一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法

摘要

本发明提供一种从半滑舌鳎中筛选的抗细菌病相关基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1,编码的蛋白的序列为SEQ ID NO:2。本发明提供的基因与半滑舌鳎抗细菌病相关，其在肠中的表达量与鱼体抗病能力相关，表达水平越高，鱼体抗病能力越强；其体外重组表达的蛋白能够明显抑制几种革兰氏阴性菌的增殖，因此，在半滑舌鳎抗病家系选育、病害防治、饲料添加剂及杀菌剂研制等方面有应用价值。

权利要求

1.核苷酸序列为SEQ ID NO:1的基因作为半滑舌鳎抗细菌病家系筛选的标记基因的应用。

说明书

一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法

技术领域

[0001] 本发明属于水产遗传育种技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法。

背景技术

[0002] 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)主要分布在我国沿海地区，是我国重要的海水经济养殖鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受广大消费者喜爱，具有良好的市场需求和养殖开发潜力。然而，高密度集约化的养殖模式以及环境污染等原因，致使半滑舌鳎腹水、烂鳍、烂尾等细菌性疾病频繁爆发，尤其是哈维氏弧菌所引起的皮肤等溃烂最为严重，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了半滑舌鳎养殖业的发展。目前，对于鱼类哈维氏弧菌病的防治，主要依赖于抗生素，但药物的滥用不仅会产生药物残留、耐药性和环境污染等问题，对人体健康也存在潜在威胁。近年来，人们一直迫切地寻找能够代替传统抗生素的药物，并且随着越来越多的抗生素耐药菌株的出现，使得抗菌蛋白在水产养殖业、医药行业和食品添加剂等领域受到广泛的重视。

[0003] 抗菌蛋白是由基因编码的具有抗菌活性的生物大分子，是生命防御系统的重要组成部分。它的主要作用是抵御病原微生物的入侵，提高生物体自身的抗病性，维护生命活动的延续和正常运行。抗菌蛋白不仅对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌有抵御作用，还能抑制或杀灭真菌、霉菌和病毒等。人们已从微生物、植物、动物和人体中分离纯化到多种抗菌蛋白以及利用基因工程重组技术合成了一些抗菌肽，不同来源的抗菌蛋白在水产养殖领域变得越来越重要。研究表明，在斑节对虾的养殖饲料中添加抗菌肽Mytilin可以显著提高其抗病毒感染能力；在饲料中添加抗菌肽可以显著提高凡纳滨对虾和南美白对虾的抗病能力；重组抗菌肽Chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌罗非鱼的炎症发生并能提高其成活率。抗菌蛋白的研究在最近几年进展较快，随着蛋白质研究技术的日益成熟，抗菌蛋白质已成为抗病新基因开发的一个有效途径。

[0004] 目前已有一些关于半滑舌鳎免疫相关基因的研究报道，主要是通过同源克隆方法获得哺乳动物中报道过的免疫相关基因的同源基因。如干扰素、凝集素、组织相容性复合物家族、细胞因子家族、补体因子、肿瘤坏死因子、趋化因子、溶菌酶、转录因子、肌动蛋白激活蛋白(dctn5)、信号转导和转录激活激活子(stat5)、R-spondins分泌泛白等。然而，由于种族特异性的存在，这些同源基因编码的蛋白在半滑舌鳎等鱼类不一定具有抗病免疫的功能，特别是不一定具有抵抗半滑舌鳎特定病原菌的作用。另外，上述免疫相关基因在半滑舌鳎抗病家系和易感家系的表达水平和差异尚未见报道，很难将其开发为半滑舌鳎抗细菌病能力的标志性基因。所以，要筛选半滑舌鳎自身的抗特定病原菌的相关基因，最好是从半滑舌鳎自身进行筛选。鉴于此，结合半滑舌鳎抗病家系和不抗病家系的全基因组重测序数据和免疫组织转录组数据，利用全基因组关联分析(GWAS)等生物信息学技术，筛选新的组织特异性表达、具有抗细菌病相关功能和抗病家系优势表达的基因就显得非常重要。进一步对此类半滑舌鳎抗细菌病相关基因的功能及其在抗病免疫中的作用机制进行研究，探索其在半滑舌鳎抗病育种和病害防控中应用的技术途径等迫在眉睫，可以为半滑舌鳎抗病育种和病害防控提供理论基础和基因标记或基因产物。这对于半滑舌鳎等鱼类抗病育种及病害防控具有重要意义和应用价值。

