10min，然后加入0.1ml 10mmol/L的邻苯三酚溶液(邻苯三酚用10mmol/L的HCl溶解，于320nm测定吸光度值，于0、4min记录数值。空白对照用1ml超纯水代替样品。按式(2)计算样品对O2·-的清除率：

[0072] O2·-清除率＝[(△A0-△A1)/△A0]×100％  (2)

[0073] 式中，△A0：空白组吸光度变化值；△A1：样品组吸光度变化值。

[0074] DPPH·清除能力测定：用95％乙醇新鲜配制质量分数为0.02％的DPPH溶液，取1.5ml 2mg/ml的玉米肽，加入0.675ml新鲜配制的DPPH溶液和1.5ml 95％的乙醇溶液，震荡混匀。室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。空白组中用1.5ml超纯水代·
替1.5ml样品溶液。按式(3)计算样品对DPPH 的清除率：

[0075] DPPH·清除率＝[(A0-A1)/A0]×100％  (3)

[0076] 式中，A0：空白组吸光度值；A1：样品组吸光度值。

[0077] 实施例1

[0078] (1)种子液的制备：用接种环蘸取甘油管保藏的枯草芽孢杆菌CICC 20030一环，在固态琼脂培养基平板上划线后，37℃培养箱内培养24h。从平板上挑取单菌落接入装有30ml液体种子培养基的摇瓶中，摇床震荡培养18h，作为发酵玉米黄粉的种子液，备用。

[0079] (2)原料的预处理：将玉米黄粉过100目筛，按质量比1:2称取过筛后的玉米黄粉与水混匀，于90℃水浴锅中糊化1h。往糊化后玉米黄粉中添加柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH为5.2，料液比为1:9，再添加165U/g玉米黄粉的中温ɑ-淀粉酶酶解，于57℃酶解4h后灭酶，对酶解液进行洗涤，并在60℃烘箱中进行烘干，得到脱淀粉玉米黄粉。

[0080] (3)发酵培养基组分及发酵培养条件的优化：将预处理后的玉米黄粉与蔗糖、NaCl和去离子水混合配制成液态发酵培养基，发酵培养基的组成为玉米黄粉添加量70g/L、蔗糖添加量8g/L、NaCl添加量1g/L。在液态发酵培养基内按6％的体积计接入对数生长期的枯草芽孢杆菌种子液，于37℃，220r/min发酵30h、用0.5mol/L NaOH溶液调节发酵初始pH为7。

[0081] (4)离心分离：将发酵结束后的发酵培养基进行离心分离，去除玉米黄粉残渣和菌体沉淀，得到透明澄清的发酵上清液。

[0082] (5)真空冷冻干燥：将透明澄清的发酵上清液经真空冷冻干燥机在-60～-80℃进行冷冻干燥，时间为48h，得到玉米肽冻干粉。

[0083] 用考马斯亮蓝显色法对发酵上清液中的可溶性肽进行检测，根据检测结果得出可溶性肽含量为5.66g/L。采用HPLC法对发酵上清肽液进行分子量分布检测，分子量主要集中于1000Da以下，1000Da以下的肽占肽总含量的85％，即此时由2～10个氨基酸组成的低聚肽含量为4.81g/L。

[0084] 将玉米肽冻干粉配制成28g/L的肽溶液，采用电子舌技术对发酵上清肽液进行苦味值的测定，以市售植物蛋白肽和玉米低聚肽为参比物，苦味值检测结果为2.90，与市售植物蛋白肽的苦味值5.55和市售玉米低聚肽的苦味值21.02相比苦味值明显较低。

[0085] 将玉米肽冻干粉配制成2g/L的肽溶液，通过对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率检测发酵上清液中玉米肽的抗氧化能力，以市售植物蛋白肽和玉米低聚肽为参比物。其中，发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为93.24％、19.59％和64.90％；相比于市售植物蛋白肽88.25％、17.97％、1.39％和市售玉米低聚肽88.71％、15％、19.79％，本发明中发酵上清液中的玉米肽在抗氧化能力上具有明显的优势。

