用于检测和定量代谢物的质谱方法转让专利
申请号 : CN201780047345.4
文献号 : CN109564207B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : L·福特 , Q·张 , K·P·亚当
申请人 : 梅塔博隆股份有限公司
摘要 :
本发明描述了通过质谱测定样品中一种或多种分析物的量的方法。一种或多种分析物选自α‑羟基丁酸(2‑HB)、亚油酰基LPC(LGPC)、油酸、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、泛酸和丝氨酸。该方法包括a)在适于从一种或多种分析物中的每一种产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下使样品经受离子化源，其中分析物在离子化之前未经衍生化；b)通过串联质谱测量来自一种或多种分析物中的每一种的一种或多种离子的量；c)使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种的量。
权利要求 :
1.用于通过质谱测定样品中的两种或更多种分析物的量的试剂在制备用于测定两种或更多种分析物的试剂盒中的用途，所述分析物选自α‑羟基丁酸(2‑HB)、亚油酰基LPC(LGPC)、油酸、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、泛酸和丝氨酸，所述测定包括：
a)在适于从所述两种或更多种分析物中的每一种产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下使样品经受离子化源，其中所述分析物在离子化之前未经衍生化；
b)通过质谱测量来自所述两种或更多种分析物中的每一种的一种或多种离子的量；和c)使用所述一种或多种离子的测量的量来确定所述样品中所述两种或更多种分析物中的每一种的量；
其中所述两种或更多种分析物中的至少一种选自2‑HB、LGPC、3‑HB、4‑MOP和油酸，并且所述两种或更多种分析物中的第二种选自丝氨酸和泛酸；和其中所述两种或更多种分析物的量在单次注射中测定，并且其中质谱仪以负模式操作。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述两种或更多种分析物包含2‑HB和泛酸。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述两种或更多种分析物包含2‑HB和丝氨酸。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述两种或更多种分析物包含LGPC和泛酸。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述两种或更多种分析物包含LGPC和丝氨酸。
6.根据权利要求1所述的用途，其中测定三种或更多种分析物的量。
7.根据权利要求1所述的用途，其中测定四种或更多种分析物的量。
8.根据权利要求1所述的用途，其中测定五种或更多种分析物的量。
9.根据权利要求1所述的用途，其中测定六种或更多种分析物的量。
10.根据权利要求1所述的用途，其中测定α‑羟基丁酸(2‑HB、AHB)、亚油酰基LPC(LGPC)、油酸、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、泛酸和丝氨酸的量。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品在经受离子化源之前通过液相色谱纯化。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述液相色谱选自高效液相色谱、超高效液相色谱和湍流液相色谱。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品在经受离子化源之前通过高效液相色谱或超高效液相色谱纯化。
14.根据权利要求1所述的用途，其中使用内标来测定所述样品中的两种或更多种分析物的量。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述内标包含待测量的两种或更多种分析物中的至少一种的同位素标记的类似物。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品包括生物样品。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述样品选自血液、血浆和血清。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述两种或更多种分析物中的至少一种选自2‑HB和LGPC，并且所述两种或更多种分析物中的第二种选自丝氨酸和泛酸。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述两种或更多种分析物中的一种是2‑HB，并且所述两种或更多种分析物中的第二种选自泛酸和丝氨酸。
20.根据权利要求18所述的用途，其中所述两种或更多种分析物中的一种是LGPC，并且所述两种或更多种分析物中的第二种选自泛酸和丝氨酸。
21.根据权利要求1所述的用途，其中运行时间小于3分钟。
说明书 :
用于检测和定量代谢物的质谱方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2016年6月2日提交的美国临时专利申请号62/344,613的权益，其全部内容通过引用并入本文。
[0003] 背景
[0004] 提供描述本发明的背景的以下信息以帮助理解本发明，并且不承认其构成或描述本发明的现有技术。
[0005] 前驱糖尿病与肥胖和高热量饮食有关。前驱糖尿病可能会发展为2型糖尿病，但如果早期发现，能够通过改变生活方式和适当的营养管理来延迟或防止进展。因此，前驱糖尿
病的早期诊断和监测对于减少2型糖尿病的流行至关重要。临床上使用一种或多种基于血
糖的标准(包括空腹血糖(FPG)、血红蛋白A1c和来自口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时血
浆葡萄糖测量的水平)来定义前驱糖尿病。然而，这些标准仅鉴别部分重叠的受试者组，并
且可能反映导致2型糖尿病的不同病理生理状态。基于代谢物的测试可用于帮助诊断和评
估与前驱糖尿病和2型糖尿病相关的代谢紊乱，包括测定胰岛素抵抗(IR)和糖耐量减低
(IGT)。为了更准确和更早地诊断前驱糖尿病状态诸如胰岛素抵抗(IR)和糖耐量减低
(IGT)，已经鉴定了新的代谢物生物标志物。具体地，在基于血液的样品中(例如在血浆或血
清中)测量的七种代谢物生物标志物(2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧
代戊酸(4‑MOP)，1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸
(Pantothenate)和丝氨酸)已被证明是用于血糖代谢障碍和前驱糖尿病的有用生物标志
物。一种或多种代谢物生物标志物的量可对诊断和监测前驱糖尿病以及将受试者分类为具
有糖耐量减低(IGT)和/或胰岛素抵抗(IR)提供信息。使用在基于血液的样品中测量的糖尿
病前期生物标志物的量，可将个体诊断为患有前驱糖尿病或与前驱糖尿病相关的疾病。另
外，可以通过跟踪前驱糖尿病生物标志物的测量水平来监测患有前驱糖尿病或前驱糖尿病
相关病症的个体。
病的早期诊断和监测对于减少2型糖尿病的流行至关重要。临床上使用一种或多种基于血
糖的标准(包括空腹血糖(FPG)、血红蛋白A1c和来自口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时血
浆葡萄糖测量的水平)来定义前驱糖尿病。然而，这些标准仅鉴别部分重叠的受试者组，并
且可能反映导致2型糖尿病的不同病理生理状态。基于代谢物的测试可用于帮助诊断和评
估与前驱糖尿病和2型糖尿病相关的代谢紊乱，包括测定胰岛素抵抗(IR)和糖耐量减低
(IGT)。为了更准确和更早地诊断前驱糖尿病状态诸如胰岛素抵抗(IR)和糖耐量减低
(IGT)，已经鉴定了新的代谢物生物标志物。具体地，在基于血液的样品中(例如在血浆或血
清中)测量的七种代谢物生物标志物(2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧
代戊酸(4‑MOP)，1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸
(Pantothenate)和丝氨酸)已被证明是用于血糖代谢障碍和前驱糖尿病的有用生物标志
物。一种或多种代谢物生物标志物的量可对诊断和监测前驱糖尿病以及将受试者分类为具
有糖耐量减低(IGT)和/或胰岛素抵抗(IR)提供信息。使用在基于血液的样品中测量的糖尿
病前期生物标志物的量，可将个体诊断为患有前驱糖尿病或与前驱糖尿病相关的疾病。另
外，可以通过跟踪前驱糖尿病生物标志物的测量水平来监测患有前驱糖尿病或前驱糖尿病
相关病症的个体。
[0006] 本文描述了用于检测和定量生物样品中多达七种分析物的方法。该七种分析物可包括2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)，1‑亚油酰基‑2‑
羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸和丝氨酸。有利地，代谢物测定需要小的样品
大小并且能够使用质谱分析方法进行。该方法可用于筛选和鉴定可能患有前驱糖尿病但可
能是无症状的和/或具有正常的FPG和血红蛋白A1c结果的患者。
羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸和丝氨酸。有利地，代谢物测定需要小的样品
大小并且能够使用质谱分析方法进行。该方法可用于筛选和鉴定可能患有前驱糖尿病但可
能是无症状的和/或具有正常的FPG和血红蛋白A1c结果的患者。
[0007] 本文描述的用于定量分析物的方法比现有方法更有效。使用现有方法，需要至少两次单独的注射来测量所有七种分析物。每次注射的运行时间超过两分钟。此外，如果在同
一仪器上依次进行注射，则测量更多分析物需要额外的仪器和/或额外的运行时间。本文所
述的方法允许在单次样品注射中测量两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或
更多种、六种或更多种或七种分析物(理解为在单个仪器上进行单次注射)并且总运行时间
少于4分钟。
一仪器上依次进行注射，则测量更多分析物需要额外的仪器和/或额外的运行时间。本文所
述的方法允许在单次样品注射中测量两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或
更多种、六种或更多种或七种分析物(理解为在单个仪器上进行单次注射)并且总运行时间
少于4分钟。
[0008] 概述
[0009] 在本发明的第一方面，方法包括通过质谱检测和测定样品中选自2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷
酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种分析物的量。在检测多种分析物的量的方
法中，在单次样品注射中检测多种分析物的量。还提供了从生物样品中提取分析物并在通
过质谱检测之前色谱分离分析物的方法。
酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种分析物的量。在检测多种分析物的量的方
法中，在单次样品注射中检测多种分析物的量。还提供了从生物样品中提取分析物并在通
过质谱检测之前色谱分离分析物的方法。
[0010] 在其中一种或多种分析物包括2‑HB的实施方案中，来自2‑HB的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约103.1±0.5、57.1±0.5、35.0±0.5、
44.9±0.5、55.0±0.5或84.9±0.5的离子。
44.9±0.5、55.0±0.5或84.9±0.5的离子。
[0011] 在其中一种或多种分析物包括LGPC的实施方案中，来自LGPC的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约554.3±0.5、279.2±0.5、34.9±
0.5、79.0±0.5、153.0±0.5、167.9±0.5、224.1±0.5、242.0±0.5或504.4±0.5的离子。
0.5、79.0±0.5、153.0±0.5、167.9±0.5、224.1±0.5、242.0±0.5或504.4±0.5的离子。
[0012] 在其中一种或多种分析物包括3‑HB的实施方案中，来自3‑HB的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约103.1±0.5、59.1±0.5或41.1±0.5
的离子。
的离子。
[0013] 在其中一种或多种分析物包括4‑MOP的实施方案中，来自4‑MOP的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约129.0±0.5或85.1±0.5的离子。
[0014] 在其中一种或多种分析物包括油酸的实施方案中，来自油酸的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约281.3±0.5、44.7±0.5、61.8±0.5、
