本发明公开了一种启动子组合控制的动态调控系统，具体公开了一种启动子组合控制的涉及动态调控系统及其在莽草酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段，筛选出两类转录特征完全不同的启动子，即生长期关联启动子和稳定期启动子。利用蛋白酶特异性识别切割特定短肽的性质，设计构建出不需要借助人为控制和外源添加诱导剂的蛋白丰度调控系统。通过在工程大肠杆菌中引入靶向莽草酸激酶的动态调控基因线路，实现了在无机盐培养基中，不外源添加芳香族氨基酸和诱导剂生产莽草酸的能力。通过本发明生产的莽草酸产量可达21.2g/L，转化率达0.24g/g葡萄糖。
1.一种基因工程菌，其特征在于，引入了含有生长期关联启动子的表达载体和含有稳定期关联启动子的表达载体；所述生长期关联启动子连有添加了N末端的蛋白酶识别切割位点的靶蛋白；所述稳定期关联启动子连有蛋白酶；所述N末端的蛋白酶识别切割位点被所述蛋白酶识别；所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主；所述生长期关联启动子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；
所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；
所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述靶蛋白为莽草酸激酶。
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，稳定期关联启动子连有的蛋白酶为TEV蛋白酶。
4.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，以PJ01-GABE-GPP-K和PSPP-TEV为表达载体；
所述的PJ01-GABE-GPP-K质粒的构建方法为：
（1）以商业化质粒pTargetF为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnB T1 终止子后插入T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；
（2）以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别扩增获得含有B0034RBS的aroBopt、aroE、aroGfbr、tktA片段，将aroBopt、aroE两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-BE质粒，以相同的方法，将aroGfbr、tktA两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-GA质粒；
（3）以大肠杆菌MG1655基因组为模板，扩增获得含有B0034RBS、N末端修饰的aroK片段，将该片段插入至pJ01质粒中，获得pJ01-K质粒，利用酶切位点BglII和SpeI双酶切质粒pJ01-K，并以相同的酶切位点插入合成生长关联启动子序列，获得GPP-K质粒；
（4）采用同尾酶连接的方式利用BamHI、BglII和XbaI，分别将pJ01-GA、pJ01-BE、GPP-K质粒组装，最终获得质粒PJ01-GABE-GPP-K；
合成稳定期关联启动子基因后，采用融合PCR的方式分别加上B0034RBS及GFP报告基因，将上述融合后的片段与载体pTet-1质粒连接，构建获得重组质粒PSPP-GFP；使用蛋白酶TEV基因片段置换上述PSPP-GFP中的报告基因GFP，获得质粒PSPP-TEV质粒；所述载体pTet-1来源于商业化质粒pdCas9-bacteria，采用全质粒PCR的方式将pdCas9-bacteria中编码dcas9蛋白的序列删除，获得的质粒重新命名为pTet-1。
5.一种调控靶蛋白基因表达的方法，其特征在于，用生长期关联启动子关联连有添加了N末端的蛋白酶识别切割位点的靶蛋白表达，并用稳定期关联启动子关联蛋白酶的表达；
所述生长期关联启动子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；
所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；
所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为TEV蛋白酶。
7.一种生产莽草酸的方法，其特征在于，利用基因工程菌发酵，所述基因工程菌以敲除了莽草酸激酶基因的大肠杆菌为宿主；所述基因工程菌引入了含有生长期关联启动子的表达载体和含有稳定期关联启动子的表达载体；所述生长期关联启动子连有添加了N末端的蛋白酶识别切割位点的靶蛋白；所述稳定期关联启动子连有蛋白酶；所述N末端的蛋白酶识别切割位点被所述蛋白酶识别；所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主；所述生长期关联启动子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；所述稳定期关联启动子连有的蛋白酶为TEV蛋白酶；所述靶蛋白为莽草酸激酶；
