多肽、其生产方法和用途

摘要

本发明涉及多肽、其生产方法和用途。所述多肽包含N端区域和C端区域，其中所述N端区域包含SEQ ID No.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端序列；其中所述C端区域包含以SEQ ID No.14所示的序列GPPGPCCGGG或者包含以SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。本发明的多肽黏附效果明显优于商品化的人胶原蛋白的黏附效果。本发明的多肽具有抗HPV的性质。本发明为进一步优化治疗宫颈癌等HPV感染疾病提供了新的方法。

权利要求

1.多肽，所述多肽由SEQ ID No. 5或SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列组成。

2.多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的多肽。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸序列由SEQ ID No. 6的序列组成。

4.表达载体，其包含根据权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

7.根据权利要求1所述的多肽的生产方法，其包括：(1) 在生产培养基中培养根据权利要求5或6所述的宿主细胞并生产多肽；和(2) 收获并纯化多肽。

8.根据权利要求7所述的方法，其还包括对多肽进行酶切。

9.组合物，其包含根据权利要求1所述的多肽。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物、医疗器械、组织工程产品、化妆品或保健品。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述药物组合物是外用制剂。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述药物组合物是外用涂抹制剂。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述药物组合物是外用凝胶剂或外用浸润制剂。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述外用凝胶剂还包含药学上可接受的载体辅料，所述外用浸润制剂还包含具有权利要求1的多肽的无菌医用棉球。

15.根据权利要求1所述的多肽、权利要求2或3的多核苷酸、权利要求4的表达载体、权利要求5或6的宿主细胞、或权利要求9-14中任一项的组合物在制备医疗器械、组织工程产品、化妆品或保健品中的用途。

16.根据权利要求1所述的多肽、权利要求2或3的多核苷酸、权利要求4的表达载体、权利要求5或6的宿主细胞或权利要求9-14中任一项的组合物在制备用于预防或治疗HPV感染或HPV感染引起的疾病的产品中的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述HPV感染是指HPV检测呈阳性，所述HPV感染引起的疾病是指HPV持续感染引起的疾病。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述HPV持续感染引起的疾病是宫颈瘤样变、尖锐湿疣或宫颈癌。

19.根据权利要求16所述的用途，其中HPV是HPV16、18和/或58型。

20.根据权利要求1所述的多肽、权利要求2或3的多核苷酸、权利要求4的表达载体、权利要求5或6的宿主细胞或权利要求9-14中任一项的组合物在体外抑制HPV或结合HPV L1蛋白的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中HPV是HPV16、18和/或58型。

说明书

多肽、其生产方法和用途

[0001] 本申请要求2018年7月6日提交的、发明名称为“多肽、其生产方法和用途”的申请号201810736734.4的中国发明专利申请的优先权。

技术领域

[0002] 本发明属于基因工程技术领域，涉及多肽、其生产方法和用途。

背景技术

[0003] 宫颈癌和乳头瘤病毒

[0004] 宫颈癌在全球女性癌症发病率中排名第四，一直是国际医学领域的关注热点。该癌症被确认由人乳头瘤病毒(HPV)所引发，HPV具有200多种亚型，又可根据其致癌性可分为“低危”型和“高危”型，低危型流行度高的代表类型为HPV6、HPV11等，主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死。高危型包括HPV16、HPV18、HPV52、HPV58等，可引发宫颈癌。

[0005] 据WHO数据显示，2012年该疾病导致27万人的死亡。其中85％以上发生在低收入和中等收入国家。宫颈癌是生活在欠发达地区的妇女第二常患癌症，估计2012年有44.5万个新发病例，占全球新发病例的84％。随着我国性开放程度的加深，宫颈癌的发病率及发病年龄可能将有明显上升及提前的趋势。

[0006] 宫颈癌的发生发展与病毒持续性感染有关，目前对其的治疗主要是通过手术切除病灶，常用的治疗方法包括：循环电切手术(LEEP)、冷刀锥形切除术、电击疗法、冷凝和冷冻治疗法等。但由于HPV感染的特性，手术等方法无法起到预防病毒感染的作用，并且也不能完全清除病毒，复发率较高。目前针对人乳头瘤病毒上市了三种疫苗，这三种疫苗虽然能有效预防流行较广的HPV型的感染，并且能预防宫颈癌。但仍存在一定的局限性：例如(1)疫苗的接种范围有限。我国9价疫苗刚获批准，且一些年龄范围外的人群不适用；(2)型别局限性：已上市的这三种疫苗最多防止9种亚型人乳头瘤病毒的感染，但对其他HPV型别的感染无预防作用。从病毒生态学的角度，当主要的9种型别HPV被抑制后，其他型别的HPV可能成为主要流行株；(3)成本高、售价贵，限制了疫苗在发展中国家的推广；(4)当前疫苗均为预防性疫苗，对已感染人乳头瘤病毒的患者尚无临床数据支持具有治疗效果。因此，目前急需研发能够有效预防和控制HPV病毒感染的产品。

[0007] 受限于病毒学的发展以及人乳头瘤病毒的特性，目前世界上缺乏人乳头瘤病毒的活病毒系统来评价产品，且缺乏理想公认的动物模型，对于这种情况目前研究HPV产品公认的体外模型为HPV假病毒模型，该模型由HPV L1，L2蛋白和报告基因组成，是目前国内外学术界广泛使用来检测抗人乳头瘤病毒药物活性的体外模型。依靠此模型可以直观的评价产品活性。

[0008] 本发明提供了一种显著具有抗HPV活性的蛋白，为进一步优化治疗宫颈癌等HPV感染疾病提供了新的方法。

[0009] 胶原蛋白

[0010] 胶原蛋白一般为白色、透明、无分支的原纤维，是皮肤和骨骼的基础支撑物，可以占到蛋白质总量的25％～35％，主要分布于人体的皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨等处，是这些组织的主要基质和支架，保护并连结各种组织，在体内发挥着重要的生理功能。因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。