79.8±0.5、143.1±0.5、183.0±0.5、194.9±0.5、206.9±0.5、209.0±0.5、210.1±0.5、
223.1±0.5、237.1±0.5或251.1±0.5的离子。
79.8±0.5、143.1±0.5、183.0±0.5、194.9±0.5、206.9±0.5、209.0±0.5、210.1±0.5、
223.1±0.5、237.1±0.5或251.1±0.5的离子。
[0015] 在其中一种或多种分析物包括泛酸的实施方案中，来自泛酸的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约218.1±0.5、88.0±0.5、42.0±0.5、
44.0±0.5、45.1±0.5、59.0±0.5、71.0±0.5、72.0±0.5、88.1±0.5、98.9±0.5、100.9±
0.5、116.0±0.5、129.1±0.5或146.0±0.5的离子。
44.0±0.5、45.1±0.5、59.0±0.5、71.0±0.5、72.0±0.5、88.1±0.5、98.9±0.5、100.9±
0.5、116.0±0.5、129.1±0.5或146.0±0.5的离子。
[0016] 在其中一种或多种分析物包括丝氨酸的实施方案中，来自丝氨酸的一种或多种离子可包括这样的一种或多种离子，其包含质荷比(m/z)为约104.0±0.5、74.0±0.5、40.1±
0.5、42.0±0.5、45.0±0.5、56.0±0.5或58.1±0.5的离子。
0.5、42.0±0.5、45.0±0.5、56.0±0.5或58.1±0.5的离子。
[0017] 在一个实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中多种分析物的量，例如，两种或更多种分析物、三种或更多种分析物、四种或更多种分析物、五种或更多种
分析物、六种或更多种分析物或七种分析物的量，所述分析物选自2‑羟基丁酸(2‑HB或
AHB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷
酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸和丝氨酸。表10(其位于下文(在实施例之后))列出了的7种分析
物的可能组合。在一些相关实施方案中，该方法还包括测定一种分析物与另一种分析物的
水平的比。
分析物、六种或更多种分析物或七种分析物的量，所述分析物选自2‑羟基丁酸(2‑HB或
AHB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷
酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸和丝氨酸。表10(其位于下文(在实施例之后))列出了的7种分析
物的可能组合。在一些相关实施方案中，该方法还包括测定一种分析物与另一种分析物的
水平的比。
[0018] 在一个实施方案中，测定两种或更多种分析物的量，并且两种或更多种分析物中的至少一种选自2‑HB和LGPC。
[0019] 在另一个实施方案中，两种或更多种分析物中的一种是2‑HB，并且两种或更多种分析物中的第二种选自LGPC、3‑HB、4‑MOP、油酸、泛酸和丝氨酸。
[0020] 在另一个实施方案中，两种或更多种分析物中的一种是LGPC，并且两种或更多种分析物中的第二种选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、油酸、泛酸和丝氨酸。
[0021] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中2‑HB和LGPC的量。在进一步的示例性实施方案中，该方法还包括使用单次注射通过质谱测定样品
中选自3‑HB、4‑MOP、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。该方法包括测定
分析物2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑
2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸盐和丝氨酸中的任何一种(单独的或以任
何组合，包括2种分析物、3种分析物、4种分析物、5种分析物、6种分析物和7种分析物)的量。
中选自3‑HB、4‑MOP、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。该方法包括测定
分析物2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑
2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸盐和丝氨酸中的任何一种(单独的或以任
何组合，包括2种分析物、3种分析物、4种分析物、5种分析物、6种分析物和7种分析物)的量。
[0022] 在一个实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物2‑HB和油酸的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选自3‑HB、
4‑MOP、LGPC、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
4‑MOP、LGPC、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0023] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物2‑HB和3‑HB的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选
自LGPC、4‑MOP、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
自LGPC、4‑MOP、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0024] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物2‑HB和4‑MOP的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选
自3‑HB、LGPC、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
自3‑HB、LGPC、油酸、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0025] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物2‑HB和泛酸的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选
自3‑HB、4‑MOP、油酸、LGPC和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
自3‑HB、4‑MOP、油酸、LGPC和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0026] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物2‑HB和丝氨酸的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中
选自3‑HB、4‑MOP、油酸、泛酸和LGPC的一种或多种另外的分析物的量。
选自3‑HB、4‑MOP、油酸、泛酸和LGPC的一种或多种另外的分析物的量。
[0027] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中分析物LGPC和油酸的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选自
3‑HB、4‑MOP、2‑HB、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
3‑HB、4‑MOP、2‑HB、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0028] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中分析物LGPC和3‑HB的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选自
油酸、4‑MOP、2‑HB、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
油酸、4‑MOP、2‑HB、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0029] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物LGPC和4‑MOP的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选
自3‑HB、油酸、2‑HB、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
自3‑HB、油酸、2‑HB、泛酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0030] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物LGPC和泛酸的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中选
自3‑HB、4‑MOP、2‑HB、油酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
自3‑HB、4‑MOP、2‑HB、油酸和丝氨酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0031] 在一个示例性实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中的分析物LGPC和丝氨酸的量。在一些实施方案中，该方法包括使用单次注射通过质谱测定样品中
选自3‑HB、4‑MOP、2‑HB、泛酸和油酸的一种或多种另外的分析物的量。
选自3‑HB、4‑MOP、2‑HB、泛酸和油酸的一种或多种另外的分析物的量。
[0032] 在一个实施方案中，该方法包括使用分离步骤随后MS检测在单次注射中测量具有极性差异的多种分析物的量。例如，丝氨酸的极性与2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸不同。亚
微米UPLC柱和反相色谱条件可用于在单次注射中测量与选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油
酸的一种或多种分析物组合的丝氨酸的量。在另一个实例中，泛酸的极性与2‑HB、3‑HB、4‑
MOP、LGPC和油酸不同。亚微米UPLC柱和反相色谱条件可用于在单次注射中测量与选自2‑
HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸的一种或多种分析物组合的泛酸的量。
微米UPLC柱和反相色谱条件可用于在单次注射中测量与选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油
酸的一种或多种分析物组合的丝氨酸的量。在另一个实例中，泛酸的极性与2‑HB、3‑HB、4‑
MOP、LGPC和油酸不同。亚微米UPLC柱和反相色谱条件可用于在单次注射中测量与选自2‑
HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸的一种或多种分析物组合的泛酸的量。
[0033] 在实施方案中，样品可以是血浆样品或血清样品。可以使用EDTA‑血浆管或肝素锂血浆管收集样品。样品体积可以是10μl至200μl。例如，样品体积可以是10μl、15、20、25、30、
40、50μl、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μl或10至200μl之间的任何其他体积。
40、50μl、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μl或10至200μl之间的任何其他体积。
[0034] 在一些实施方案中，该方法包括测量多种分析物，同时还获得关键对4‑MOP和3‑MOP的分离(参见图8A，分别为1.09和1.04分钟的保留时间)。
[0035] 在一个实施方案中，该方法运行时间小于3分钟。例如，该方法运行时间约为2分钟。在另一个实例中，该方法运行时间约为2.21分钟。
[0036] 在实施方案中，在样品中提供一种或多种可单独检测的内标，还测定其在样品中的量。在这些实施方案中，样品中存在的选自2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲
基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸、丝
氨酸的一种或多种内源性分析物的全部或一部分和一种或多种内标被离子化以产生可在
质谱仪中检测的多种离子。在一些实施方案中，通过与一种或多种内标比较，从感兴趣的分
析物产生的离子的量可以与样品中感兴趣的分析物的量的存在相关。