所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；
所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8所示。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基包括NBS无机盐培养基。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为35-38℃，200-220 rpm，初始OD600为0.04-0.1，发酵70-75 h；或，发酵条件为35-38℃，480-530 rpm，接种量为
5-10%，通气量为1-2 vvm，发酵90-100 h。
10.权利要求5所述的一种调控靶蛋白基因表达的方法在制备目的蛋白中的应用。
一种启动子组合控制的动态调控系统
技术领域
[0001] 本发明涉及一种启动子组合控制的动态调控系统，具体涉及一种启动子组合控制的涉及动态调控系统及其在莽草酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
[0002] 动态调控系统是代谢工程领域中新兴的代谢流调控手段，其区别于静态调控的主要特征是在发酵过程中，工程菌株会根据发酵时间，生理状态，胞内代谢物浓度，胞外环境变化做出相应的酶活调整，进而影响代谢流分布，提高产品生产能力。动态调控系统具有发酵过程无需人为调控，不需要外源添加诱导剂的优势，在生产高附加值化合物中具有显著优势。
[0003] 目前的动态调控系统，主要是依靠群体感应系统进行控制的，即系统的触发器是由本源或者异源的群体感应系统组成。当菌体浓度达到一定浓度时，群体感应系统释放积累的小分子物质会作用于调控系统受体，使调控系统做出相应动作。如2017年，Apoorv Gupta等人表于Nature biotechnology的动态系统，该系统由EsaI群体感应系统和靶蛋白C末端添加降解标签组合而成，当菌体浓度达到一定阈值时，靶蛋白的被降解，胞内绝对浓度达到0，从而实现酶活关闭，调控代谢流的目的和效果。该系统具有路径独立特征，并成功应用于肌醇，葡萄糖二酸和莽草酸的生产应用。除此之外，2017年，Xinyuan He等人发表于ACS synthetic biology的AND逻辑门动态调控系统由群体感应系统和稳定期感应蛋白组成。当菌体浓度达到一定阈值时，启动靶蛋白的转录表达，从而实现代谢流调控目的和效果。该系统运用于PHB生产时，提高了1-2倍PHB产量。综上所述，两种动态调控系统均需要引入异源群体感应系统，然而，异源群体感应系统往往由多个转录调控蛋白组成，它的引入无疑会影响菌株的生长和发酵性能，同时限制了路径酶的表达数量。
[0004] 为了构建出更为精简的动态调控系统，本发明提出了采用两类能够响应菌株生理状态的启动子组合，并结合蛋白质降解的思路。这两类启动子具有完全不同的转录特征，当菌株处于对数生长期时，生长期关联启动子(简写GPP)的转录活性极强，可以控制目标蛋白的大量转录及合成，而稳定期关联启动子(简写SPP)的转录活性受强烈抑制，不进行蛋白质的转录及合成。当菌株处于稳定期时，生长期关联启动子的转录活性受到抑制，目标蛋白的合成几乎停滞，相反，稳定期关联启动子的转录活性大幅提高，促进了其控制蛋白的转录及合成。在此基础上，组合生长关联启动子负责转录控制的具有N端隐藏降解子的靶蛋白和由稳定期关联启动子负责转录控制的蛋白酶，构建出动态调控基因线路。当菌株处于对数生长期时，靶蛋白能够启动合成，并在胞内积累，行使相应的生理代谢功能。当菌株进入稳定期后，蛋白酶受稳定期关联启动子控制表达，促进靶蛋白隐藏的N端降解子裸露，进而降解靶蛋白，关闭其相应的生理代谢功能。然而，不同的启动子组合时，其转录起始时间存在差异，不同的组合方式调节基因表达的效果不同。
[0005] 莽草酸是制备抗流感药物达菲的前体药，在大肠杆菌中由分支酸路径合成。传统的生产莽草酸方法是敲除菌株的莽草酸激酶I和II，以阻断莽草酸到莽草酸-3-磷酸的合成通量，实现莽草酸的积累。然而，莽草酸-3-磷酸的下游产物包含大肠杆菌生长必需的芳香族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。直接阻断莽草酸-3-磷酸的合成，将使菌株在无机盐培养基中出现生长缺陷。为了促进菌株生长，现有技术需要在培养基中添加价格昂贵的芳香族氨基酸，或是增加产物分离难度的有机氮源，如胰蛋白胨，酵母粉等。因此，提供一种在简单培养基中高产莽草酸的方法，对于工业制备莽草酸具有重要的意义。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，含有生长期关联启动子和稳定期关联启动子；所述生长期关联启动子连有添加了N末端切割短肽或N末端降解子的靶蛋白；所述稳定期关联启动子连有蛋白酶；所述N末端切割短肽或N末端降解子可被所述蛋白酶识别；