[0011] 当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中。以胶原蛋白的氨基酸组成而言：哺乳动物猪、牛与人的相似度为95％，鱼与人的相似度65％。虽然哺乳动物猪、牛等与人的胶原蛋白相似度较高，其仍然难以避免病毒感染以及致敏性的危险。而食用鱼类所萃取的胶原蛋白人体的利用率低于65％，无法完全被人体吸收与利用。所以其常用于食品运用，少部分运用于化妆品，但无法被用于医疗器械或较精密的组织工程产品。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。

[0012] 从结构上来说，人体天然的胶原蛋白的结构非常的复杂，所以才导致人源胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。胶原蛋白最普遍的结构特征是由3条肽链形成的三螺旋结构，即由3条A肽链以右手超螺旋方式形成蛋白质，这样的三股螺旋区域被称为胶原区域。每个A肽链在分子结构上都是由重复出现的Gly-X-Y(X、Y代表Gly之外的任何氨基酸残基，X往往是Pro，Y往往是Hyp)肽段构成左手螺旋，3条链在氨基酸残基的相互作用下，以同一轴为中心，以右手超螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。

[0013] 生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。大多数经过制备后的胶原蛋白产品，拉伸强度较弱；纯胶原蛋白在体内降解较快，以及可能存在潜在的抗原性等，同时由于胶原蛋白的来源、加工工艺和原料配比的差异，产品的营养成分及饲用价值也不相同，且皮料在加工过程中不仅要接触许多化学物质，且易受到细菌的感染，严重限制了胶原蛋白的应用。虽然国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。

发明内容

[0014] 本发明部分基于以下发现：

[0015] 1.本发明的多肽C2R1T、C2R4T、C2R5T和C2R10T与现有人胶原蛋白相比具有相当或更高的细胞粘附效果；和

[0016] 2.本发明的治疗人乳头瘤病毒感染的蛋白C2R1T通过实验研究，可在HPV假病毒感染模型上，有效抑制HPV16，HPV18和HPV58高危型人乳头瘤病毒的感染。本发明经过实验数据揭示该抗病毒蛋白的作用机制是：C2R1T蛋白特异地与HPV L1蛋白结合，从而抑制病毒感染细胞。通过机制研究发现蛋白作用在病毒感染的早期阶段—病毒入侵阶段，并且不具有灭活效应。

[0017] 3.实验证明C2R1T蛋白主要依靠核心序列R1P4 GEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPP(SEQ ID NO:18)起到结合病毒蛋白作用，与其他同样来自C2R1T的多肽相比较R1P4具有抗病毒活性，其他序列不具有良好的抗病毒活性。本发明的目的之一在于提供可抑制人乳头瘤病毒感染的活性蛋白，通过对病毒的抑制从而改变疾病进程。主要思路在于通过抑制HPV入侵靶细胞，从而阻断病毒持续性感染，最终降低病毒量，及预防/治疗其所引发的宫颈癌等疾病。

[0018] 针对上述现有技术的缺陷，本发明提供了：

[0019] 1.多肽，所述多肽包含N端区域和C端区域，

[0020] 其中所述N端区域包含SEQ ID No.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端序列；

[0021] 其中所述C端区域包含以SEQ ID No.14所示的序列GPPGPCCGGG；

[0022] 其中优选地，所述多肽是胶原蛋白多肽，优选是人源胶原蛋白多肽；

[0023] 其中优选地，所述N端区域包含N端序列的n个重复，n为大于等于1的整数，优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

[0024] 其中优选地，当n为大于等于2的整数时，各个N端序列是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基；

[0025] 其中优选地，所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基，条件是所述多肽具有细胞粘附活性；或者

[0026] 所述多肽包含(1)以SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列；或者(3)与以SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％序列同一性的序列，条件是多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16、18和/或58型活性。

[0027] 2.根据项1所述的多肽，其中所述N端序列包含选自下组的序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4或这些中的任一种序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的序列。

[0028] 3.根据项1或2所述的多肽，其包含(1)SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、或SEQ ID No.11的氨基酸序列；(2)SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、或SEQ ID No.11的氨基酸序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列；或者(3)与SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、或SEQ ID No.11的氨基酸序列具有83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％序列同一性的序列，条件是所述多肽具有细胞粘附活性或者所述多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16、18和/或58型活性。

[0029] 4.多核苷酸，其编码根据项1-3中任一项所述的多肽，其中所述多核苷酸优选是SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、或SEQ ID No.12。

[0030] 5.表达载体，其包含根据项4所述的多核苷酸。

[0031] 6.宿主细胞，其包含根据项5所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选是大肠杆菌。

[0032] 7.根据项1-3中任一项所述的多肽的生产方法，其包括：

[0033] (1)在生产培养基中培养根据项6所述的宿主细胞并生产多肽；

[0034] (2)收获并纯化多肽；和

[0035] (3)任选地对多肽进行酶切。

[0036] 8.组合物，其包含根据项1-3中任一项所述的多肽，其中所述组合物优选是药物组合物、医疗器械、组织工程产品、化妆品或保健品，优选地所述药物组合物是外用制剂，优选外用涂抹制剂，例如外用凝胶剂或外用浸润制剂；其中优选地所述外用凝胶剂还包含药学上可接受的载体辅料，所述外用浸润制剂还包含具有项1-3中任一项所述的多肽的无菌医用棉球。