基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(LGPC)、油酸、泛酸、丝
氨酸的一种或多种内源性分析物的全部或一部分和一种或多种内标被离子化以产生可在
质谱仪中检测的多种离子。在一些实施方案中，通过与一种或多种内标比较，从感兴趣的分
析物产生的离子的量可以与样品中感兴趣的分析物的量的存在相关。
[0037] 在一些实施方案中，样品中分析物的量可以通过比较通过质谱检测的一种或多种分析物离子的量与通过质谱在外部参考标准物中检测的一种或多种标准离子的量来确定。
示例性外部参考标准物可包括掺入已知量的一种或多种上述内标和/或目标分析物的空白
血浆或血清。
示例性外部参考标准物可包括掺入已知量的一种或多种上述内标和/或目标分析物的空白
血浆或血清。
[0038] 在一些实施方案中，反荷离子可用于实现用于MS分析的所需离子化状态。例如，反荷离子可用于改变用于负离子化模式中的MS分析的LGPC的离子化极性。示例性的反荷离子
可包括氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、溴化铵、硫酸铵或硝酸铵。另外，也可以使用替代的反荷离
子。
可包括氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、溴化铵、硫酸铵或硝酸铵。另外，也可以使用替代的反荷离
子。
[0039] 在一些实施方案中，可以通过在MS仪器上实施极性开关在正多重反应监测(MRM)模式下测量LGPC。
[0040] 在一些实施方案中，流动相A中甲酸的浓度可以为0.001％至0.1％。
[0041] 附图简要说明
[0042] 图1显示了由2‑HB的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0043] 图2显示了由3‑HB的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0044] 图3显示了由4‑MOP的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0045] 图4显示了由泛酸的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0046] 图5显示了由油酸的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0047] 图6显示了由LGPC的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0048] 图7显示了由丝氨酸的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
[0049] 图8A显示丝氨酸、3‑HB、2‑HB、泛酸、4‑MOP、LGPC和油酸的色谱图。对于每种分析物，感兴趣的峰值以及相关的保留时间由星形表示。如实施例2中所述使用方法4产生数据。
[0050] 图8B显示了丝氨酸‑d3、3‑HB‑d4、2‑HB‑d3、泛酸‑13C3‑15N、4‑MOP‑d3、LGPC‑d9和油13
酸‑ C18的内标的色谱图。对于每个内标，感兴趣的峰值以及相关的保留时间由星形表示。
如实施例2中所述使用方法4产生数据。
酸‑ C18的内标的色谱图。对于每个内标，感兴趣的峰值以及相关的保留时间由星形表示。
如实施例2中所述使用方法4产生数据。
[0051] 图9显示了Bland‑Altman图，其比较了使用本文所述以定量两种或更多种分析物的方法和丝氨酸PFPA方法测定的丝氨酸的定量。
[0052] 详述
[0053] 描述了用于测量样品中的选自下组的一种或多种分析物的量的方法：2‑羟基丁酸(2‑HB)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、4‑甲基‑2‑氧代戊酸(4‑MOP)、1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑
磷酸胆碱(LGPC)，油酸(oleic acid)(油酸(oleate))、泛酸(pantothenic acid)(泛酸
(pantothenate)、维生素B5)和丝氨酸。描述了用于使用单次注射方法定量样品中的单个和
多个分析物的质谱。该方法可以使用液相色谱步骤(例如UPLC)以执行与质谱方法组合的所
选分析物的分离(纯化、富集)，从而提供用于定量样品中的多种分析物的适于自动化的高
通量测定系统。
磷酸胆碱(LGPC)，油酸(oleic acid)(油酸(oleate))、泛酸(pantothenic acid)(泛酸
(pantothenate)、维生素B5)和丝氨酸。描述了用于使用单次注射方法定量样品中的单个和
多个分析物的质谱。该方法可以使用液相色谱步骤(例如UPLC)以执行与质谱方法组合的所
选分析物的分离(纯化、富集)，从而提供用于定量样品中的多种分析物的适于自动化的高
通量测定系统。
[0054] 本文提供的方法提供优于测量这些分析物的现有方法的优点。该方法使用单次注射来测量一种或多种和最多七种分析物。此外，该方法使用单次注射来测量具有不同离子
化极性的分析物。也就是说，通常使用负离子化模式测量的分析物能够使用正离子化模式
测量，并且通常使用正离子化模式测量的分析物能够使用负离子化模式测量。在单次注射
中测量各种组合的多种分析物(包括测量多达七种分析物的实施方案)的能力减少了获得
分析结果所需的时间，在实验室一次性物品(例如，管、移液器吸头、试剂)、实验室仪器和人
力资源方面使用较少的资源。这些改进通过降低测定成本和增加仪器和实验室的样品分析
能力来节省成本。
化极性的分析物。也就是说，通常使用负离子化模式测量的分析物能够使用正离子化模式
测量，并且通常使用正离子化模式测量的分析物能够使用负离子化模式测量。在单次注射
中测量各种组合的多种分析物(包括测量多达七种分析物的实施方案)的能力减少了获得
分析结果所需的时间，在实验室一次性物品(例如，管、移液器吸头、试剂)、实验室仪器和人
力资源方面使用较少的资源。这些改进通过降低测定成本和增加仪器和实验室的样品分析
能力来节省成本。
[0055] 在进一步详细描述本发明之前，定义了以下术语。
[0056] 定义：
[0057] 术语“固相提取”是指其中使用固体颗粒色谱填充材料(即固相或固定相)根据其物理和化学性质分离复杂混合物(即流动相)的组分的样品制备过程。固体颗粒填充材料可
包含在筒式装置(例如柱)中。
包含在筒式装置(例如柱)中。
[0058] 术语“分离”是指将复杂混合物分离成其组分分子或代谢物的过程。普通示例性实验室分离技术包括电泳和色谱。
[0059] 术语“色谱”是指物理分离方法，其中将要分离的组分(即化学成分)分布在两种相中，一种相是静止的(固定相)而另一种(流动相)沿明确的方向移动。流动相可以是气体
(“气相色谱”、“GC”)或液体(“液相色谱”、“LC”)。色谱输出数据可用于本文所述方法的实施
方案中。
(“气相色谱”、“GC”)或液体(“液相色谱”、“LC”)。色谱输出数据可用于本文所述方法的实施
方案中。
[0060] 术语“液相色谱”或“LC”是指当流体均匀地移动通过细分物质的柱或通过毛细管通道时选择性抑制流体溶液的一种或多种组分的过程。当流动相相对于固定相移动时，抑
制由一种或多种固定相与流动相之间的混合物组分的分布产生。“液相色谱”的实例包括
“反相液相色谱”或“RPLC”、“高效液相色谱”或“HPLC”、“超高效液相色谱”或“UPLC”或
“UHPLC”。
制由一种或多种固定相与流动相之间的混合物组分的分布产生。“液相色谱”的实例包括
“反相液相色谱”或“RPLC”、“高效液相色谱”或“HPLC”、“超高效液相色谱”或“UPLC”或
“UHPLC”。
[0061] 术语“保留时间”是指从将样品引入分离设备起的色谱分析过程中流逝的时间。样品的成分的保留时间是指将样品注入分离设备中的时刻与样品的成分洗脱(例如流出)包
含固体相的分离设备部分的时刻之间的色谱分析过程中流逝的时间。
含固体相的分离设备部分的时刻之间的色谱分析过程中流逝的时间。
[0062] 术语样品组分的“保留指数”是指通过内插(通常是对数内插)获得的数目，该数目使得样品组分的保留时间或保留因子与在样品组分的峰之前或之后洗脱的标准物的保留
时间相关联，这是利用已知标准物的分离特性去除系统误差的机制。
时间相关联，这是利用已知标准物的分离特性去除系统误差的机制。
[0063] 术语“分离指数”是指与由分离技术分离的化学成分相关联的衡量标准。对于色谱分离技术，该分离指数可以是保留时间或保留指数。对于非色谱分离技术，该分离指数可以
是化学成分行进的物理距离。
是化学成分行进的物理距离。
[0064] 术语“分离信息”和“分离数据”是指相对于分离指数指示存在或不存在化学成分的数据。例如，分离数据可以指示存在在特定时间洗脱的具有特定质量的化学成分。该分离
数据可以指示随着时间洗脱的化学成分的量上升、达到峰值且然后下降。随着分离指数(例
如时间)绘制的化学成分的存在的图可显示图形峰。因此，在分离数据的背景下，术语“峰信
息”和“峰数据”与术语“分离信息”和“分离数据”是同义的。
数据可以指示随着时间洗脱的化学成分的量上升、达到峰值且然后下降。随着分离指数(例
如时间)绘制的化学成分的存在的图可显示图形峰。因此，在分离数据的背景下，术语“峰信
息”和“峰数据”与术语“分离信息”和“分离数据”是同义的。
[0065] 术语“质谱”(MS)是指用于测量和分析分子的技术，其涉及将目标分子离子化或者将目标分子离子化并片段化，然后基于它们的质量/电荷比分析这些离子以产生用作“分子
指纹”的质谱。确定对象的质量/电荷比可以通过确定该对象吸收电磁能时的波长来完成。
存在一些确定离子的质荷比的常用方法，一些方法测量离子轨迹与电磁波的相互作用，其
他方法测量离子行进给定距离所花费的时间，或者二者的组合。可以对照着数据库搜索来
自这些片段质量测量的数据以获得对目标分子的识别。
指纹”的质谱。确定对象的质量/电荷比可以通过确定该对象吸收电磁能时的波长来完成。
存在一些确定离子的质荷比的常用方法，一些方法测量离子轨迹与电磁波的相互作用，其
他方法测量离子行进给定距离所花费的时间，或者二者的组合。可以对照着数据库搜索来
自这些片段质量测量的数据以获得对目标分子的识别。
[0066] 术语“以负模式操作”或“以负MRM模式操作”或“以负离子化模式操作”是指其中产生和检测负离子的那些质谱方法。术语“以正模式操作”或“以正MRM模式操作”或“以正离子
化模式操作”是指其中产生和检测正离子的那些质谱方法。
化模式操作”是指其中产生和检测正离子的那些质谱方法。
[0067] 术语“质量分析器”是指质谱仪中通过离子的质荷(“m/z”)比分离离子混合物的装置。
[0068] 术语“m/z”是指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无因次量。它一直被称为“质荷”比。
[0069] 如本文所用，术语“源”是指质谱仪中将待分析的样品离子化的装载。离子源的实例包括电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)、加热电喷雾离子化(HESI)、大气压
光离子化(APPI)、火焰离子化检测器(FID)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等。
光离子化(APPI)、火焰离子化检测器(FID)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等。
[0070] 如本文所用，术语“检测器”是指质谱仪中检测离子的装置。
[0071] 术语“离子”是指含有电荷的任何对象，其能够例如通过向该对象添加电子或从该对象去除电子来形成。
[0072] 术语“质谱”是指由质谱仪产生的数据的绘图，其通常包含x轴上的m/z值以及y轴上的强度值。
[0073] 术语“扫描”是指与特定分离指数相关联的质谱。例如，利用色谱分离技术的系统可产生多个扫描，每个扫描处于不同的保留时间。
[0074] 术语“运行时间”是指从样品注射到仪器数据的产生的时间。总运行时间包括样品的色谱和质谱。
[0075] 术语“串联MS”是指这样一种操作，即其中执行第一MS步骤，称其为“一级MS”，随后执行一个或多个后续MS步骤，统称为“二级MS”。在一级MS中，在创建一级质谱的过程中检测
并记录表示一个(以及可能多于一个)化学成分的离子。由离子表示的物质经历二级MS，其
中感兴趣物质发生碎裂以便促使该物质断裂成子组分，这些子组分被检测和记录为二级质
谱。在真实的串联MS中，一级MS中的感兴趣离子与在二级MS过程中产生的所得峰之间存在
明确的关系。一级MS中的感兴趣离子对应于“母”离子或前体离子，而在二级MS过程中产生
的离子对应于母离子的子组分并且在此被称为“子”离子或“产物”离子。
并记录表示一个(以及可能多于一个)化学成分的离子。由离子表示的物质经历二级MS，其
中感兴趣物质发生碎裂以便促使该物质断裂成子组分，这些子组分被检测和记录为二级质
谱。在真实的串联MS中，一级MS中的感兴趣离子与在二级MS过程中产生的所得峰之间存在
明确的关系。一级MS中的感兴趣离子对应于“母”离子或前体离子，而在二级MS过程中产生
的离子对应于母离子的子组分并且在此被称为“子”离子或“产物”离子。
[0076] 因此，串联MS允许产生表示复杂混合物中化学成分的母子关系的数据结构。这一关系可由图示说明母离子与子离子相互之间的关系的树状结构表示，其中子离子表示母离
子的子组分。例如可以对子离子重复进行串联MS以确定“孙”离子。因此，串联MS并不限于两
n 2
级碎裂，而是用于统指多级MS，也被称为“MS”。术语“MS/MS”与“MS”是同义的。为了简化起