发明内容

[0005] 本发明首次提供了一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其作为抗病力评价标记的应用，制备重组蛋白并鉴定重组表达产物的抑菌活性。为半滑舌鳎抗病良种选育提供基因序列和基因标记，并为绿色饲料添加剂以及抗菌剂的研发提供技术方法。

[0006] 本发明提供一种从半滑舌鳎中筛选的抗细菌病基因，该基因编码蛋白的序列为SEQ ID NO:2；

[0007] 所述的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

[0008] 本发明所提供的基因适用做半滑舌鳎抗细菌病家系筛选的标记基因。

[0009] 本发明还提供上述抗细菌病相关基因在半滑舌鳎抗病力检测中的应用；

[0010] 本发明提供了一种检测上述抗细菌病相关基因的方法，是检测该基因在半滑舌鳎肠中表达的量；其表达量越高，抗细菌病能力越强。

[0011] 所述的方法使用的检测引物，其一种序列信息如下：

[0012] 上游引物：5’-GACCAACTGCCACCATACTCC-3’(SEQ ID NO:3)

[0013] 下游引物：5’-TCGTCCTCCAAGCCAAACC-3’(SEQ ID NO:4)；

[0014] 本发明提供了用于重组表达上述蛋白的重组表达菌株；

[0015] 本发明的蛋白用于制备半滑舌鳎哈维氏弧菌病防治的制品；

[0016] 本发明的蛋白还用于制备饲料添加剂和抗菌剂。

[0017] 本发明提供的基因与免疫抗病相关，其体外重组表达的蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌的增殖，因此，在半滑舌鳎病害防治、饲料添加剂及杀菌剂等方面有应用价值。

附图说明

[0018] 图1：半滑舌鳎抗细菌病相关基因的cDNA全长序列和开放阅读框编码的氨基酸序列:

[0019] SEQ ID NO:1:半滑舌鳎抗细菌病相关cDNA全长序列。

[0020] SEQ ID NO:2:半滑舌鳎抗细菌病相关开放阅读框编码的氨基酸序列。

[0021] 图2：抗细菌病相关基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平：

[0022] 其中，2-1:RT-PCR半定量检测抗细菌病相关基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平。其中组织的英文缩写：L:肝脏；Sp:脾脏；K:肾脏；I:肠；Gi:鳃；H:心脏；Br：脑；St:胃；Bl:血液；Hk:头肾。

[0023] 2-2：qRT-PCR定量检测基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平。其中横坐标表示半滑舌鳎不同的组织，纵坐标表示基因在不同组织中的表达量，其中各组织的英文缩写同图2-1。

[0024] 图3：半滑舌鳎抗细菌病相关基因在哈维氏弧菌感染后免疫相关组织中的表达分析。横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示抗细菌病相关基因在不同组织中的表达量。共检测了6个组织，包括：肠(Intestine)，鳃(Gill)，皮肤(Skin)，肾脏(Kidney)，肝脏(Liver)，脾脏(Spleen)。