[0037] 9.根据项1-3中任一项所述的多肽、项4的多核苷酸、项5的表达载体、项6的宿主细胞、或项8的组合物在制备组合物，优选医疗器械、组织工程产品、化妆品、保健品中的用途，或根据项1-3中任一项所述的多肽、项4的多核苷酸、项5的表达载体、项6的宿主细胞或项8的组合物在制备用于预防或治疗HPV感染或HPV感染引起的疾病的产品中的用途，其中优选地所述HPV感染是指HPV检测呈阳性，所述HPV感染引起的疾病是指HPV持续感染引起的疾病，优选宫颈瘤样变、尖锐湿疣或宫颈癌，其中HPV优选是抗HPV16、18和/或58型。

[0038] 10.根据项1-3中任一项所述的多肽、项4的多核苷酸、项5的表达载体、项6的宿主细胞或项8的组合物促进细胞粘附或在体外抑制HPV或结合HPV L1蛋白的用途，其中HPV优选是抗HPV16、18和/或58型。

[0039] 11.预防或治疗HPV感染或HPV感染引起疾病的方法，其包括以下步骤：将根据项1-3中任一项所述的多肽或项8的组合物覆盖或涂抹于患者的宫颈部位，其中优选地所述HPV感染是指HPV检测呈阳性，所述HPV感染引起的疾病是指HPV持续感染引起的疾病，优选宫颈瘤样变、尖锐湿疣或宫颈癌，其中HPV优选是抗HPV16、18和/或58型。

[0040] 12.根据项1-3中任一项所述的多肽、项4的多核苷酸、项5的表达载体、项6的宿主细胞或项8的组合物，用于促进细胞粘附或在体外抑制HPV或预防或治疗HPV感染或HPV感染引起疾病或结合HPV L1蛋白，其中优选地所述HPV感染是指HPV检测呈阳性，所述HPV感染引起的疾病是指HPV持续感染引起的疾病，优选宫颈瘤样变、尖锐湿疣或宫颈癌，其中HPV优选是抗HPV16、18和/或58型。

[0041] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：

[0042] (1)本发明选择的胶原蛋白序列为首次经过长期筛选优化获得的II型胶原蛋白功能区序列；

[0043] (2)采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，20小时即可完成一轮发酵，生产成本非常低，由于对基因序列进行了大肠杆菌的密码子优化以及选用2×YT培养基，使得产量非常大；

[0044] (3)生产的人源化II型胶原蛋白具有非常好的亲水性和稳定性，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100％相同，应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业；

[0045] (4)本发明产品经过活性检测，具有达到甚至超过人体天然蛋白的生物学活性，是目前报道过的最优化的胶原蛋白设计方案，可以在人体中行使天然蛋白的功能，达到真正的产品应用的目的。

[0046] (5)本发明的治疗人乳头瘤病毒感染的蛋白C2R1T通过实验研究，可在HPV假病毒感染模型上，有效抑制HPV16，HPV18和HPV58高危型人乳头瘤病毒的感染。

附图说明

[0047] 图1为本发明载体pET32a-C2R1T、pET32a-C2R4T、PET32a-C2R5T、PET32a-C2R10T构建的质粒图谱。

[0048] 图2为本发明C2R1T蛋白纯化酶切后得到的目的蛋白电泳图；C2R1T蛋白的电泳检测分子量约为30kDa，对应于包含SEQ ID NO.5的氨基酸序列的蛋白质。

[0049] 图3为本发明C2R4T蛋白纯化酶切后得到的目的蛋白电泳图；C2R4T蛋白的电泳检测分子量约为36kDa，对应于包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的蛋白质。

[0050] 图4为本发明C2R5T蛋白纯化酶切后得到的目的蛋白电泳图；C2RT1蛋白的电泳检测分子量约为34kDa，对应于包含SEQ ID NO.9的氨基酸序列的蛋白质。

[0051] 图5为本发明C2R10T蛋白纯化酶切后得到的目的蛋白电泳图；C2RT1蛋白的电泳检测分子量约为25kDa，对应于包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列的蛋白质。

[0052] 图6为本发明C2R1T蛋白与人胶原蛋白相比较的生物活性检测结果。

[0053] 图7为本发明C2R4T蛋白与人胶原蛋白相比较的生物活性检测结果。

[0054] 图8为本发明C2R5T蛋白与人胶原蛋白相比较的生物活性检测结果。

[0055] 图9为本发明C2R10T蛋白与人胶原蛋白相比较的生物活性检测结果。

[0056] 图10A-C：C2R1T对HPV16、18和58均具有抑制活性，每个样品设三个复孔，数据以平均值(means)±标准差(SD)表示。

[0057] 图11：C2R1T重复单元序列及相关多肽R1P1、R1P2、R1P3和R1P4序列。

[0058] 图12A-D：病毒抑制实验显示R1P4具有抑制活性，而其他三条多肽不具备抑制活性，IC50无法计算。

[0059] 图13：TIME-REMOVAL实验结果显示C2R1T不作用于靶细胞。排除蛋白的抗病毒效应是由于针对靶细胞而引起的。

[0060] 图14：灭活实验显示C2R1T蛋白不具有灭活活性。

[0061] 图15：ELISA结果显示C2R1T及R1P4可以与HPV16型L1结合，以JB01为阳性对照，BSA为阴性对照。

具体实施方式

[0062] 下文提供进一步的描述以便于理解本发明。

[0063] 如本文中使用，“医疗器械”是指直接或者间接用于人体的仪器、设备、器具、体外诊断试剂及校准物、材料以及其他类似或者相关的物品。

[0064] 如本文中使用，“组织工程产品”是指用于组织工程的产品。组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。

[0065] 在本发明中，选择II型胶原蛋白序列为筛选优化的序列。所述人胶原II型的序列是NCBI参照序列：NM_001844.4(SEQ ID No.13)，参见