见，本文下文的术语“子离子”是指由二级或更高级(即非一级)MS产生的任何离子。
子的子组分。例如可以对子离子重复进行串联MS以确定“孙”离子。因此，串联MS并不限于两
n 2
级碎裂，而是用于统指多级MS，也被称为“MS”。术语“MS/MS”与“MS”是同义的。为了简化起
见，本文下文的术语“子离子”是指由二级或更高级(即非一级)MS产生的任何离子。
[0077] 一种或多种生物标志物的“水平”是指样品中测量得到的生物标志物的绝对或相对量或浓度。
[0078] “样品”或“生物样品”意指从受试者分离的生物材料。生物样品可含有适合于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可包含来自受试者的细胞和/或非细胞材料。样品能
够从任何合适的生物流体或组织(例如血液、血浆(血浆液)、血清(血清液)、尿液、脑脊髓液
(CSF)或组织)中分离。
够从任何合适的生物流体或组织(例如血液、血浆(血浆液)、血清(血清液)、尿液、脑脊髓液
(CSF)或组织)中分离。
[0079] “受试者”是指任何动物，但优选是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或大鼠。
[0080] I.样品制备和质量控制(QC)
[0081] 通过将分析物与可能存在于样品中的大分子(例如，蛋白质，核酸，脂质)分离制备含有分析物的样品提取物。样品中的一些或所有分析物可能与蛋白质结合。在MS分析之前，
可使用各种方法来破坏分析物和蛋白质之间的相互作用。例如，可从样品中提取分析物以
产生液体提取物，而可能存在的蛋白质被沉淀并除去。可使用例如乙酸乙酯或甲醇的溶液
沉淀蛋白质。为了沉淀样品中的蛋白质，向样品中加入乙酸乙酯或甲醇溶液，然后可以在离
心机中旋转混合物以分离含有提取的分析物的液体上清液与沉淀的蛋白质。
可使用各种方法来破坏分析物和蛋白质之间的相互作用。例如，可从样品中提取分析物以
产生液体提取物，而可能存在的蛋白质被沉淀并除去。可使用例如乙酸乙酯或甲醇的溶液
沉淀蛋白质。为了沉淀样品中的蛋白质，向样品中加入乙酸乙酯或甲醇溶液，然后可以在离
心机中旋转混合物以分离含有提取的分析物的液体上清液与沉淀的蛋白质。
[0082] 在其他实施方案中，可从蛋白质释放分析物而不沉淀蛋白质。例如，可将甲酸溶液添加到样品中以破坏蛋白质和分析物之间的相互作用。或者，可向样品中加入硫酸铵、甲酸
的乙醇溶液或甲酸的甲醇溶液，以破坏蛋白质和分析物之间的离子相互作用而不沉淀蛋白
质。
的乙醇溶液或甲酸的甲醇溶液，以破坏蛋白质和分析物之间的离子相互作用而不沉淀蛋白
质。
[0083] 在一些实施方案中，可使提取物经受各种方法，包括如本文所述的液相色谱、电泳、过滤、离心和亲和分离，以相对于样品中的一种或多种其他组分纯化所选分析物或富集
所选分析物的量。
所选分析物的量。
[0084] 为了评估检测和定量分析物的方法的例如精确度、准确度、校准范围或分析灵敏度，可使用质量控制(QC)样品。可基于样品中检测到的给定分析物的定量下限(LLOQ)或定
量上限(ULOQ)来确定QC样品中使用的给定分析物的浓度。在一个实例中，可由标准物(例
如，标准物A)的浓度表示LLOQ，并且可由第二标准物(例如，标准物H)的浓度表示ULOQ。低QC
值可设定为约3×LLOQ的浓度，中QC值可设定为高QC的约25‑50％的浓度，并且高QC值可设
定为ULOQ的约80％的浓度。可基于在一组代表性样品中测量的样品结果的频率和分析测量
范围(AMR)的组合来选择QC目标浓度水平。
量上限(ULOQ)来确定QC样品中使用的给定分析物的浓度。在一个实例中，可由标准物(例
如，标准物A)的浓度表示LLOQ，并且可由第二标准物(例如，标准物H)的浓度表示ULOQ。低QC
值可设定为约3×LLOQ的浓度，中QC值可设定为高QC的约25‑50％的浓度，并且高QC值可设
定为ULOQ的约80％的浓度。可基于在一组代表性样品中测量的样品结果的频率和分析测量
范围(AMR)的组合来选择QC目标浓度水平。
[0085] II.色谱
[0086] 在质谱分析之前，可使分析物提取物经受一种或多种分离方法，例如电泳、过滤、离心、亲和分离或色谱。在一个实施方案中，分离方法可包括液相色谱(LC)，包括例如超高
效LC(UHPLC)。
效LC(UHPLC)。
[0087] 在一些实施方案中，可使用反相柱色谱系统、亲水作用色谱(HILIC)或混合相柱色谱系统进行UHPLC。
[0088] 用于LC的柱加热器可设定在约25℃至约80℃的温度。例如，柱加热器可设定在约40℃、50℃、60℃、70℃等。
[0089] 在一个实例中，可使用反相柱色谱系统进行UHPLC。该系统可包括两个或更多个流动相。流动相可以被称为例如流动相A、流动相B、流动相A'和流动相B'。
[0090] 在使用两种流动相A和B的示例性实施方案中，流动相A可包含甲酸、水和NH4Cl，流动相B可包含甲醇、乙腈和NH4Cl。流动相A中甲酸的浓度可为0.001％至0.1％。此外，流动相
A的组成可为0.01:1000:0.001至1.0:1000:0.01(甲酸:水:NH4Cl，v/v/wt)。在一个示例性
实施方案中，流动相A可以0.025:1000:0.001的体积/体积/重量(v/v/wt)比制备。在进一步
的实施方案中，流动相B可以2000:1000:0.001的v/v/wt比制备。
A的组成可为0.01:1000:0.001至1.0:1000:0.01(甲酸:水:NH4Cl，v/v/wt)。在一个示例性
实施方案中，流动相A可以0.025:1000:0.001的体积/体积/重量(v/v/wt)比制备。在进一步
的实施方案中，流动相B可以2000:1000:0.001的v/v/wt比制备。
[0091] 在一个实例中，线性梯度洗脱可用于色谱。线性梯度洗脱的起始条件可包括流动相(例如流动相B)的浓度和/或流动相(例如流动相B)通过柱的流速。可优化起始条件以分
离和/或保留一种或多种分析物。例如，通过以不超过5％的流动相B和300至800μL/min的流
速开始，可优化梯度的起始条件以分离3‑MOP和4‑MOP。在另一个实例中，也可通过以不超过
5％的流动相B开始来优化梯度的起始条件以保留柱上的2‑HB和3‑HB。还可优化梯度条件用
于分析物的分离和/或保留并且可根据所选择的流速而变化。例如，在5％流动相B和650μL/
min流速的初始条件下，流动相B可在0.8min内增加至40％，然后在0.01min内增加至99％并
保持1.09min。流动相B可在0.01min内回复至5％，用于下一次样品注射的平衡。流速可在
1.50至1.55min内从650改变至800μL/min，然后在2.20至2.21min内变回650μL/min。
离和/或保留一种或多种分析物。例如，通过以不超过5％的流动相B和300至800μL/min的流
速开始，可优化梯度的起始条件以分离3‑MOP和4‑MOP。在另一个实例中，也可通过以不超过
5％的流动相B开始来优化梯度的起始条件以保留柱上的2‑HB和3‑HB。还可优化梯度条件用
于分析物的分离和/或保留并且可根据所选择的流速而变化。例如，在5％流动相B和650μL/
min流速的初始条件下，流动相B可在0.8min内增加至40％，然后在0.01min内增加至99％并
保持1.09min。流动相B可在0.01min内回复至5％，用于下一次样品注射的平衡。流速可在
1.50至1.55min内从650改变至800μL/min，然后在2.20至2.21min内变回650μL/min。
[0092] 在其他实施方案中，流动相A可包含全氟戊酸(PFPA)和水，流动相B可包含PFPA和乙腈。PFPA的浓度可为约0.01至约0.500％。例如，PFPA的浓度可为约0.05％。在另一个实例
中，流动相A可为0.05％全氟戊酸(PFPA)的水溶液，流动相B可为0.05％PFPA的乙腈溶液。线
性梯度洗脱可用于色谱，并且可在1％流动相B保持0.5min的初始条件下进行。然后可在
1.1min内将流动相B的比例增加至39％。流动相B的比例可在0.2min内增加至80％，然后在
0.1min内恢复至1％用于下一次注射的平衡。流速可设定为800μL/min，总运行时间可小于3
分钟。
中，流动相A可为0.05％全氟戊酸(PFPA)的水溶液，流动相B可为0.05％PFPA的乙腈溶液。线
性梯度洗脱可用于色谱，并且可在1％流动相B保持0.5min的初始条件下进行。然后可在
1.1min内将流动相B的比例增加至39％。流动相B的比例可在0.2min内增加至80％，然后在
0.1min内恢复至1％用于下一次注射的平衡。流速可设定为800μL/min，总运行时间可小于3
分钟。
[0093] 在其他实施方案中，流动相A可包含甲酸和水，流动相B可包含乙腈和甲醇。在一个示例性实施方案中，流动相A可含有约0.001至约0.100％的甲酸，流动相B可含有0‑100％的
任何量的乙腈。在一个实例中，流动相A的浓度可为约0.0100％的甲酸水溶液，流动相B的浓
度可为甲醇中约50％的乙腈。线性梯度洗脱可用于色谱，并且可在1％流动相B的初始条件
下进行并且流速为800μL/min。流动相B可在0.5min时保持在1％，在2.50min时增加至16％，
在3.50min时增加至46％，然后可在3.60min和4.50min时降至1.0％。
任何量的乙腈。在一个实例中，流动相A的浓度可为约0.0100％的甲酸水溶液，流动相B的浓
度可为甲醇中约50％的乙腈。线性梯度洗脱可用于色谱，并且可在1％流动相B的初始条件
下进行并且流速为800μL/min。流动相B可在0.5min时保持在1％，在2.50min时增加至16％，
在3.50min时增加至46％，然后可在3.60min和4.50min时降至1.0％。
[0094] III.质谱和定量
[0095] 可通过本领域技术人员已知的任何方法离子化一种或多种分析物，包括例如质谱。使用质谱仪进行质谱分析，质谱仪包括离子源，用于离子化分级分离的样品并产生带电
分子用于进一步分析。样品的离子化可以通过例如电喷雾离子化(ESI)进行。其他离子源可
包括例如大气压化学离子化(APCI)、加热电喷雾离子化(HESI)、大气压光离子化(APPI)、火
焰离子化检测器(FID)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)。可以基于许多考虑来确定离子
化方法的选择。示例性考虑因素包括待测量的分析物、样品类型、检测器类型以及正或负模
式的选择。
分子用于进一步分析。样品的离子化可以通过例如电喷雾离子化(ESI)进行。其他离子源可
包括例如大气压化学离子化(APCI)、加热电喷雾离子化(HESI)、大气压光离子化(APPI)、火
焰离子化检测器(FID)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)。可以基于许多考虑来确定离子
化方法的选择。示例性考虑因素包括待测量的分析物、样品类型、检测器类型以及正或负模
式的选择。
[0096] 一种或多种分析物可以正或负模式离子化以产生一种或多种离子。例如，分析物2‑HB、3‑HB、4‑MOP、丝氨酸、泛酸、油酸和LGPC可以负模式离子化。可在单个样品注射中分析
以负模式离子化的分析物。在另一个实例中，分析物丝氨酸、泛酸和LGPC可以正模式离子
化。在一些实施方案中，可在一次样品注射中分析以正模式离子化的分析物，并且可在单独
的样品注射中分析以负模式离子化的分析物。在另一个实施方案中，可在单个样品注射中
分析以正模式离子化的分析物和以负模式离子化的分析物。
以负模式离子化的分析物。在另一个实例中，分析物丝氨酸、泛酸和LGPC可以正模式离子
化。在一些实施方案中，可在一次样品注射中分析以正模式离子化的分析物，并且可在单独
的样品注射中分析以负模式离子化的分析物。在另一个实施方案中，可在单个样品注射中
分析以正模式离子化的分析物和以负模式离子化的分析物。
[0097] 可针对给定方法和/或针对所使用的特定质谱仪优化质谱仪仪器设置。仪器可以使用各种气体，例如氮气、氦气、氩气或零空气。在一个实例中，可使用AB Sciex QTrap
5500质谱仪进行质谱分析。仪器可在负多反应监测(MRM)模式下操作。离子喷雾电压设置范
围为‑4kV至‑5kV；在一个实施方案中，电压可以设定在‑4.5kV。源温度可在约500℃至600℃
的范围内；在一个实施方案中，源温度可设定在550℃。幕帘气体的范围可为20到40或另一
个合适的值；在一个实施方案中，幕帘气体可设定为30。喷雾器和去溶剂化气体的流速可在
60至80的范围内或为另一适当值；在一个实施方案中，流速可设定为70。碰撞活化的解离
(CAD)气体的范围可从高到低。在一个实施方案中，CAD可设置为例如低。表1中描述了进一
步的示例性MS设置。
5500质谱仪进行质谱分析。仪器可在负多反应监测(MRM)模式下操作。离子喷雾电压设置范
围为‑4kV至‑5kV；在一个实施方案中，电压可以设定在‑4.5kV。源温度可在约500℃至600℃
的范围内；在一个实施方案中，源温度可设定在550℃。幕帘气体的范围可为20到40或另一
个合适的值；在一个实施方案中，幕帘气体可设定为30。喷雾器和去溶剂化气体的流速可在
60至80的范围内或为另一适当值；在一个实施方案中，流速可设定为70。碰撞活化的解离
(CAD)气体的范围可从高到低。在一个实施方案中，CAD可设置为例如低。表1中描述了进一
步的示例性MS设置。
[0098] 在另一个实例中，质谱仪可以正MRM模式操作。离子喷雾电压设定范围为2.5kV至3.5kV；在一个实施方案中，电压可设定为3.0kV。源温度可在约500℃至600℃的范围内；在
一个实施方案中，源温度可设定在550℃。幕帘气体的范围可为10到30或另一个合适的值；
在一个实施方案中，幕帘气体设定为20。喷雾器和去溶剂化气体的流速可为60至80或另一