[0007] 所述蛋白酶包括TEV、TVMV、SuMMV或HICV；
[0008] 所述生长期关联启动子包括rpsM、rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；
[0009] 所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；
[0010] 所述rpsM、rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述靶蛋白为莽草酸激酶。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，稳定期关联启动子连有的蛋白酶为TEV蛋白酶。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，以PJ01-GABE-GPP-K和PSPP-TEV为表达载体。
[0014] 所述PJ01-GABE-GPP-K过表达了aroGfbr、tktA、aroBopt、aroE和aroK*基因的质粒，aroGfbr，即含有消除产物反馈抑制的DAHP(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate)合成酶突变体D146N；aroBopt，即含有前15个氨基酸密码子优化后的aroB基因；aroK*，即含有TEV蛋白酶识别切割位点与苯丙氨酸降解子共同修饰的莽草酸激酶I基因aroK。
[0015] 所述的PJ01-GABE-GPP-K质粒的构建方法为：
[0016] (1)以商业化质粒pTargetF(Addgene Plasmid#62226)为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnB T1终止子后插入T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；
[0017] (2)以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别扩增获得含有B0034RBS的aroBopt、aroE、aroGfbr、tktA片段，将aroBopt、aroE两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-BE质粒，以相同的方法，将aroGfbr、tktA两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-GA质粒；
[0018] (3)以大肠杆菌MG1655基因组为模板，扩增获得含有含有B0034RBS、N末端修饰的aroK片段，将该片段插入至pJ01质粒中，获得pJ01-K质粒，利用酶切位点BglII和SpeI双酶切质粒pJ01-K，并以相同的酶切位点插入合成生长关联启动子序列，获得GPP-K质粒；
[0019] (4)采用同尾酶连接的方式(BamHI+BglII+XbaI)，分别将pJ01-GA、pJ01-BE、GPP-K质粒组装，最终获得质粒PJ01-GABE-GPP-K。
[0020] 所述的PSPP-TEV质粒的构建方法为：合成稳定期关联启动子基因后，采用融合PCR的方式分别加上B0034RBS及GFP报告基因，将上述融合后的片段与载体pTet-1质粒连接，构建获得重组质粒PSPP-GFP；使用蛋白酶TEV基因片段置换上述PSPP-GFP中的报告基因GFP，获得质粒PSPP-TEV质粒。
[0021] 所用的载体pTet-1为工程化载体，其来源于商业化质粒pdCas9-bacteria(Addgene Plasmid#44249)，采用全质粒PCR的方式将pdCas9-bacteria中编码dcas9蛋白的序列删除，获得的质粒重新命名为pTet-1。
[0022] 本发明的第二个目的是一种调控靶蛋白基因表达的方法，用生长期关联启动子关联连有添加了N末端切割短肽或N末端降解子的靶蛋白表达，并用稳定期关联启动子关联蛋白酶的表达；所述N末端切割短肽或N末端降解子可被所述蛋白酶识别；
[0023] 所述蛋白酶包括TEV、TVMV、SuMMV或HICV；
[0024] 所述生长期关联启动子包括rpsM、rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；
[0025] 所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；
[0026] 所述rpsM、rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。