[0066]

[0067] 上述序列中粗体下划线部分即为本发明选择的氨基酸序列。申请人经过大量的研究发现，选择的上述序列比商品化的人胶原蛋白或SEQ ID No.13中的其他序列实现更好的粘附效果。在本发明中，多肽不是SEQ ID No.13的全长序列。

[0068] 本发明部分基于以下发现：包含SEQ ID No.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端区域和以SEQ ID No.14所示的序列GPPGPCCGGG的C端区域的多肽能够比商品化的人胶原蛋白实现更好的粘附效果，如实施例证明。本领域技术人员可以适当选择构成N端区域的连续的氨基酸残基。例如，连续的氨基酸残基的长度可以是48-100、50-72、54-57、48-72等等。

[0069] 在本发明中，对几种具体的N端区域的序列进行了测试：

[0070] (1)GPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQ(SEQ ID No.1)；

[0071] (2)GDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKA(SEQ ID No.2)；

[0072] (3)GPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPT GVTGPKGARGAQGPP(SEQ ID No.3)；

[0073] (4)GEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGL KGHRGFT(SEQ ID No.4)。

[0074] 在本发明中，C端氨基酸序列可以为GPPGPCCGGG(SEQ ID No.14)，该序列增强胶原活性的端序列肽段。

[0075] 多肽在本文中可以是人源化II型胶原蛋白C2R1T，为单链结构，包括氨基酸226个，基本重复单元为GPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEG PPGPQ(SEQ ID No.1)，为人胶原蛋白II型肽段，C端氨基酸序列为GPPGPCCGGG(SEQ ID No.14)，为增强胶原活性的端序列肽段。C2R1T的氨基酸序列如下：GPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGPPGPCCGGG(SEQ ID No.5)。C2R1T的DNA序列如下：GGTCCTAGTGGTAAAGATGGTCCGAAAGGTGCACGTGGTGATAGTGGTCCGCCGGGTCGTGCAGGTGAACCGGGTCTGCAGGGTCCGGCAGGTCCGCCTGGTGAGAAAGGTGAACCGGGCGATGATGGGCCGAGCGGTGCCGAAGGTCCTCCTGGTCCGCAAGGTCCGTCTGGTAAAGATGGGCCGAAAGGTGCCAGAGGGGATAGTGGGCCGCCGGGTAGAGCAGGTGAACCTGGGCTGCAGGGTCCTGCAGGTCCGCCAGGTGAAAAAGGGGAACCAGGTGATGATGGACCAAGCGGTGCAGAAGGTCCGCCGGGCCCTCAGGGTCCTAGCGGTAAAGATGGCCCGAAAGGTGCGAGAGGTGATAGCGGACCGCCGGGAAGAGCAGGAGAACCAGGACTGCAGGGACCGGCAGGTCCTCCGGGTGAAAAAGGTGAACCAGGTGACGATGGGCCGAGTGGTGCAGAAGGACCGCCGGGTCCGCAGGGACCAAGCGGCAAAGACGGACCGAAAGGAGCAAGAGGAGATAGTGGACCGCCGGGCCGGGCAGGTGAACCAGGCTTACAGGGTCCGGCGGGTCCGCCAGGAGAAAAAGGGGAGCCGGGTGATGATGGGCCAAGCGGAGCAGAAGGACCTCCGGGTCCGCAAGGACCTCCAGGTCCATGTTGTGGAGGTGGG(SEQ ID No.6)。

[0076] 多肽在本文中可以是人源胶原蛋白C2R4T，为单链结构，包括298个氨基酸，基本重复单元为GDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQG ARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKA(SEQ ID No.2)，为人胶原蛋白II型肽段，C端氨基酸序列为GPPGPCCGGG(SEQ ID No.14)，为增强胶原活性的端序列肽段。C2R4T的氨基酸序列如下：GDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGPPGPCCGGG(SEQ ID No.7)。C2R4T的DNA序列如下：GGTGATCCGGGTCGTCCGGGTGAACCGGGTCTGCCTGGTGCGCGTGGTCTGACAGGTCGTCCGGGAGATGCGGGGCCGCAGGGTAAAGTTGGGCCGAGCGGGGCGCCGGGTGAAGATGGTCGTCCGGGCCCTCCGGGTCCGCAAGGTGCAAGAGGTCAGCCTGGTGTTATGGGTTTTCCTGGTCCGAAAGGTGCAAATGGGGAGCCGGGTAAAGCAGGTGATCCGGGAAGACCGGGTGAACCTGGTCTGCCTGGCGCCAGAGGGTTAACAGGTCGTCCTGGTGATGCAGGTCCGCAGGGTAAGGTTGGTCCGTCGGGAGCACCGGGTGAAGACGGTAGACCGGGTCCGCCTGGGCCGCAAGGTGCTAGAGGTCAGCCGGGTGTGATGGGTTTTCCGGGTCCGAAAGGGGCAAATGGGGAACCGGGTAAAGCGGGGGACCCTGGGCGTCCAGGTGAACCTGGCCTGCCGGGTGCAAGAGGATTAACAGGTCGGCCGGGGGATGCAGGTCCTCAAGGGAAAGTGGGTCCGAGCGGTGCACCGGGTGAGGATGGGAGACCGGGTCCTCCGGGGCCACAAGGTGCACGTGGTCAGCCGGGGGTGATGGGTTTCCCGGGGCCTAAAGGGGCAAACGGTGAGCCGGGTAAGGCAGGTGATCCAGGTCGGCCGGGTGAACCAGGTCTGCCGGGTGCTCGTGGTTTAACAGGTCGCCCGGGTGATGCGGGTCCTCAGGGTAAAGTGGGTCCTAGCGGGGCACCTGGAGAAGATGGGCGTCCGGGTCCTCCTGGGCCGCAGGGCGCACGTGGTCAACCTGGTGTTATGGGGTTTCCTGGTCCTAAAGGTGCAAACGGGGAACCGGGCAAAGCAGGACCGCCGGGTCCGTGTTGTGGTGGTGGT(SEQ ID No.8)。