适当值；在一个实施方案中，设定的流速可设定为70。CAD气体设定可从高到低；在一个实施
方案中，CAD气体设定为高。去簇电压可从低于40V到超过45V。在一个实施方案中，去簇电压
可设置为41V。碰撞能量的范围可从小于45eV到大于45eV。在一个实施方案中，碰撞能量设
定为45eV。入口电压设置可从小于大约10V到大于10V；在一个实施方案中，入口电压设置为
10V。碰撞单元出口电压设置的范围可从小于8V到大于8V；在一个实施方案中，碰撞出口电
压设定为8V。
一个实施方案中，源温度可设定在550℃。幕帘气体的范围可为10到30或另一个合适的值；
在一个实施方案中，幕帘气体设定为20。喷雾器和去溶剂化气体的流速可为60至80或另一
适当值；在一个实施方案中，设定的流速可设定为70。CAD气体设定可从高到低；在一个实施
方案中，CAD气体设定为高。去簇电压可从低于40V到超过45V。在一个实施方案中，去簇电压
可设置为41V。碰撞能量的范围可从小于45eV到大于45eV。在一个实施方案中，碰撞能量设
定为45eV。入口电压设置可从小于大约10V到大于10V；在一个实施方案中，入口电压设置为
10V。碰撞单元出口电压设置的范围可从小于8V到大于8V；在一个实施方案中，碰撞出口电
压设定为8V。
[0099] 在样品被离子化后，可分析带正电或带负电的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的示例性合适分析仪包括四极杆分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可使用例如
选择模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括多反应监测(MRM)和选择反应监测
(SRM)。
选择模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括多反应监测(MRM)和选择反应监测
(SRM)。
[0100] 分析结果可包括串联MS产生的数据。在示例性实施方案中，串联MS可为精确质量串联MS。例如，精确质量串联质谱可使用四极杆飞行时间(Q‑TOF)分析仪。串联MS允许创建
表示复杂混合物中化学成分的亲子关系的数据结构。该关系可由树状结构表示，该树状结
构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子代表母离子的子组分。
表示复杂混合物中化学成分的亲子关系的数据结构。该关系可由树状结构表示，该树状结
构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子代表母离子的子组分。
[0101] 例如，一级质谱可包含五种不同的离子，其可表示为五个图形峰。一级MS中的每个离子可为母离子。每个母离子可经历二级MS，其产生显示该特定母离子的子离子的质谱。
[0102] 可延伸亲/子关系以描述分离的组分(例如，从色谱状态洗脱的组分)和在一级MS中检测的离子之间的关系，以及待分析的样品与分离的组分之间的关系。
[0103] 质谱仪通常向用户提供离子扫描(即，具有给定范围内的特定质量/电荷的每种离子的相对丰度)。质谱数据可通过许多方法与原始样品中的分析物的量相关。在一个实例
中，校准标准物用于生成标准曲线(校准曲线)，使得给定离子的相对丰度可以被转换成原
始分析物的绝对量。在另一个实例中，校准标准物可为外标，并且可基于从那些标准物产生
的离子生成标准曲线以计算一种或多种分析物的量。在另一个实例中，外标可为未标记的
分析物。
中，校准标准物用于生成标准曲线(校准曲线)，使得给定离子的相对丰度可以被转换成原
始分析物的绝对量。在另一个实例中，校准标准物可为外标，并且可基于从那些标准物产生
的离子生成标准曲线以计算一种或多种分析物的量。在另一个实例中，外标可为未标记的
分析物。
[0104] 可将内标添加到校准标准物和/或测试样品中。可使用内标来计算样品处理过程中分析物的损失，以便获得样品中测量分析物的更准确值。校准标准物水平中分析物峰面
积与内标峰面积的比率可用于产生校准曲线和定量样品。一种或多种同位素标记的分析物
13 15 13
类似物可用作内标，例如2‑HB‑d3，3‑HB‑d4，4‑MOP‑d3，丝氨酸‑d3，泛酸‑ C3‑ N，油酸‑ C18
13 13
和LGPC‑d9。其他合适的内标包括，例如，D‑3‑HB‑ C4，钠D‑3‑HB‑2,4‑ C2，钠D‑3‑HB‑4,4,4‑
13 13 15 13
d3，钠(+/‑)‑3‑HB‑2,2‑d2，钠(+/‑)‑3‑HB‑2,4‑ C2，L‑丝氨酸‑ C3‑d3‑ N，DL‑丝氨酸‑ C3
15 13 13 15 15
‑ N，L‑丝氨酸‑ C3，L‑丝氨酸‑ C3‑ N，DL‑丝氨酸‑2,3,3‑d3，L‑丝氨酸‑2,3,3‑d3‑ N，DL‑
丝氨酸‑3,3‑d2，L‑丝氨酸‑3,3‑d2，L‑丝氨酸‑d7，油酸‑11,11‑d2，油酸‑9,10‑d2和油酸‑d33。
积与内标峰面积的比率可用于产生校准曲线和定量样品。一种或多种同位素标记的分析物
13 15 13
类似物可用作内标，例如2‑HB‑d3，3‑HB‑d4，4‑MOP‑d3，丝氨酸‑d3，泛酸‑ C3‑ N，油酸‑ C18
13 13
和LGPC‑d9。其他合适的内标包括，例如，D‑3‑HB‑ C4，钠D‑3‑HB‑2,4‑ C2，钠D‑3‑HB‑4,4,4‑
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d3，钠(+/‑)‑3‑HB‑2,2‑d2，钠(+/‑)‑3‑HB‑2,4‑ C2，L‑丝氨酸‑ C3‑d3‑ N，DL‑丝氨酸‑ C3
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‑ N，L‑丝氨酸‑ C3，L‑丝氨酸‑ C3‑ N，DL‑丝氨酸‑2,3,3‑d3，L‑丝氨酸‑2,3,3‑d3‑ N，DL‑
丝氨酸‑3,3‑d2，L‑丝氨酸‑3,3‑d2，L‑丝氨酸‑d7，油酸‑11,11‑d2，油酸‑9,10‑d2和油酸‑d33。
[0105] 可将分析数据发送到计算机并使用计算机软件进行处理。在一个实例中，使用用于定量的统计回归方法将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。在另一
个实例中，统计回归是加权线性最小二乘回归。使用校准曲线计算的斜率和截距可用于计
算实验样品中未知的分析物浓度。
个实例中，统计回归是加权线性最小二乘回归。使用校准曲线计算的斜率和截距可用于计
算实验样品中未知的分析物浓度。
[0106] IV.试剂盒
[0107] 用于测定选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、丝氨酸、泛酸、油酸和LGPC的一种或多种分析物的试剂盒可包含本文所述的组合物和方法。例如，试剂盒可包括包装材料和足以进行一个
或多个测定的量的一种或多种内标的测量量。在示例性实施方案中，内标可为同位素标记
的，试剂盒可包含预制的流动相溶液，和/或试剂盒可包含流动相试剂和制备流动相溶液的
说明。试剂盒还可包括用于使用试剂测量一种或多种分析物的以有形形式记录的指令(例
如，在纸上，例如说明书或电子介质)。
实施例
或多个测定的量的一种或多种内标的测量量。在示例性实施方案中，内标可为同位素标记
的，试剂盒可包含预制的流动相溶液，和/或试剂盒可包含流动相试剂和制备流动相溶液的
说明。试剂盒还可包括用于使用试剂测量一种或多种分析物的以有形形式记录的指令(例
如，在纸上，例如说明书或电子介质)。
实施例
[0108] I.一般方法
[0109] A.试剂和仪器
[0110] 从Sigma‑Aldrich获得质谱级(98％)甲酸和氯化铵(99.5％)；从Fisher Scientific获得HPLC级甲醇和水；并且从Acros获得HPLC级乙腈和乙醇。VWR Scientific的
多管涡旋器用于混合。板的离心在Thermo Scientific的配备3617吊篮式转子的Sorvall
ST 40R离心机中进行。从Bioreclamation获得人血浆(K2‑EDTA)。从Sigma‑Aldrich获得脂
质体、胆红素、牛血清白蛋白(不含脂肪酸)和全氟戊酸(PFPA)。从Sigma‑Aldrich购得L‑丝
13
氨酸、(S)‑2‑羟基丁酸、(±)‑3‑羟基丁酸钠、4‑甲基‑2‑氧代戊酸、油酸和油酸‑ C18；从MP
Biochemicals获得D‑泛酸钙；从Avanti Polar Lipids获得1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑
3‑磷酸胆碱和1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱‑N,N,N‑三甲基‑d9；从Cambridge
13 15
Isotope Laboratories获得L‑丝氨酸‑2,3,3‑d3和泛酸钙(β‑丙氨酸‑ C3, N)；从CDN
Isotopes获得钠(±)‑2‑羟基丁酸‑2,3,3‑d3、钠(±)‑3‑羟基丁酸‑3,4,4,4‑d4和4‑甲基‑
d3‑2‑氧代戊酸钠。
多管涡旋器用于混合。板的离心在Thermo Scientific的配备3617吊篮式转子的Sorvall
ST 40R离心机中进行。从Bioreclamation获得人血浆(K2‑EDTA)。从Sigma‑Aldrich获得脂
质体、胆红素、牛血清白蛋白(不含脂肪酸)和全氟戊酸(PFPA)。从Sigma‑Aldrich购得L‑丝
13
氨酸、(S)‑2‑羟基丁酸、(±)‑3‑羟基丁酸钠、4‑甲基‑2‑氧代戊酸、油酸和油酸‑ C18；从MP
Biochemicals获得D‑泛酸钙；从Avanti Polar Lipids获得1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑
3‑磷酸胆碱和1‑亚油酰基‑2‑羟基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱‑N,N,N‑三甲基‑d9；从Cambridge
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Isotope Laboratories获得L‑丝氨酸‑2,3,3‑d3和泛酸钙(β‑丙氨酸‑ C3, N)；从CDN
Isotopes获得钠(±)‑2‑羟基丁酸‑2,3,3‑d3、钠(±)‑3‑羟基丁酸‑3,4,4,4‑d4和4‑甲基‑
d3‑2‑氧代戊酸钠。
[0111] B.样品制备
[0112] 在聚丙烯96孔板中进行样品制备。对于校准标准物、空白和具有内标样品的空白，将50μL水转移至适当的孔中。对于QC和研究样品，将50μL血浆(在冰上解冻)转移至合适的
孔中。对于校准标准物，添加了40μL相应的校准加标溶液。将所有其他样品与40μL乙腈/水/
乙醇混合物(1:1:2)合并。向每个孔中加入20μL等分试样的工作内标(WIS)溶液，例外是空
白，向其中加入20μL乙腈/水/乙醇混合物(1:1:2)。WIS溶液可包含一种或多种内标，并且可
包含本文所述的七种分析物中的每一种的一种或多种内标。通过向每个孔中加入1％甲酸
的甲醇溶液(200μL)进行代谢物提取。盖上板，在室温下涡旋2分钟，并在4℃下以3000rpm离
心5分钟。将上清液的150μL等分试样转移到新板中用于LC‑MS/MS分析。为了评估样品回收
率，将QC样品以相当于校准标准D的浓度(其代表给定分析物的中间QC值)掺入。每种分析物
的校准标准物列于下面实施例1的表3中；标准物D的校准值显示在标题为“D”的栏中。储备
溶液、校准加标溶液和内标溶液储存在4℃。
孔中。对于校准标准物，添加了40μL相应的校准加标溶液。将所有其他样品与40μL乙腈/水/
乙醇混合物(1:1:2)合并。向每个孔中加入20μL等分试样的工作内标(WIS)溶液，例外是空
白，向其中加入20μL乙腈/水/乙醇混合物(1:1:2)。WIS溶液可包含一种或多种内标，并且可
包含本文所述的七种分析物中的每一种的一种或多种内标。通过向每个孔中加入1％甲酸
的甲醇溶液(200μL)进行代谢物提取。盖上板，在室温下涡旋2分钟，并在4℃下以3000rpm离
心5分钟。将上清液的150μL等分试样转移到新板中用于LC‑MS/MS分析。为了评估样品回收
率，将QC样品以相当于校准标准D的浓度(其代表给定分析物的中间QC值)掺入。每种分析物
的校准标准物列于下面实施例1的表3中；标准物D的校准值显示在标题为“D”的栏中。储备
溶液、校准加标溶液和内标溶液储存在4℃。
[0113] 对于2‑HB，QC样品掺入浓度为5.00μg/mL 2‑HB，这相当于校准标准D。
[0114] 对于3‑HB，QC样品掺入浓度为10.00μg/mL 3‑HB，这相当于校准标准D。
[0115] 对于4‑MOP，QC样品掺入浓度为5.00μg/mL的4‑MOP，这相当于校准标准D。
[0116] 对于丝氨酸，QC样品掺入浓度为25.0μg/mL的丝氨酸，这相当于校准标准D。
[0117] 对于泛酸盐，QC样品掺入浓度为0.100μg/mL的泛酸盐，这相当于校准标准D。
[0118] 对于油酸，QC样品掺入浓度为100μg/mL的油酸，这相当于校准标准D。
[0119] 对于LGPC，QC样品掺入浓度为25.00μg/mL的LGPC，这相当于校准标准D。
[0120] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以40.0μg/mL的浓度制备2‑HB‑d3的WIS溶液。
[0121] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以30.0μg/mL的浓度制备3‑HB‑d4的WIS溶液。