[0027] 本发明的第三个目的是提供一种生产莽草酸的方法，发酵权利要求上述的基因工程菌，所述基因工程菌以敲除了莽草酸激酶基因的细胞为宿主，所述靶蛋白为莽草酸激酶。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，以E.coli S4为宿主，所述E.coli S4的构建方法为：以E.coli MG1655为出发菌株，敲除其莽草酸激酶I和II基因(aroK，aroL)，将PTS系统替换为来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖易化蛋白基因Zmglf。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括NBS无机盐培养基。
[0030] 在本发明的一种实施方式中，发酵条件为35-38℃，200-220rpm，初始OD600为0.04-0.1，发酵70-75h；或，发酵条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，通气量为1-2vvm，发酵90-100h。
[0031] 本发明的第四个目的是提供上述的基因工程菌在制备目的蛋白或在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
[0032] 本发明的第五个目的是提供上述的一种调控目的基因表达的方法或上述的一种生产莽草酸的方法在制备目的蛋白或生物、制药、食品或化工领域内的应用。
[0033] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以PJ01-GABE-GPP-K和PSPP-TEV作为表达载体。
[0034] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括NBS无机盐培养基。
[0035] 在本发明的一种实施方式中，摇瓶发酵条件为35-38℃，200-220rpm，初始OD控制为0.04-0.06，发酵70-75h；发酵罐发酵条件为35-38℃，480-530rpm，接种量为5-10％，通气量1-2vvm，发酵90-100h。
[0036] 本发明的第四个目的是提供一种构建动态调控基因线路的方法或上述基因工程菌在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
[0037] 本发明的第五个目的是提供一种构建动态调控基因线路的方法或上述基因工程菌在制备目的蛋白中的应用，所述目的蛋白包括酶蛋白或非酶蛋白。
[0038] 本发明的第六个目的是提供一种生产莽草酸的方法在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
[0039] 有益效果：本发明提供了一种构建动态调控基因线路的方法，具有发酵过程无需人为调控，不需要外源添加芳香族氨基酸和诱导剂的优势。此外，该方法设计简单，系统元件少，菌株生长负荷低。通过构建莽草酸生产工程菌株和引入动态调控基因线路，在无机盐培养基中可以积累高达21.2g/L的莽草酸，其转化率达0.24g/g葡萄糖，具有较好的应用前景。
附图说明
[0040] 图1：部分稳定期关联启动子的荧光过程曲线。
[0041] 图2：部分生长期关联启动子的荧光过程曲线。
[0042] 图3：质粒图谱，A：PJ01-GABE-GPP-K；B:PSPP-TEV。
[0043] 图4：部分动态基因线路的荧光过程曲线。
[0044] 图5：部分动态基因线路的转换OD600值。
[0045] 图6：莽草酸生产菌株的基因工程改造靶点。
具体实施方式
[0046] 材料与方法
[0047] 质粒构建采用经典分子生物手段进行。
[0048] 荧光过程曲线测定采用SpectraMax M3微孔板酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)进行测定，控制环境温度30度。
[0049] 种子培养基：LB培养基，成分包含蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
[0050] 发酵培养基：NBS无机盐培养基，成分包含葡萄糖50g/L、CaCl2·2H2O 15mg/L、微量元素液0.667mL/L、灭菌后补加MgSO4·7H2O 0.25g/L，VB1 0.5mg/L，盐酸甜菜碱1mM。微量元素液的配置方法为FeCl3·6H2O 2.4g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L、CuCl2 0.15g/L、ZnCl2·4H2O0.3g/L、NaMnO4 0.3g/L、H3BO3 0.075g/L、MnCl2·4H2O 0.5g/L，溶于0.1M HCl中配制。
[0051] 发酵样品制备：取发酵液样品，12000rpm离心5min，取上清液稀释后，过0.22μm水系膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。
[0052] 莽草酸含量的测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐Aminex HPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度0.005M的H2SO4，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，在紫外检测波长210nm下检测。