[0077] 多肽在本文中可以是人源胶原蛋白C2R5T，为单链结构，包括氨基酸238个，基本重复单元为GPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPK GARGAQGPP(SEQ ID No.3)，为人胶原蛋白II型肽段，C端氨基酸序列为GPPGPCCGGG(SEQ ID No.14)，为增强胶原活性的端序列肽段。C2R5T的氨基酸序列如下：GPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGPPGPCCGGG(SEQ ID No.9)。C2R5T的DNA序列如下：

[0078] GGTCCTCCTGGTGCAGATGGTCAGCCGGGTGCAAAAGGTGAACAGGGTGAAGCAGGTCAGAAAGGTGATGCAGGGGCACCGGGTCCGCAGGGTCCTAGTGGTGCACCGGGTCCTCAGGGTCCGACCGGTGTAACCGGTCCGAAAGGAGCAAGAGGTGCACAGGGACCGCCGGGTCCACCGGGTGCAGATGGACAGCCTGGTGCAAAAGGGGAACAGGGTGAGGCAGGTCAGAAGGGTGATGCAGGTGCACCAGGACCGCAGGGACCGAGCGGTGCACCAGGTCCTCAGGGCCCAACCGGGGTTACCGGTCCGAAGGGGGCAAGAGGAGCACAGGGACCACCGGGACCACCGGGTGCTGATGGTCAGCCTGGAGCAAAAGGAGAACAGGGGGAAGCAGGGCAAAAAGGAGATGCAGGTGCGCCGGGACCGCAGGGTCCAAGTGGAGCACCAGGACCACAAGGACCGACCGGTGTGACGGGTCCGAAAGGGGCAAGAGGGGCACAGGGACCTCCAGGTCCGCCGGGTGCAGACGGTCAGCCTGGTGCTAAAGGGGAACAAGGAGAAGCAGGACAAAAAGGAGACGCAGGTGCGCCAGGACCGCAAGGTCCGAGCGGTGCTCCAGGTCCACAGGGTCCCACCGGTGTTACAGGTCCAAAAGGGGCACGCGGAGCACAGGGGCCGCCAGGTCCTCCTGGACCTTGTTGTGGTGGTGGT(SEQ ID No.10)。

[0079] 多肽在本文中可以是人源胶原蛋白C2R10T，为单链结构，包括氨基酸202个，基本重复单元为GEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFT(SEQ ID No.4)，为人胶原蛋白II型肽段，C端氨基酸序列为GPPGPCCGGG，为增强胶原活性的端序列肽段。C2R10T的氨基酸序列如下：

[0080] GEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGPPGPCCGGG(SEQ ID No.11)。C2R10T的DNA序列如下：

[0081] GGTGAAGCAGGTGCGCAGGGTCCGATGGGGCCGAGTGGTCCTGCGGGTGCAAGAGGAATTCAGGGTCCGCAGGGGCCGAGAGGGGATAAAGGAGAAGCAGGGGAACCGGGTGAAAGAGGGCTGAAAGGTCATAGAGGGTTTACGGGTGAAGCAGGAGCACAGGGACCGATGGGACCGAGCGGACCGGCAGGAGCAAGAGGAATACAGGGACCGCAGGGACCGAGAGGAGATAAAGGTGAAGCAGGGGAGCCGGGAGAAAGAGGACTGAAAGGACATAGAGGATTTACAGGAGAAGCAGGAGCGCAGGGACCGATGGGGCCAAGCGGACCTGCAGGAGCACGGGGAATACAGGGTCCGCAAGGACCGAGAGGGGACAAAGGAGAAGCGGGAGAACCGGGAGAGAGAGGACTGAAGGGACATAGAGGGTTCACGGGTGAAGCCGGAGCACAAGGACCGATGGGTCCGAGCGGGCCGGCAGGTGCAAGAGGTATACAGGGACCACAGGGACCGCGGGGAGATAAAGGAGAGGCAGGAGAACCGGGTGAGAGAGGATTAAAAGGACATCGGGGATTTACCGGTCCGCCGGGACCATGTTGTGGTGGGGGG(SEQ ID No.12)。

[0082] 本发明还部分基于以下发现：治疗人乳头瘤病毒感染的蛋白C2R1T通过实验研究，可在HPV假病毒感染模型上，有效抑制HPV16，HPV18和HPV58高危型人乳头瘤病毒的感染。本发明经过实验数据揭示该抗病毒蛋白的作用机制是：C2R1T蛋白特异地与HPV L1蛋白结合，从而抑制病毒感染细胞。通过机制研究发现蛋白作用在病毒感染的早期阶段—病毒入侵阶段，并且不具有灭活效应。实验证明C2R1T蛋白主要依靠核心序列R1P4GEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPP(SEQ ID NO:18)起到结合病毒蛋白作用，与其他同样来自C2R1T的多肽相比较R1P4具有抗病毒活性，其他序列不具有良好的抗病毒活性。本发明的目的之一在于提供可抑制人乳头瘤病毒感染的活性蛋白，通过对病毒的抑制从而改变疾病进程。主要思路在于通过抑制HPV入侵靶细胞，从而阻断病毒持续性感染，最终降低病毒量，及预防/治疗其所引发的宫颈癌等疾病。

[0083] 在本文中，多肽可以包括以SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO:18中任一种所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入了1个或多个，优选2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列或与SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO:18中任一种所示的氨基酸序列具有83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％序列同一性的氨基酸序列。