[0122] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以20.0μg/mL的浓度制备4‑MOP‑d3的WIS溶液。
[0123] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以50.0μg/mL的浓度制备丝氨酸‑d3的WIS溶液。
[0124] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以0.700μg/mL的浓度制备泛酸‑13C3,15N的WIS溶液。
[0125] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以20.0μg/mL的浓度制备油酸‑13C18的WIS溶液。
[0126] 在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以20.0μg/mL的浓度制备LGPC‑d9的WIS溶液。
[0127] C.色谱
[0128] Agilent 1290Infinity UHPLC系统(每个配备有二元溶剂泵单元，冷冻自动进样器(设定在4℃)和柱加热器(设定在50℃，除非另有说明))用于使用反相色谱柱(Waters
ACQUITY BEH C18,1.7μm,2.1x100mm)的液相色谱。除非另有说明，否则流动相A为
甲酸/水/NH4Cl(0.025:1000:0.001，v/v/wt)，流动相B为甲醇/乙腈/NH4Cl(2000:1000:
0.001，v/v/wt)。除非另有说明，否则进行线性梯度洗脱，初始条件为5％流动相B(95％流动
相A)和650μL/min流速。流动相B在0.8min内从最初的5％增加至40％(60％流动相A)，然后
在0.01min内从40％增加至99％(1％流动相A)并保持1.09min。然后，在注入下一个样品之
前流动相B在0.01min内回复至5％(95％流动相A)以进行平衡。流速在1.50到1.55min内从
650μL/min增加到800μL/min，然后在2.20到2.21min内减少到650μL/min。运行时间为
2.21min。将最终提取溶液的0.5‑1.0μL的单个固定等分试样注射到色谱柱上用于分析每个
样品。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。除非另有说明，否则异
丙醇用于针头清洗。
ACQUITY BEH C18,1.7μm,2.1x100mm)的液相色谱。除非另有说明，否则流动相A为
甲酸/水/NH4Cl(0.025:1000:0.001，v/v/wt)，流动相B为甲醇/乙腈/NH4Cl(2000:1000:
0.001，v/v/wt)。除非另有说明，否则进行线性梯度洗脱，初始条件为5％流动相B(95％流动
相A)和650μL/min流速。流动相B在0.8min内从最初的5％增加至40％(60％流动相A)，然后
在0.01min内从40％增加至99％(1％流动相A)并保持1.09min。然后，在注入下一个样品之
前流动相B在0.01min内回复至5％(95％流动相A)以进行平衡。流速在1.50到1.55min内从
650μL/min增加到800μL/min，然后在2.20到2.21min内减少到650μL/min。运行时间为
2.21min。将最终提取溶液的0.5‑1.0μL的单个固定等分试样注射到色谱柱上用于分析每个
样品。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。除非另有说明，否则异
丙醇用于针头清洗。
[0129] 实施例1：分析物的LC‑MS/MS测量
[0130] 如上文“一般方法”部分的色谱的描述中所述，对提取的样品进行反相液相色谱。
[0131] 使用AB Sciex QTrap 5500质谱仪对样品进行质谱分析。仪器以负多反应监测(MRM)模式操作。离子喷雾电压设定为‑4.5kV，源温度设定为550℃，幕帘气体(例如氮气)设
定为30，喷雾器和去溶剂化气体(例如氮气)流速设定为70，碰撞激活解离(CAD)气体(例如
氮气)设定为低。表1中描述了每种分析物的详细MS设置。
定为30，喷雾器和去溶剂化气体(例如氮气)流速设定为70，碰撞激活解离(CAD)气体(例如
氮气)设定为低。表1中描述了每种分析物的详细MS设置。
[0132] 表1.质谱仪方法设置
[0133] 分析物 停留时间(msec) DP(V) EP(V) CE(eV) CXP(V)2‑HB 18 ‑55 ‑10 ‑8 ‑9
2‑HB‑d3 18 ‑55 ‑10 ‑7 ‑9
3‑HB 18 ‑35 ‑10 ‑6 ‑9
3‑HB‑d4 18 ‑35 ‑10 ‑8 ‑9
4‑MOP 36 ‑30 ‑10 ‑10.5 ‑7.5
4‑MOP‑d3 18 ‑30 ‑10 ‑12 ‑9
丝氨酸 18 ‑60 ‑10 ‑20 ‑15
丝氨酸‑d3 18 ‑60 ‑10 ‑20 ‑15
泛酸 18 ‑90 ‑10 ‑18 ‑15
13 15
泛酸‑ C3‑ N 18 ‑90 ‑10 ‑18 ‑15
油酸 18 ‑100 ‑10 ‑40 ‑5
13
油酸‑ C18 18 ‑100 ‑10 ‑30 ‑5
LGPC 18 ‑100 ‑10 ‑70 ‑5
LGPC‑d9 18 ‑100 ‑10 ‑70 ‑5
2‑HB‑d3 18 ‑55 ‑10 ‑7 ‑9
3‑HB 18 ‑35 ‑10 ‑6 ‑9
3‑HB‑d4 18 ‑35 ‑10 ‑8 ‑9
4‑MOP 36 ‑30 ‑10 ‑10.5 ‑7.5
4‑MOP‑d3 18 ‑30 ‑10 ‑12 ‑9
丝氨酸 18 ‑60 ‑10 ‑20 ‑15
丝氨酸‑d3 18 ‑60 ‑10 ‑20 ‑15
泛酸 18 ‑90 ‑10 ‑18 ‑15
13 15
泛酸‑ C3‑ N 18 ‑90 ‑10 ‑18 ‑15
油酸 18 ‑100 ‑10 ‑40 ‑5
13
油酸‑ C18 18 ‑100 ‑10 ‑30 ‑5
LGPC 18 ‑100 ‑10 ‑70 ‑5
LGPC‑d9 18 ‑100 ‑10 ‑70 ‑5
[0134] 从仪器获取原始数据并使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)处理。对于定量，通过2
加权(1/x)线性最小二乘回归将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。
得到的校准曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。在本实施例中用于定量每
种分析物的母离子和子离子分别列于表2中标题为“母离子(m/z)”和“用于定量的子离子
(m/z)”的栏下。除油酸外，每种分析物的最强子离子被选择用于定量。对于油酸，没有子离
子具有足够的灵敏度以包含校准范围。
加权(1/x)线性最小二乘回归将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。
得到的校准曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。在本实施例中用于定量每
种分析物的母离子和子离子分别列于表2中标题为“母离子(m/z)”和“用于定量的子离子
(m/z)”的栏下。除油酸外，每种分析物的最强子离子被选择用于定量。对于油酸，没有子离
子具有足够的灵敏度以包含校准范围。
[0135] 表2.在负离子化模式下测量的分析物的母离子和子离子质量与电荷比
[0136]
[0137] 确定了每种分析物的校准范围。对于每种分析物，LLOQ代表校准范围的低端，校准范围的高端由ULOQ表示。使用八个校准器(标准物A‑H)来覆盖校准范围。每种校准器中的最
终分析物浓度列于表3中。校准加标溶液在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以相应校准浓度的1.25
倍制备。
终分析物浓度列于表3中。校准加标溶液在乙腈/水/乙醇(1:1:2)中以相应校准浓度的1.25
倍制备。
[0138] 表3.分析物的校准范围
[0139]
[0140] 基于LLOQ和ULOQ确定QC水平。根据需要，从具有适当分析物浓度的人血浆库与强化分析物的组合制备低、中和高水平QC样品。对于所有分析物，LLOQ样品在不含脂肪酸的
BSA溶液(50mg/mL，在PBS中)中制备，其浓度与表3中的标准物A相同。QC样品储存在‑80℃。
BSA溶液(50mg/mL，在PBS中)中制备，其浓度与表3中的标准物A相同。QC样品储存在‑80℃。
[0141] 图1‑7显示了由表2中所示的母离子的碎裂化产生的质谱。
[0142] 在负离子化模式下监测以用于定量2‑HB的MRM转变包括通过使具有约103.1±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约57.1±0.5、35.0±0.5、44.9±0.5、55.0±0.5、84.9±
0.5和101.0±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图1中举例说明了由2‑HB的串联质谱碎裂
产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于定量2‑HB的子离子具有约57.1±0.5的
m/z。2‑HB的校准范围确定为0.500至40.0μg/mL。
0.5和101.0±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图1中举例说明了由2‑HB的串联质谱碎裂
产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于定量2‑HB的子离子具有约57.1±0.5的
m/z。2‑HB的校准范围确定为0.500至40.0μg/mL。
[0143] 在负离子化模式下监测以用于定量3‑HB的MRM转变包括通过使具有约103.1±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约59.1±0.5和41.1±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图
2中举例说明了由3‑HB的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于
定量3‑HB的子离子具有约59.1±0.5的m/z。3‑HB的校准范围确定为1.00至80.0μg/mL。
2中举例说明了由3‑HB的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于
定量3‑HB的子离子具有约59.1±0.5的m/z。3‑HB的校准范围确定为1.00至80.0μg/mL。
[0144] 在负离子化模式下监测以用于定量4‑MOP的MRM转变包括通过使具有约129.0±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约85.1±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图3中举例
说明了由4‑MOP的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于定量4‑
MOP的子离子具有约85.1±0.5的m/z。4‑MOP的校准范围确定为0.500至20.0μg/mL。
说明了由4‑MOP的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于定量4‑
MOP的子离子具有约85.1±0.5的m/z。4‑MOP的校准范围确定为0.500至20.0μg/mL。
[0145] 在负离子化模式下监测以用于定量泛酸的MRM转变包括通过使具有约218.1±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约88.0±0.5、42.0±0.5、44.0±0.5、45.1±0.5、59.0±
0.5、71.0±0.5、72.0±0.5、98.1±0.5、98.9±0.5、100.9±0.5、116.0±0.5、129.1±0.5
和146.0±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图4中举例说明了由泛酸的串联质谱碎裂产生
的这些母离子峰和子离子峰。在本实施例中，用于定量泛酸的子离子具有约88.0±0.5的m/
z。泛酸的校准范围确定为0.0100至0.800μg/mL。
0.5、71.0±0.5、72.0±0.5、98.1±0.5、98.9±0.5、100.9±0.5、116.0±0.5、129.1±0.5
和146.0±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图4中举例说明了由泛酸的串联质谱碎裂产生
的这些母离子峰和子离子峰。在本实施例中，用于定量泛酸的子离子具有约88.0±0.5的m/
z。泛酸的校准范围确定为0.0100至0.800μg/mL。
[0146] 在负离子化模式下监测以用于定量油酸的MRM转变包括通过使具有约281.3±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约44.7±0.5、61.8±0.5、79.8±0.5、143.1±0.5、183.0±
0.5、194.9±0.5、206.9±0.5、209.0±0.5、210.1±0.5、223.1±0.5、237.1±0.5和251.1