[0086] 实施例2

[0087] 实施方式同实施例1，其区别在于，玉米黄粉添加量分别调整为10、30、50、70、90g/L，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图2)，玉米黄粉添加量为50～90g/L时，总肽含量达1.64～1.71g/L，低聚肽含量达1.21～1.30g/L，苦味值为3.83～3.74；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达84.21％以上；对O2·-自由基的清除率达13.15％以·上，对DPPH 自由基的清除率达55.53％以上。其中，玉米黄粉浓度为9％时，总肽含量为
1.79g/L，低聚肽含量为1.38g/L，苦味值为3.74；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为89.20％、17.28％和60.09％。

[0088] 实施例3

[0089] 实施方式同实施例1，其区别在于，蔗糖添加量分别调整为2、4、6、8、10g/L及不添加，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图3)，蔗糖添加量为6～10g/L时，总肽含量达3.36～4.80g/L，低聚肽含量达2.77～4.13g/L，苦味值为3.10～3.34；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达87.15％以上；对O2·-自由基的清除率达14.40％以上，对DPPH·自由基的清除率达56.18％以上。其中，蔗糖浓度为8g/L时，总肽含量为4.80g/L，低聚
2·- ·
肽含量为4.13g/L，苦味值为3.10；对·OH、O 、DPPH 三种自由基的清除率分别为91.92％、
18.09％和60.09％。

[0090] 实施例4

[0091] 实施方式同实施例1，其区别在于，NaCl添加量分别调整为1、3、5、7g/L及不添加，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图4)，NaCl添加量为1～5g/L时，总肽含量达5.23～5.66g/L，低聚肽含量达3.40～4.81g/L，苦味值为2.83～2.90；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达87.38％以上；对O2·-自由基的清除率达15.55％以上，对DPPH·自由基的清除率达52.80％以上。其中，NaCl浓度为1g/L时，总肽含量为5.66g/L，低聚肽含量为4.81g/L，苦味值为2.90；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为93.24％、19.59％和64.90％。

[0092] 实施例5

[0093] 实施方式同实施例1，其区别在于，发酵时间分别调整为24、36、48、60、72、84h，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图5)，发酵时间为24～48时，总肽含量达4.67～10.51g/L，低聚肽含量达2.66～7.90g/L，苦味值为2.80～
3.00；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达75.10％以上；对O2·-自由基的清除率达9.88％以上，对DPPH·自由基的清除率达39.45％以上。其中，发酵时间为36h时，总肽含量为10.51g/L，低聚肽含量为
8.93g/L，苦味值为2.85；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为91.70％、20.17％和65.57％。

[0094] 实施例6

[0095] 实施方式同实施例1，其区别在于，发酵pH分别调整为6、7、8、9、10、11h，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图6)，发酵pH为7～9时，总肽含量达10.51～14.23g/L，低聚肽含量达8.93～12.38g/L，苦味值为2.85～3.29；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由2·- ·
基的清除率达83.4％以上；对O 自由基的清除率达18.85％以上，对DPPH 自由基的清除率达65.18％以上。其中，发酵pH为8时，总肽含量为14.23g/L，低聚肽含量为12.38g/L，苦味值为2.90；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为91.83％、22.10％和69.90％。

[0096] 实施例7

[0097] 实施方式同实施例1，其区别在于，接种量分别调整为2％、4％、6％、8％、10％，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图7)，接种量为4～6％时，总肽含量达14.23～15.47g/L，低聚肽含量达11.38～13.15g/L，苦味值为2.66～
2.90；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达91.83％以上；对O2·-自由基的清除率达22.10％以上，对DPPH·自由基的清除率达69.90％以上。其中，接种量为4％时，总肽含量为15.47g/L，低聚肽含量为
13.15g/L，苦味值为2.66；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为92.80％、24.17％和72.57％。