[0084] 氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO:18中任一种的C端或N端添加氨基酸，只要所述多肽具有细胞粘附活性或者所述多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16活性。

[0085] 氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO:18中任一种的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要所述多肽具有细胞粘附活性或者所述多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16活性。

[0086] 氨基酸插入指在氨基酸序列例如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO:18中任一种的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要所述多肽具有细胞粘附活性或者所述多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16活性。

[0087] 氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO:18中任一种的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要所述多肽具有细胞粘附活性或者所述多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16活性。

[0088] 在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11和SEQ ID NO：18中任一种的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。

[0089] 表1：氨基酸保守取代

[0090]最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0091] 本文的多肽序列中的所有氨基酸可为L型氨基酸，其中的一个或多个(如2-5个、2-4个或2-3个)氨基酸也可以用构象为D型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。其中D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。

[0092] 在本发明中，人源化II型胶原蛋白可以通过本领域中常规的方法进行。例如，可以如下步骤生产：(1)大肠杆菌基因工程菌的构建；(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；(3)人源化II型胶原蛋白的诱导和表达；以及(4)人源化II型胶原蛋白的纯化和任选的酶切。

[0093] 在步骤(1)中，大肠杆菌基因工程菌的构建可以如下进行：(1)利用PCR方法对人源性II型胶原蛋白的基因螺旋区的DNA片段进行密码子优化和拼接重组，最终得到目的基因片段；(2)将得到的目的基因片段插入PET-32a表达载体中得到重组表达质粒；(3)将重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。

[0094] 在步骤(2)与(3)中，大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和人源化II型胶原蛋白的诱导和表达可以如下进行：(1)从LAB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于10ml的LB培养基中37℃，220rpm培养12-16小时；(2)将菌液按照1：100接种到2×YT培养基中放大培养，37℃培养约3小时，待OD600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，
16℃继续培养20小时，离心收集菌体。

[0095] 在步骤(4)中，人源化II型胶原蛋白多肽的纯化和酶切可以如下进行：(1)用磷酸盐缓冲液(40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；(2)利用NI-NTA亲和柱结合人源化II型胶原蛋白，10mM咪唑漂洗杂蛋白后，加入Prescission Protease(PPase)蛋白酶4℃，16h柱上酶切，最后获得目的胶原蛋白多肽。

[0096] 宿主细胞可以是真核细胞，例如真菌和酵母，原核细胞，例如肠杆菌科细菌。应当理解，本领域技术人员可以通过用其它表达菌株替换上述大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

[0097] 实施例

[0098] 提供以下实施例来阐述本发明。本领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性的而非限制性的。本发明仅仅由所附权利要求书的范围限定。

[0099] 实施例1：人源化II型胶原蛋白多肽的构建及表达

[0100] C2R1T基因表达载体的构建及表达

[0101] 1.实施例1中使用的人源胶原蛋白C2R1T全长基因序列以SEQ ID No.6显示。该序列已经针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化。

[0102] 2.C2R1T基因全长678bp，根据优化后的C2R1T密码子基因序列SEQ ID No.6，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的C2R1T基因片段通过BamH I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入PET32a表达载体。将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(Merck公司)。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。

[0103] 3.从转化好的LB平板中挑取单克隆菌落于10ml LB(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×YT培养基(16g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液OD600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG(Sigma公司，货号：I5502-1G)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。

[0104] 4.用磷酸盐缓冲液(pH 7.8)(40mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠)约50ml重悬(1L)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体充分分离。

[0105] 5.用5倍柱体积的结合缓冲液(Binding buffer)(40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)平衡Ni-NTA(Qiagen公司，货号：30210)亲和柱。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育
0.5-1h，使目的蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mM咪唑(Sigma公司)的洗涤缓冲液(washing buffer)(10mM咪唑，40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有His标签的Prescission Protease(简称PPase)(Sigma,SAE0045)蛋白酶，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。

[0106] 6.所得C2R1T蛋白利用SDS-PAGE检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。

[0107] C2R4T基因表达载体的构建及表达

[0108] 1.人源胶原蛋白C2R1T全长基因序列以SEQ ID No.8显示。该序列已经针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化。

[0109] 2.C2R4T基因全长894bp，根据优化后的C2R4T密码子基因序列，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的C2R1T基因片段通过BamH I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入PET32a表达载体。将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(Merck公司)。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LAB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。

[0110] 3.从转化好的LB平板中挑取单克隆菌落于10ml LB(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×YT培养基(16g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液OD600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG(Sigma公司，货号：I5502-1G)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。

[0111] 4.用磷酸盐缓冲液(pH 7.8)(40mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠)约50ml重悬(1L)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体充分分离。

[0112] 5.用5倍柱体积的结合缓冲液(Binding buffer)(40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司,货号：30210)。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育
0.5-1h，使目的蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mM咪唑(Sigma公司)的洗涤缓冲液(washing buffer)(10mM咪唑，40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有His标签的Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶(Sigma,SAE0045)，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。

[0113] 6.所得C2R4T蛋白利用SDS-PAGE检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。

[0114] C2R5T基因表达载体的构建及表达

[0115] 1.人源胶原蛋白C2R1T全长基因序列以SEQ ID No.10显示。该序列已经针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化。

[0116] 2.C2R5T基因全长715bp，根据优化后的C2R5T密码子基因序列，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的C2R1T基因片段通过BamH I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入PET32a表达载体。将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(Merck公司)。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LAB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。

[0117] 3.从转化好的LB平板中挑取单克隆菌落于10ml LB(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×YT培养基(16g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液OD600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG(Sigma公司，货号：I5502-1G)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。