±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图5中举例说明了由油酸的串联质谱碎裂产生的这些
母离子峰和子离子峰。对于本实施例，使用281.3±0.5至281.3±0.5的亲本间转变来定量
油酸。油酸的校准范围确定为10.0至400μg/mL。
0.5、194.9±0.5、206.9±0.5、209.0±0.5、210.1±0.5、223.1±0.5、237.1±0.5和251.1
±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图5中举例说明了由油酸的串联质谱碎裂产生的这些
母离子峰和子离子峰。对于本实施例，使用281.3±0.5至281.3±0.5的亲本间转变来定量
油酸。油酸的校准范围确定为10.0至400μg/mL。
[0147] 在负离子化模式下监测以用于定量LGPC的MRM转变包括通过使具有约554.3±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约279.2±0.5、34.9±0.5、79.0±0.5、153.0±0.5、167.9
±0.5、224.1±0.5、242.0±0.5和504.4±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图6中举例说
明了由LGPC的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰。由于LGPC的两性离子性质，使
用反荷离子以负离子化模式定量分析物。在本实施例中，通过在流动相中包含少量氯化铵
‑
来选择氯化物作为反荷离子，并选择母离子[M+Cl] 向子离子m/z 279±0.5的转变用于定
量LGPC。LGPC的校准范围确定为2.50至100μg/mL。
±0.5、224.1±0.5、242.0±0.5和504.4±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图6中举例说
明了由LGPC的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰。由于LGPC的两性离子性质，使
用反荷离子以负离子化模式定量分析物。在本实施例中，通过在流动相中包含少量氯化铵
‑
来选择氯化物作为反荷离子，并选择母离子[M+Cl] 向子离子m/z 279±0.5的转变用于定
量LGPC。LGPC的校准范围确定为2.50至100μg/mL。
[0148] 在负离子化模式下监测以用于定量丝氨酸的MRM转变包括通过使具有约104.0±0.5的m/z的母离子碎裂以产生具有约74.0±0.5、40.1±0.5、42.0±0.5、45.0±0.5、56.0
±0.5和58.1±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图7中举例说明了由丝氨酸的串联质谱碎
裂产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于定量丝氨酸的子离子具有约74.0±
0.5的m/z。丝氨酸的校准范围确定为2.50至100μg/mL。
±0.5和58.1±0.5的m/z的子离子而产生的那些。图7中举例说明了由丝氨酸的串联质谱碎
裂产生的这些母离子和子离子峰。在本实施例中，用于定量丝氨酸的子离子具有约74.0±
0.5的m/z。丝氨酸的校准范围确定为2.50至100μg/mL。
[0149] 从图1‑7中的产物离子扫描中可以看出，在所示的母离子碎裂时可以产生多个子离子。可以选择图1‑7中所示或在表2中在“其他子离子”的列中列出的这些子离子中的任何
一个或多个子离子来代替或增加上述实施例和表2中在“用于定量的子离子(m/z)”的列中
所用的子离子。
一个或多个子离子来代替或增加上述实施例和表2中在“用于定量的子离子(m/z)”的列中
所用的子离子。
[0150] 作为测量丝氨酸的替代方法，使用离子配对条件下的色谱法(PFPA)，并且质谱仪以正模式操作。在这些条件下，丝氨酸被色谱保留并且不经受高水平基质抑制。对于丝氨酸
PFPA方法，柱加热器设定在60℃。流动相A是在水中的0.05％全氟戊酸(PFPA)，流动相B是在
乙腈中的0.05％PFPA。进行线性梯度洗脱，初始条件为1％流动相B保持0.5min，然后在
1.1min内增加至39％。流动相B的比例在0.2min内增加至80％(20％流动相A)，然后在
0.1min内回到1％(99％流动相A)以进行平衡用于下一次注射。流速为800μL/min，总运行时
间为2.21min。每个样品注入最终提取溶液的1.5μL等分试样。
PFPA方法，柱加热器设定在60℃。流动相A是在水中的0.05％全氟戊酸(PFPA)，流动相B是在
乙腈中的0.05％PFPA。进行线性梯度洗脱，初始条件为1％流动相B保持0.5min，然后在
1.1min内增加至39％。流动相B的比例在0.2min内增加至80％(20％流动相A)，然后在
0.1min内回到1％(99％流动相A)以进行平衡用于下一次注射。流速为800μL/min，总运行时
间为2.21min。每个样品注入最终提取溶液的1.5μL等分试样。
[0151] 对于使用丝氨酸PFPA方法的质谱，仪器以正MRM模式操作，其中离子对106.1/60.1和109.1/63.1分别用于丝氨酸和丝氨酸‑d3。离子喷雾电压设定为3.0kV，源温度设定为550
℃，幕帘气体设定为20，喷雾器和去溶剂气体流速设定为70，CAD气体设定为高。去簇电压设
定为41V，碰撞能量为45eV，入口电压为10V，碰撞单元出口电压为8V。
℃，幕帘气体设定为20，喷雾器和去溶剂气体流速设定为70，CAD气体设定为高。去簇电压设
定为41V，碰撞能量为45eV，入口电压为10V，碰撞单元出口电压为8V。
[0152] 在另一个实例中，开发了替代方法以测量各个分析物。在下面举例说明的方法中，使用Agilent 1290Infinity UHPLC系统(每个配备有二元溶剂泵单元，冷冻自动进样器(设
定在4℃)和柱加热器(设定在60℃))对提取的样品进行使用反相色谱柱(Waters ACQUITY
BEH C18,1.7μm,2.1x100mm)的液相色谱。对于每批中的每个样品，将最终提取溶
液的0.5‑1.0μL的单个固定等分试样注入到色谱柱上。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动
引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇用于针头清洗。使用具有Turbo V源(ESI)的AB Sciex
QTrap 5500质谱仪。
定在4℃)和柱加热器(设定在60℃))对提取的样品进行使用反相色谱柱(Waters ACQUITY
BEH C18,1.7μm,2.1x100mm)的液相色谱。对于每批中的每个样品，将最终提取溶
液的0.5‑1.0μL的单个固定等分试样注入到色谱柱上。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动
引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇用于针头清洗。使用具有Turbo V源(ESI)的AB Sciex
QTrap 5500质谱仪。
[0153] 对于这些方法，监测以用于定量2‑HB、3‑HB、4‑MOP、油酸、LGPC、丝氨酸和泛酸的示例性离子列于表4中。
[0154] 表4.用于定量分析物的离子
[0155]
[0156] 例如，开发了测量2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC或油酸的量的方法。对于这些方法，流动相A为在水中的0.0100％甲酸，流动相B为乙腈/甲醇(1:1)。线性梯度洗脱在5％流动相B的
初始条件下进行。流动相B在0.8min时增加至25％，在1.40min时增加至37％，在1.50和
2.60min时增加至99％，然后在2.70min时增加至0.5％。流速为550μL/min。对于2‑HB、3‑HB、
4‑MOP或油酸，质谱仪以负MRM模式操作，对于LGPC，质谱仪以正MRM模式操作。
初始条件下进行。流动相B在0.8min时增加至25％，在1.40min时增加至37％，在1.50和
2.60min时增加至99％，然后在2.70min时增加至0.5％。流速为550μL/min。对于2‑HB、3‑HB、
4‑MOP或油酸，质谱仪以负MRM模式操作，对于LGPC，质谱仪以正MRM模式操作。
[0157] 在另一个实例中，开发了测量泛酸或丝氨酸的量的方法。对于这些方法，流动相A为在水中的0.0500％全氟戊酸(PFPA)，流动相B为在乙腈中的0.0500％PFPA。线性梯度洗脱
在1％流动相B的初始条件下进行。流动相B在0.5min时保持在1％，在2.50min时增加至
16％，在3.50min时增加至46％，并且在3.60min和4.50min时降至1.0％。流速为800μL/min。
质谱仪以正MRM模式操作。
在1％流动相B的初始条件下进行。流动相B在0.5min时保持在1％，在2.50min时增加至
16％，在3.50min时增加至46％，并且在3.60min和4.50min时降至1.0％。流速为800μL/min。
质谱仪以正MRM模式操作。
[0158] 实施例2：多种分析物的LC‑MS/MS测量
[0159] 开发了使用样品提取物的单次注射测量样品中的多种分析物的方法；也就是说，使用相同(单次)注射在同一样品中测定两种或更多种分析物的量。在下面举例说明的所有
方法中，使用Agilent 1290Infinity UHPLC系统(每个配备有二元溶剂泵单元，冷冻自动进
样器(设定在4℃)和柱加热器(设定在50℃，除非另有说明))对提取的样品进行使用反相色
谱柱(Waters ACQUITY BEH C18,1.7μm,2.1x100mm)的液相色谱。
方法中，使用Agilent 1290Infinity UHPLC系统(每个配备有二元溶剂泵单元，冷冻自动进
样器(设定在4℃)和柱加热器(设定在50℃，除非另有说明))对提取的样品进行使用反相色
谱柱(Waters ACQUITY BEH C18,1.7μm,2.1x100mm)的液相色谱。
[0160] LC‑MS/MS方法1：丝氨酸和泛酸
[0161] 例如，开发了一种在同一注射中测量泛酸和丝氨酸的量的方法。在该方法中，柱加热器设定为60℃，流动相A为0.0500％全氟戊酸(PFPA)的水溶液，流动相B为0.0500％PFPA
的乙腈溶液。线性梯度洗脱在1％流动相B的初始条件下进行。流动相B在0.5min时保持在
1％，在2.50min时增加至16％，在3.50min时增加至46％，并且在3.60min和4.50min时降至
1.0％。流速为800μL/min。对于分析的每个样品，将最终提取溶液的0.5‑1.0μL单个固定等
分试样注入色谱柱。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇用
于针头清洗。使用以正MRM模式操作的配备Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 5500质谱
仪。表4中列出了可监测以用于以正MRM模式定量丝氨酸和泛酸的示例性离子。使用从每次
运行之前立即制备的强化校准标准物产生的加权线性最小二乘回归分析进行定量。在本实
施例中，分析来自64个个体的血浆样品，并且使用所述方法获得的分析物水平显示在表5
中。
的乙腈溶液。线性梯度洗脱在1％流动相B的初始条件下进行。流动相B在0.5min时保持在
1％，在2.50min时增加至16％，在3.50min时增加至46％，并且在3.60min和4.50min时降至
1.0％。流速为800μL/min。对于分析的每个样品，将最终提取溶液的0.5‑1.0μL单个固定等
分试样注入色谱柱。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇用
于针头清洗。使用以正MRM模式操作的配备Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 5500质谱
仪。表4中列出了可监测以用于以正MRM模式定量丝氨酸和泛酸的示例性离子。使用从每次
运行之前立即制备的强化校准标准物产生的加权线性最小二乘回归分析进行定量。在本实
施例中，分析来自64个个体的血浆样品，并且使用所述方法获得的分析物水平显示在表5
中。
[0162] LC‑MS/MS方法2：(2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸)
[0163] 在另一个实例中，开发了一种方法，其使用以正MRM模式和负MRM模式操作的质谱仪在单次注射中测量选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸的一种或多种、两种或更多种、以
及最多所有五种分析物的量。对于该方法，柱加热器设定为60℃，流动相A为0.0100％甲酸
的水溶液，流动相B为乙腈/甲醇(1:1)。线性梯度洗脱在5％流动相B的初始条件下进行。流
动相B在0.8min时增加至25％，在1.40min时增加至37％，在1.50和2.60min时增加至99％，
然后在2.70min时增加至0.5％。流速为550μL/min。对于分析的每个样品，将最终提取溶液
的0.5‑1.0μL单个固定等分试样注入色谱柱。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱
仪的电喷雾源中。甲醇用于针头清洗。使用对于2‑HB、3‑HB、4‑MOP和油酸以负MRM模式操作