[0025] 图4：半滑舌鳎抗细菌病相关基因的重组蛋白的诱导表达、分离纯化及鉴定：

[0026] (A)重组蛋白诱导表达，M：蛋白marker，1：对照组未诱导表达，2：对照组诱导表达，3：重组蛋白组未诱导表达，4：重组蛋白组诱导表达；

[0027] (B)重组蛋白可溶性分析及纯化，M:大分子量蛋白marker，1:超声波破碎后上清，2:超声波破碎后沉淀；

[0028] (C)重组蛋白纯化和透析后，M:大分子量marker，1:纯化和透析后重组蛋白。

[0029] 图5：重组蛋白体外抑菌活性分析图：

[0030] (1)抗细菌病相关基因的重组蛋白抑制哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)效果示意图，0为PBS作为阴性对照组；1为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照组；2、3、4为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组：其中2为0.6mg/ml，3为0.12mg/ml，4为0.054mg/ml。

[0031] (2)抗细菌病相关基因的重组蛋白抑制副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)效果示意图，0为PBS作为阴性对照组；1为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照组；2、3、4为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组：其中2为0.6mg/ml，3为0.12mg/ml，4为0.054mg/ml。

[0032] (3)抗细菌病相关基因的重组蛋白抑制爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)效果示意图，0为PBS作为阴性对照组；1为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照组；2、3、4为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组：其中2为0.6mg/ml，3为0.12mg/ml，4为0.054mg/ml。

[0033] 图6：半滑舌鳎抗细菌病相关基因在2014年抗病与易感家系各组织中的表达水平:

[0034] 其中6-1:RT-PCR半定量检测半滑舌鳎抗细菌病相关基因在2014年半滑舌鳎抗病与易感家系各组织中的表达量。各组织的英文字母缩写前加r表示抗病家系，前加s表示易感家系，L:肝脏，Sp:脾脏；K:肾脏；Gi:鳃；I:肠；Bl:血。

[0035] 6-2：qRT-PCR定量检测半滑舌鳎抗细菌病相关基因在2014年半滑舌鳎抗病与易感家系各组织中的表达量。其中横坐标表示半滑舌鳎不同组织，纵坐标表示基因在不同组织的表达量。SF(Susceptible family)表示易感家系，用黑色柱形表示，RF(Resistant family)表示抗病家系，用灰色柱形表示；Gi:鳃；I:肠；Bl:血液；K:肾脏；Sp:脾脏；L:肝脏。

[0036] 图7：半滑舌鳎抗细菌病相关基因在2017年半滑舌鳎抗病与易感家系各组织中的表达水平:

[0037] 7-1:RT-PCR半定量检测半滑舌鳎抗细菌病相关基因在2017年抗病与易感家系各组织中的表达量。其中组织的英文字母缩写前加r表示抗病家系，前加s表示易感家系，L:肝脏，Sp:脾脏；K:肾脏；Gi:鳃；I:肠。

[0038] 7-2：qRT-PCR定量检测半滑舌鳎基因在2017年抗病与易感家系各组织中的表达量。其中横坐标表示半滑舌鳎不同的组织，纵坐标表示基因在不同组织的表达量。SF(Susceptible family)表示易感家系，用黑色柱形表示，RF(Resistant family)表示抗病家系，用灰色柱形表示；Gi:鳃；I:肠；K:肾脏；Sp:脾脏；L:肝脏。

具体实施方式

[0039] 为了使本发明的目的、技术路线和优点更加清晰明确，下面结合附图对本发明举例进行详细描述。

[0040] 实施例1：半滑舌鳎抗细菌病相关基因全长cDNA的克隆及其序列分析

[0041] 申请人陈松林等首先通过对以前筛选出来的半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病家系和易感家系采用常规方法进行全基因组重测序和全基因组关联(GWAS)分析，发现了与半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病性状连锁的SNP标记，并进一步将该SNP位点定位到一个片段上，然后将该片段通过RT-PCR与RACE-PCR扩增验证，获得了基因的全长cDNA序列。