[0118] 4.用磷酸盐缓冲液(pH 7.8)(40mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠)约50ml重悬(1L)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体充分分离。

[0119] 5.用5倍柱体积的结合缓冲液(Binding buffer)(40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)平衡Ni-NTA(Qiagen公司,货号：30210)亲和柱。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育
0.5-1h，使目的蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mM咪唑(Sigma公司)的洗涤缓冲液(washing buffer)(10mM咪唑，40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有His标签的Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶(Sigma,SAE0045)，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。

[0120] 6.所得C2R5T蛋白利用SDS-PAGE检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。

[0121] C2R10T基因表达载体的构建及表达

[0122] 1.人源胶原蛋白C2R1T全长基因序列以SEQ ID No.12显示。该序列已经针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化。

[0123] 2.C2R10T基因全长606bp，根据优化后的C2R10T密码子基因序列，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的C2R1T基因片段通过BamH I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入PET32a表达载体。将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(Merck公司)。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LAB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。

[0124] 3.从转化好的LB平板中挑取单克隆菌落于10ml LB(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×YT培养基(16g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液OD600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG(Sigma公司，货号：I5502-1G)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。

[0125] 4.用磷酸盐缓冲液(pH 7.8)(40mM磷酸二氢钠，500mM氯化钠)约50ml重悬(1L)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体充分分离。

[0126] 5.用5倍柱体积的结合缓冲液(Binding buffer)(40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司,货号：30210)。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育
0.5-1h，使目的蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mM咪唑(Sigma公司)的洗涤缓冲液(washing buffer)(10mM咪唑，40mM NaH2PO3，500mM NaCl，pH 7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有His标签的Prescission Protease(简称PPase)蛋白酶(Sigma,SAE0045)，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。

[0127] 6.所得C2R10T蛋白利用SDS-PAGE检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl 5x的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。

[0128] 结果

[0129] 图2-图5的电泳图分别表明得到表观分子量30kDa、36kDa、34kDa和25kDa的C2R1T、C2R4T、C2R5T、和C2R10T，分子量分别对应于SEQ ID NO:5、7、9和11的氨基酸序列的多肽。

[0130] 实施例2 C2R1T、C2R4T、C2R5T和C2R10T蛋白的活性检测

[0131] 胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：

[0132] 1、利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括对照人胶原蛋白(Sigma，C7774)、C2R1T、C2R4T、C2R5T，和C2R10蛋白样品。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144X(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为Walker JM.The Protein Protocols Handbook,second edition.Humana 
Press.43-45)。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。

[0133] 2、向96孔板中加入100μl各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min。

[0134] 3、每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞(来自清华大学童佩老师)，37℃孵育60min。

[0135] 4、每孔用PBS清洗4次。

[0136] 5、用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测OD492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细胞贴壁率＝(测试孔-空白孔)×100％/(阳性孔-空白孔)。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。

[0137] 结果参见图6至图9。

[0138] 图6至图9的结果表明，四种人源化II型胶原蛋白(即C2R1T、C2R4T、C2R5T，和C2R10)与商品化的人胶原蛋白相比，皆具有很好的黏附活性。其中C2R4T与C2R10T的黏附效果明显优于商品化的人胶原蛋白。

[0139] 实施例3：HPV 16、18、58型假病毒的制备

[0140] HPV 16、18、58型HPV假病毒的制备(可参考文献：Lu,L.,Yang,X.,Li,Y.,Jiang,S.(2013).Chemically modified bovine beta-lactoglobulin inhibits human papilloma virus infection.Microb.Infect.Mar 19.15(6-7):506-10，该文献及其中引用的文献通过并用并入.)。具体地，将293T细胞( CRL-3216)以2×105接种至35mm平皿，37℃，5％CO2培养24h，然后用转染试剂VigoFec(Vigorous)根据制造商的用法说明将HPV假病毒质粒(addgene，p16sheLL，#37320，HPV16；p18sheLL，#37321，HPV18；p58sheLL，#37324，HPV58；2.5μg)与报告基因质粒(pCLucf，addgene，2.5μg)共转染293T细胞，然后于37℃，5％CO2培养过夜，转染6小时后更换新的培养液20ml(2％FBS DMEM，美伦，MA0212)，48小时后用胰酶(美伦，MB4375)5ml消化至看到细胞不贴壁，离心(1000rpm，3min)去上清，用10％Triton X-100裂解细胞，37℃放置过夜，第二天离心(12000rpm，2min，4℃)取上清分管收集-80℃保存备用。

[0141] 实施例4：HPV感染抑制实验

[0142] 2.1实验材料与方法

[0143] 2.1.1检测蛋白抑制HPV 16、18、58型HPV假病毒感染Hela细胞( CCL-2)的活性的方法如下：将制备的蛋白样品C2R1T(如上所述制备C2R1T，稀释至20μM)，进行梯度稀释(最上排孔为20μM蛋白原液，依次2倍稀释，根据实验摸索出针对不同型别最适浓度的浓度范围，HPV16型起始浓度为6μM，HPV18型起始浓度为12μM,HPV58型起始浓度为12μM)，每个浓度设3个复孔，与各种假病毒(通过将10μl实施例3制备的病毒储备溶液添加至DMEM 10ml制备)分别等体积(50μl)混合，25℃孵育30分钟；将病毒与待测样品的混合物(总计100μl)加入到预铺Hela细胞(1×105)的96孔培养板中37℃，5％CO2培养，72小时后用Infinite M200Pro型酶标仪在600nm处检测各孔荧光素酶报告基因的表达情况和酶活(使用测定试剂盒Promega，E1500根据制造商的用法说明测定)；细胞孔(未使用病毒感染)为空白对照，仅感染假病毒的细胞孔为阳性对照，处理条件与样品孔相同。各样品的假病毒抑制率可通过下列公式计算：