和对于LGPC以正MRM模式操作的配备Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 5500质谱仪。表4
中列出了可以监测以用于定量2‑HB、3‑HB、4‑MOP、油酸和LGPC的示例性离子。
及最多所有五种分析物的量。对于该方法，柱加热器设定为60℃，流动相A为0.0100％甲酸
的水溶液，流动相B为乙腈/甲醇(1:1)。线性梯度洗脱在5％流动相B的初始条件下进行。流
动相B在0.8min时增加至25％，在1.40min时增加至37％，在1.50和2.60min时增加至99％，
然后在2.70min时增加至0.5％。流速为550μL/min。对于分析的每个样品，将最终提取溶液
的0.5‑1.0μL单个固定等分试样注入色谱柱。将来自色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱
仪的电喷雾源中。甲醇用于针头清洗。使用对于2‑HB、3‑HB、4‑MOP和油酸以负MRM模式操作
和对于LGPC以正MRM模式操作的配备Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 5500质谱仪。表4
中列出了可以监测以用于定量2‑HB、3‑HB、4‑MOP、油酸和LGPC的示例性离子。
[0164] LC‑MS/MS方法3：(2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸)
[0165] 开发了另一种方法以使用仅以负MRM模式操作的质谱仪在单次注射中测量选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸的一种或多种、两种或更多种、以及最多所有五种分析物的量。
质谱仪仅在负MRM模式下操作。来自64个个体的血浆样品掺入同位素标记的内标并用甲醇
进行蛋白质沉淀。离心后，将上清液的等分试样注射到以负MRM模式操作的配备有C18反相柱
的Agilent 1290/AB Sciex QTrap 5500LC/MS/MS系统上。相对于各个内标产物离子的峰面
积测量各产物离子的峰面积。表2中列出了可监测以用于以负MRM模式定量2‑HB、3‑HB、4‑
MOP、油酸和LGPC的示例性离子。使用从每次运行之前立即制备的强化校准标准物产生的加
权线性最小二乘回归分析进行定量。使用所述方法获得的分析物水平显示在表5中。
质谱仪仅在负MRM模式下操作。来自64个个体的血浆样品掺入同位素标记的内标并用甲醇
进行蛋白质沉淀。离心后，将上清液的等分试样注射到以负MRM模式操作的配备有C18反相柱
的Agilent 1290/AB Sciex QTrap 5500LC/MS/MS系统上。相对于各个内标产物离子的峰面
积测量各产物离子的峰面积。表2中列出了可监测以用于以负MRM模式定量2‑HB、3‑HB、4‑
MOP、油酸和LGPC的示例性离子。使用从每次运行之前立即制备的强化校准标准物产生的加
权线性最小二乘回归分析进行定量。使用所述方法获得的分析物水平显示在表5中。
[0166] 表5.使用方法1(丝氨酸、泛酸)和方法3(2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC和油酸)在血浆中测量的分析物浓度
[0167]
[0168]
[0169] LC‑MS/MS方法4：(2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC、油酸、丝氨酸和泛酸)
[0170] 在另一个实例中，开发了一种方法，其使用以负MRM模式操作的质谱仪在单次注射中测量选自2‑HB、3‑HB、4‑MOP、LGPC、油酸、丝氨酸和泛酸中的一种或多种、两种或更多种、
以及最多所有七种分析物的量。制备来自73个个体的血浆样品和来自30个个体的血清样
品，并如上文一般方法中所述进行反相液相色谱。所描述的反相色谱法分离出具有良好峰
形的多个分析物(最多七种)。所有七种分析物的峰显示在图8A中，来自相应内标的峰显示
在图8B中。所述方法获得了代谢物4‑MOP和3‑MOP的分离，如图8A所示，对于4‑MOP保留时间
为1.09min，对于3‑MOP保留时间为1.04min。每个分析物(和相应的内标)的目标峰的保留时
间由星形表示。
以及最多所有七种分析物的量。制备来自73个个体的血浆样品和来自30个个体的血清样
品，并如上文一般方法中所述进行反相液相色谱。所描述的反相色谱法分离出具有良好峰
形的多个分析物(最多七种)。所有七种分析物的峰显示在图8A中，来自相应内标的峰显示
在图8B中。所述方法获得了代谢物4‑MOP和3‑MOP的分离，如图8A所示，对于4‑MOP保留时间
为1.09min，对于3‑MOP保留时间为1.04min。每个分析物(和相应的内标)的目标峰的保留时
间由星形表示。
[0171] 使用AB Sciex QTrap 5500质谱仪对分离的样品进行MS/MS。仪器以负多反应监测(MRM)模式操作，该方法分为两个时间段，第二个时间段从1.33min开始。第一个时间段检测
到2‑HB、3‑HB、4‑MOP、丝氨酸和泛酸，第二个时间段检测到油酸和LGPC。对于这两个时间段，
离子喷雾电压设定为‑4.5kV，源温度设定为550℃，幕帘气体设定为30，喷雾器和去溶剂化
气体流速设定为70，碰撞激活解离(CAD)气体设定为低。表1中描述了详细的MS设置。发现所
有分析物在电喷雾条件下以负模式良好离子化，这是出乎意料的，因为通常使用正模式条
件测量丝氨酸、LGPC和泛酸。在该方法中监测以用于定量的离子是表2中列出的子离子，例
外是油酸，对于其是监测母离子。可以监测以用于以负MRM模式定量2‑HB、3‑HB、4‑MOP、油
酸、LGPC、泛酸盐和丝氨酸的另外的示例性的离子列于表2中(“其他子离子”列)。
到2‑HB、3‑HB、4‑MOP、丝氨酸和泛酸，第二个时间段检测到油酸和LGPC。对于这两个时间段，
离子喷雾电压设定为‑4.5kV，源温度设定为550℃，幕帘气体设定为30，喷雾器和去溶剂化
气体流速设定为70，碰撞激活解离(CAD)气体设定为低。表1中描述了详细的MS设置。发现所
有分析物在电喷雾条件下以负模式良好离子化，这是出乎意料的，因为通常使用正模式条
件测量丝氨酸、LGPC和泛酸。在该方法中监测以用于定量的离子是表2中列出的子离子，例
外是油酸，对于其是监测母离子。可以监测以用于以负MRM模式定量2‑HB、3‑HB、4‑MOP、油
酸、LGPC、泛酸盐和丝氨酸的另外的示例性的离子列于表2中(“其他子离子”列)。
[0172] 使用Analyst 1.6.2软件(SciEx)获取并处理原始数据。对于定量，通过加权(1/2
x)线性最小二乘回归将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。得到的
校准曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的浓度。用于定量分析物和相应内标的母离子
和子离子显示在表2中。本实施例中描述的LC‑MS/MS方法导致在单次注射中定量多达七种
分析物，运行时间为2.21分钟。使用LC‑MS/MS方法4对30个血清样品获得的分析物水平显示
在表6中。血浆和血清样品的分析物水平相似。
x)线性最小二乘回归将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。得到的
校准曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的浓度。用于定量分析物和相应内标的母离子
和子离子显示在表2中。本实施例中描述的LC‑MS/MS方法导致在单次注射中定量多达七种
分析物，运行时间为2.21分钟。使用LC‑MS/MS方法4对30个血清样品获得的分析物水平显示
在表6中。血浆和血清样品的分析物水平相似。
[0173] 表6.测量的分析物浓度(血清样品)
[0174]
[0175] LC‑MS/MS方法4的分析验证
[0176] 使用血浆样品在三个相同的LC‑MS/MS系统上验证LC‑MS/MS方法4的分析性能。
[0177] 在血浆样品中以三个QC水平(低、中和高)评估在单次注射中测量多个七种分析物的方法的精确度。使用三个相同的仪器系统进行评估，并且针对每个仪器单独地和针对三
个仪器整体地确定针对每个QC水平获得的精确度。在每次运行中分析每个QC水平的五个重
复，其中每个仪器分析五次运行。在每个单独仪器的运行间CV计算中包括每个QC水平的总
共25个重复，并且在整体运行间CV计算中包括每个QC水平的所有75个重复。对于整体CV计
算(所有三种仪器)，每个QC水平的运行间CV小于5.8％。结果显示在表7中。对于每个QC水
平，每种仪器上所有分析物的运行内CV小于5.5％。对于4‑MOP、LGPC、油酸和丝氨酸，在40倍
2
范围内观察到线性响应(R>0.99)，对于2‑HB、3‑HB和泛酸，在80倍范围内观察到线性响应。
基于超过2500个单独样品的分析选择校准范围。
个仪器整体地确定针对每个QC水平获得的精确度。在每次运行中分析每个QC水平的五个重
复，其中每个仪器分析五次运行。在每个单独仪器的运行间CV计算中包括每个QC水平的总
共25个重复，并且在整体运行间CV计算中包括每个QC水平的所有75个重复。对于整体CV计
算(所有三种仪器)，每个QC水平的运行间CV小于5.8％。结果显示在表7中。对于每个QC水
平，每种仪器上所有分析物的运行内CV小于5.5％。对于4‑MOP、LGPC、油酸和丝氨酸，在40倍
2
范围内观察到线性响应(R>0.99)，对于2‑HB、3‑HB和泛酸，在80倍范围内观察到线性响应。
基于超过2500个单独样品的分析选择校准范围。
[0178] 表7.三个LC/MS系统上多个分析物的运行间精确度。
[0179]
[0180] 在所有三个LC/MS仪器系统上评估LLOQ的准确度和精确度。每种分析物的信噪比均大于5:1。在每次运行中分析LLOQ样品(在无脂肪酸的BSA溶液中制备)的五个重复，其中
每个仪器分析五次运行。在每个仪器的运行间计算中包括LLOQ的总共25个重复，其中在组
合仪器数据中包括75个重复。所有运行内和运行间的不准确度均低于16％，并且CV低于
9.9％；数据显示在表8中。这些结果表明，多种分析物在下限处的定量是高度准确和精确
的。
每个仪器分析五次运行。在每个仪器的运行间计算中包括LLOQ的总共25个重复，其中在组
合仪器数据中包括75个重复。所有运行内和运行间的不准确度均低于16％，并且CV低于
9.9％；数据显示在表8中。这些结果表明，多种分析物在下限处的定量是高度准确和精确
的。
[0181] 表8.LLOQ的运行间和运行内准确度和精确度
[0182]
[0183]
[0184] 为了评估提取过程中分析物的回收率，用已知浓度的分析物强化血浆QC样品。提取六个重复的加标血浆QC样品并与常规血浆QC样品一起分析。在减去常规QC样品中的量后
计算加标量的回收率。对于七种分析物，回收率确定为96.3％至103％。数据列于表9中。
计算加标量的回收率。对于七种分析物，回收率确定为96.3％至103％。数据列于表9中。
[0185] 表9.分析物的回收率
[0186]
[0187] 为了评估样品类型对分析物定量的干扰，进行使用内标溶液的柱后输注实验，同时分析在没有内标的情况下提取的10个血浆样品。通过与空白水提取物比较来评估在分析
物保留时间处内标信号的抑制或增强。三种分析物(油酸、LGPC和丝氨酸)表现出对内标信
号的干扰。分析物LGPC和油酸在十个血浆样品中显示适度的信号抑制。由于该测定中的共
洗脱内标是同位素标记的，因此对于分析物和内标，任何温和的样品类型效应应该类似地
发生。通过使用分析物与内标的峰面积比用于定量，因此在最终计算中补偿样品类型效应。
物保留时间处内标信号的抑制或增强。三种分析物(油酸、LGPC和丝氨酸)表现出对内标信
号的干扰。分析物LGPC和油酸在十个血浆样品中显示适度的信号抑制。由于该测定中的共
洗脱内标是同位素标记的，因此对于分析物和内标，任何温和的样品类型效应应该类似地
发生。通过使用分析物与内标的峰面积比用于定量，因此在最终计算中补偿样品类型效应。
[0188] 然而，由于其极性，丝氨酸与样品中未被反相柱保留(即溶剂前沿)的化合物共洗脱，并显示出显著的信号抑制。虽然同位素标记的内标应跟踪丝氨酸的离子化，但定量仍可
能受到潜在的共洗脱干扰的影响。
能受到潜在的共洗脱干扰的影响。
[0189] 当使用多分析物方法时，进行另外的实验以解决丝氨酸定量的准确性。经开发和验证用于单独定量丝氨酸的方法与用于测量多种分析物的反相液相色谱MS/MS方法(多分
析物方法)组合。
析物方法)组合。
[0190] 使用单独的丝氨酸PFPA方法(丝氨酸PFPA，LC‑MS/MS方法1)和多分析物方法分析五批次的总共318个患者血浆样品。使用Bland‑Altman图比较结果，如图9所示。X轴显示使
用丝氨酸PFPA方法测量时丝氨酸的浓度。y轴显示多分析物方法和丝氨酸PFPA方法之间的
百分比差异，计算为(100*(多分析物方法‑丝氨酸PFPA)/丝氨酸PFPA)。对于超过99％的样
品，丝氨酸PFPA方法和多分析物方法之间丝氨酸定量的差异小于14％，并且没有样品具有
大于22％的丝氨酸定量差异。
用丝氨酸PFPA方法测量时丝氨酸的浓度。y轴显示多分析物方法和丝氨酸PFPA方法之间的
百分比差异，计算为(100*(多分析物方法‑丝氨酸PFPA)/丝氨酸PFPA)。对于超过99％的样
品，丝氨酸PFPA方法和多分析物方法之间丝氨酸定量的差异小于14％，并且没有样品具有
大于22％的丝氨酸定量差异。
[0191] 表10.显示了2、3、4、5和6种分析物的组合。
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