[0053] 实施例1启动子活性评估
[0054] 生长期关联启动子基因合成后，采用融合PCR的方式分别加上B0034RBS及报告基因GFP。将上述PCR产物回收，并与载体PJ01质粒连接，构建获得重组质粒PJ01-GPP-GFP。
[0055] 稳定期关联启动子基因合成后，采用融合PCR的方式分别加上B0034RBS及报告基因GFP。将上述PCR产物回收，并与载体pTet-1质粒连接，构建获得重组质粒PSPP-GFP。
[0056] 将获得的重组质粒PJ01-GPP-GFP导入感受态细胞E.coli JM109中，获得含有生长关联启动子评估质粒的菌株。
[0057] 将获得的重组质粒PSPP-GFP导入感受态细胞E.coli JM109中，获得含有稳定期评估质粒的菌株。
[0058] 在LB培养基中，使用SpectraMax M3微孔板酶标仪对上述菌株进行连续荧光测定。结果如图1和图2所示。由图1可知，在菌株对数生长期(1-8h)，荧光蛋白的积累量非常低，而当菌株进入稳定期后(>8h)，荧光蛋白的积累量快速增加。上述现象吻合稳定期启动子特性。由图2可知，在菌株对数生长期(1-6h)，荧光蛋白的积累量持续增加，而当菌株进入稳定期后(>8h)，荧光蛋白的积累量达到稳定，不再继续增加。上述现象吻合生长关联型启动子特性。
[0059] 实施例2动态调控基因线路的组装及检测
[0060] 为了构建动态调控基因线路，使用蛋白酶TEV基因片段置换上述PSPP-GFP中的报告基因GFP，获得质粒PSPP-TEV质粒。同时将重组质粒PJ01-GPP-GFP的报告基因GFP进行N末端修饰，加上TEV蛋白酶识别切割位点与苯丙氨酸降解子，获得质粒PJ01-GPP-(teF)GFP。将质粒PSPP-TEV与PJ01-GPP-(teF)GFP共转化至JM109中，使用氨苄和氯霉素双重抗性平板进行筛选，并对转化子进行PCR验证，最终获得含有上述双质粒的动态调控线路检测菌株。
[0061] 将上述检测菌株置于LB培养基中培养，使用SpectraMax M3微孔板酶标仪进行连续荧光测定。结果如图4所示，随着细菌培养时间的延长，胞内荧光积累出现了先上升后下降的整体趋势。不同启动子组合条件下荧光的积累变化不同，如以相同rrnB P1启动子表达GFP的组合中，高强度稳定期启动子控制的蛋白酶组合，如S4和S60，其菌株的荧光积累峰值较低，下降开始的时间(转换时间)较早。同时可以看出，在不含有GFP降解位点的菌株(Control)中，尽管蛋白酶正常表达，荧光蛋白并未出现下降，说明荧光蛋白的下降是由于蛋白酶介导的荧光蛋白降解造成的。
[0062] 实施例3莽草酸生产菌株的构建
[0063] 选择E.coli MG1655为底盘工程菌，敲除宿主菌的莽草酸激酶I和II(aroK，aroL)，使用来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖易化蛋白Zmglf置换宿主菌的PTS系统。新菌株被命名为S4，该菌株由于阻断了莽草酸路径，不能在NBS无机盐培养基中生长，更不能积累产物莽草酸。
[0064] 实施例4动态基因线路引入莽草酸生产菌株的摇瓶发酵性能
[0065] 如图5所示，以PJ01-GABE-GPP-K和PSPP-TEV为表达载体，将不同的动态基因线路引入至E.coli S4菌株中，共获得DS1-DS12等12株工程菌株。
[0066] 当菌株处于对数生长期时，菌株正常生长，PJ01-GABE-GPP-K表达，莽草酸在aroK*的作用下合成莽草酸-3-磷酸，无法积累莽草酸，莽草酸行使正常的生理代谢功能；当菌株进入稳定期后，PSPP-TEV表达，TEV蛋白酶受稳定期关联启动子控制而表达，TEV蛋白酶会促进PJ01-GABE-GPP-K上aroK*连接的隐藏的N端降解子裸露，进而降解aroK*，莽草酸关闭其相应的生理代谢功能，积累量提高，如图6所示。
[0067] 在NBS无机盐培养基中检测菌株生长及产物合成情况。摇瓶发酵结果表明，DS1-DS4菌株难以在NBS无机盐培养基中有效生长，最高菌浓仅为0.89，最高莽草酸积累量为0.44g/L。而DS5-DS12菌株的生长缺陷解除，积累菌浓范围达OD600为5.91-6.82，莽草酸积累量达0.44-2.14g/L。最优菌株为引入bolA和rpsT P2组合启动子的基因线路的DS7，其发酵性能为莽草酸积累量2.14g/L，OD600为6.82。
[0068] 实施例5动态基因线路引入莽草酸生产菌株的发酵罐发酵性能
[0069] 在5L发酵罐中检测DS7菌株的发酵性能。温度恒定37度，500rpm，初始接种量控制为5％，通气量1vvm，发酵周期为96h。发酵结束时，莽草酸积累量达21.2g/L，转化率达0.24g/g葡萄糖。
[0070] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