[0144] 假病毒抑制率(％)＝[(阳性对照RLU平均值–样品RLU)/(阳性对照RLU平均值-空白对照RLU平均值)]*100

[0145] 使用CalcuSyn软件分别计算各蛋白样品针对各假病毒的半数效应(进入抑制)浓度(IC50)。

[0146] 图10A-C显示了C2R1T对HPV16、18和58均具有抑制活性。

[0147] 2.1.2检测多肽C2R1T、R1P1、R1P2、R1P3和R1P4(C2R1T为实验室表达纯化。如实施例1所述；R1P1、R1P2、R1P3和R1P4多肽合成自上海杰肽生物)抑制HPV 16的实验(多肽R1P1、R1P2、R1P3和R1P4起始浓度分别为913，922，908，922μM，三倍梯度稀释)，方法同2.1.1上述实验方法，区别仅在于待测样品为不同多肽。

[0148] 2.2实验结果及分析

[0149] 由实验结果得知C2R1T的抗HPV16型的IC50值为0.213μM，抗HPV18型IC50值为1.78μM，抗HPV58型IC50值为1.27μM。

[0150] 由实验结果可知除多肽R1P4外其余多肽R1P1、R1P2和R1P3无抑制HPV感染的活性，R1P4抗HPV16型IC50为237μM，如图12A-D和表2所示。

[0151] 表2：蛋白及多肽抗病毒活性

[0152]

[0153] 实施例5.C2R1T抗HPV机制。

[0154] 为探究C2R1T作用原理，我们设计实验讨论了其作用靶点，通过Time-of-removal和ELISA实验证明，C2R1T与HPV病毒L1蛋白相互结合后起到抑制活性。

[0155] 3.1ELISA方法如下：

[0156] (1)JB蛋白的制备参见中国专利申请201410561005.1或201510393377.2(通过引用并入本文)。具体地，将β-乳球蛋白溶于磷酸盐缓冲液，pH8.5中，终浓度为20mg/ml，然后在此溶液中缓慢加入饱和的3-羟基邻苯二甲酸酐摇匀，混合物在室温下放置1小时，用pH7.4PBS透析，再用微孔滤膜过滤除菌即得。

[0157] (2)包被：用PBS(pH 9.6)稀释C2R1T蛋白(5μg/ml)、JB01(实验室制备)、R1P4、和BSA(购自aMReSCO，0332)，相同浓度(5μg/ml)，加入ELISA检测板中，每孔50μl，4℃过夜。

[0158] (3)封闭：每孔加入2％脱脂奶150μl溶液(0.05％Tween-20的PBS溶液溶解)，37℃孵育2h，用0.05％PBS/Tween-20(PBST)洗液洗板3次。

[0159] (4)抗原：封闭好的ELISA板，每孔加入50μl HPV16L1蛋白溶液(5μg/ml)(购自abcam，ab119880)，37℃孵育1h，PBST溶液洗板3次。

[0160] (5)一抗：每孔加入50μl特异性识别HPV16L1的单克隆抗体ab69(1μg/ml)(购自abcam，ab69)，37℃孵育1h，PBST溶液洗板3次。

[0161] (6)二抗：每孔加入50μl兔抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(DACO，P0260)，孵育1h，洗板3次。

[0162] (7)显色和终止：每孔加入ELISA显色液(TMB，碧云天，P0209)50μl，显色5-10min，然后加入50μl 2M H2SO4终止显色反应。用酶标仪(TECAN infinite M200pro)检测每孔的OD450，得出数据。

[0163] 3.2Time-of-removal试验方法如下：

[0164] 将100μl C2R1T(100μg/ml)与预先培养于96孔细胞培养板中DMEM培养基(美伦)中的1×105个Hela细胞于37℃孵育1小时，然后，弃去含有样品的培养基并用DMEM(PBS)培养基清洗细胞3次，使用假病毒(HPV16，50μl/孔)感染清洗后的细胞。以不洗C2R1T的样品孔加入等量(50μl/孔)假病毒后的样品作为对照(图13的右侧柱形)。孵育12小时后换液(DMEM，2％FBS，200μl)，孵育72小时后收细胞，使用试剂盒(Promega，E1500)根据制造商的用法说明用Infinite M200Pro型酶标仪在600nm处检测荧光素酶报告基因的表达情况，以病毒抑制率为标准比较活性。

[0165] 3.3病毒灭活试验方法如下

[0166] 将50μl C2R1T(制备方法如上，1mg/ml分别稀释至终浓度0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.031mg/ml)与HPV16病毒(50μl实施例3制备的储备溶液)一起冰上孵育1h，用
20％PEG 8000(国药)沉淀病毒，冰上孵育1h，12000rpm离心30min，弃去上清。用1ml PBS重悬，用PEG8000再次沉淀以去除杂质和C2R1T，如此洗三遍。将收集的C2R1T作用之后的病毒感染细胞，以相同量不与药物作用的病毒为阳性对照，空白对照为没有样品没有病毒的细胞孵育72h后使用试剂盒(Promega，E1500)根据制造商的用法说明用Infinite M200Pro型酶标仪在600nm处检测荧光素酶报告基因表达情况，计算剩余感染率(剩余感染率(％)＝[(样品RLU-空白对照RLU平均值)/(阳性对照RLU平均值-空白对照RLU平均值)]*100值,值越高则表示灭活活性越差)。以此来判断产品是否具有灭活活性。

[0167] 3.4实验结果及分析

[0168] 如图13-15所示，由实验结果可知C2R1T作用在病毒的进入阶段，不作用于靶细胞，其与HPV L1蛋白的结合可以抑制HPV的感染，并且不具有灭活病毒的活性。