[0098] 实施例8

[0099] 实施方式同实施例1，其区别在于，发酵温度分别调整为29℃、33℃、37℃、41℃、45℃，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图8)，发酵温度为33～41℃时，总肽含量达13.19～15.47g/L，低聚肽含量达9.89～13.15g/L，苦味值为2.65～3.20；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达82.8％以上；对O2·-自由基的清除率达18.45％以上，对·
DPPH 自由基的清除率达67.18％以上。其中，发酵温度为41℃时，总肽含量为15.47g/L，低聚肽含量为13.15g/L，苦味值为2.66；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为
92.80％、24.17％和72.57％。

[0100] 实施例9

[0101] 实施方式同实施例1，其区别在于，发酵转速分别调整为140、180、220、240、260r/min，对发酵上清液中的总肽含量、低聚肽含量和苦味值进行测定，结果显示(如图9)，发酵转速为180～220r/min时，总肽含量达15.47～17.53g/L，低聚肽含量达13.15～15.60g/L，苦味值为2.55～2.66；对发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率进行测定，结果显示，对·OH自由基的清除率达92.80％以上；对O2·-自由基的清除率达24.17％以上，对DPPH·自由基的清除率达72.57％以上。其中，发酵转速为180r/min时，总肽含量为17.53g/L，低聚肽含量为15.60g/L，苦味值为2.55；对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为96.80％、31.17％和80.57％。

[0102] 实施例10

[0103] 实施方式同实施例1，其区别在于，发酵培养条件变为：发酵培养时间36h、发酵初始pH为8、接种量6％、发酵温度37℃、摇床转速220r/min。

[0104] 用考马斯亮蓝显色法对发酵上清液中的可溶性肽进行检测，根据检测结果得出可溶性肽含量为14.23g/L。采用HPLC法对发酵上清肽液进行分子量分布检测，分子量主要集中于1000Da以下，占总含量的87％，此时低聚肽含量为12.38g/L。

[0105] 将玉米肽冻干粉配制成28g/L的肽溶液，采用电子舌技术对发酵上清肽液进行苦味值的测定，以市售植物蛋白肽和玉米低聚肽为参比物，苦味值检测结果为2.90，与市售植物蛋白肽的苦味值5.55和市售玉米低聚肽的苦味值21.02相比苦味值明显较低。

[0106] 将玉米肽冻干粉配制成2g/L的肽溶液，通过对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率检测发酵上清液中玉米肽的抗氧化能力，以市售植物蛋白肽和玉米低聚肽为参比物。其中，发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为91.83％、22.10％和69.90％；相比于市售植物蛋白肽88.25％、17.97％、1.39％和玉米低聚肽88.71％、15％、19.79％，本发明中发酵上清液中的玉米肽在抗氧化能力上具有明显的优势。

[0107] 实施例11

[0108] 实施方式同实施例1，其区别在于，发酵培养条件变为：发酵培养时间36h、发酵初始pH为8、接种量4％、发酵温度37℃、摇床转速180r/min。

[0109] 用考马斯亮蓝显色法对发酵上清液中的可溶性肽进行检测，根据检测结果得出可溶性肽含量为17.53g/L。采用HPLC法对发酵上清肽液进行分子量分布检测，分子量主要集中于1000Da以下，占总含量的89％，此时低聚肽含量为15.60g/L。

[0110] 将玉米肽冻干粉配制成28g/L的肽溶液，采用电子舌技术对发酵上清肽液进行苦味值的测定，以市售植物蛋白肽和玉米低聚肽为参比物，苦味值检测结果分别为2.53、0.95、4.19，与市售植物蛋白肽的苦味值5.55和市售玉米低聚肽的苦味值21.02相比苦味值明显较低。

[0111] 将玉米肽冻干粉配制成2g/L的肽溶液，通过对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率检测发酵上清液中玉米肽的抗氧化能力，以市售植物蛋白肽和玉米低聚肽为参比物。其中，发酵上清液中玉米肽对·OH、O2·-、DPPH·三种自由基的清除率分别为26.93％、76.83％和7.91％；相比于市售植物蛋白肽96.80％、31.17％、80.57％和玉米低聚肽88.71％、15％、19.79％，本发明中发酵上清液中的玉米肽在抗氧化能力上具有明显的优势。

[0112] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。