[0042] (1)实验方法：Trizol法提取RNA、cDNA的合成、PCR扩增

[0043] Trizol法提取RNA：取大约100mg左右的组织块，放入加了500μL Trizol试剂的无酶离心管中，用研磨棒冰上研磨；待组织磨碎后，再补加500μL Trizol试剂，静置10min后4℃/12000rpm离心10min，弃沉淀；加入200μL氯仿，剧烈摇动30s后静置5min使之充分混匀，4℃，12000rpm离心15min；吸取上清液，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃清液；再用75％的乙醇洗涤两次，4℃下12000rpm离心3min并小心弃上清液；室温放置干燥5min尽量除尽乙醇；加入适量RNase-Free H2O，将RNA沉淀充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，RNA/DNA分光光度计测定RNA纯度及浓度；将提取的RNA放在-80℃保存。

[0044] cDNA合成：将提取的RNA按照TaKaRa反转录试剂盒说明书操作进行反转录，合成的cDNA-20℃保存。

[0045] PCR扩增：以SNP标记定义的片段序列为基础，通过RT-PCR一次性扩增出较长的中间片段，再以RACE PCR技术扩增出5’末端和3’末端序列。

[0046]

[0047]

[0048] RACE PCR反应分为两轮。具体步骤如下:

[0049] 一轮：Touchdown PCR反应体系及反应条件如下：

[0050]

[0051] 二轮：巢式PCR反应体系及反应条件如下：

[0052] *第一轮的PCR产物稀释50或100倍作为第二轮的扩增模板。

[0053]

[0054]

[0055] 将二轮PCR产物切胶回收，PCR产物纯化后与克隆载体pEASY-T1连接，将阳性克隆进行测序。基因克隆步骤按照pEASY-T1载体说明书操作。(3)全长cDNA的获取及同源性分析[0056] 序列的拼接和比对分析：用DNA Star软件将测序得到的序列进行拼接，最终得到全长cDNA序列；用ORF finder寻找并翻译开放阅读框；最终得到该基因的cDNA全长为1835bp(SEQ ID NO:1)，包括21bp的5’非编译区，1545bp的开放阅读框和269bp的3’非编译区。该基因的开放阅读框编码一个514个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO:2)(图1)。

[0057] 实施例2：半滑舌鳎抗细菌病相关基因在正常鱼不同组织的表达水平分析[0058] (1)设计定量引物并验证引物的特异性

[0059] 根据抗细菌病相关基因序列设计目的基因定量扩增引物，进行普通PCR扩增，电泳检测，克隆测序，若电泳条带单一明亮，且阴性对照无条带，克隆测序分析为目的基因序列，初步断定此引物特异；另外再进行荧光定量PCR上机，观察峰图、CT值以及扩增效率，若荧光定量PCR发现峰图单一，且内参基因与目的基因的扩增效率几乎完全一致，证明引物特异，可以用来进行实时定量PCR实验。Actin基因的定量引物源自陈松林实验室已发表的文章。

[0060] 引物序列如下：

[0061] 上游引物：5’-GACCAACTGCCACCATACTCC-3’

[0062] 下游引物：5’-TCGTCCTCCAAGCCAAACC-3’

[0063] (2)用荧光定量PCR和半定量PCR方法检测抗细菌病相关基因在不同组织的表达水平

[0064] 首先取健康半滑舌鳎鱼的9个组织，分别为肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃、头肾、胃、脑、血液，用Trizol法提取RNA并反转录成cDNA。

[0065] 荧光定量PCR：用上述引物进行荧光定量PCR反应检测抗细菌病相关基因在各个组织中的相对表达量。反应体系为：10μL SYBR，0.4μL primer-F，0.4μLPrimer-R，0.4μL Rox RD II，1μL cDNA模版，7.8μL ddH20。反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。

[0066] 半定量PCR：以反转录得到的cDNA为模版，首先以内参基因actin的定量引物进行普通PCR反应，电泳检测。调整模版浓度和用量，直至各个组织的PCR产物电泳条带亮度一致。然后以调整好的浓度和用量进行目的基因普通PCR反应，电泳检测。

[0067] 两种PCR反应结果均显示：除了在肠和鳃等组织中有很高表达外，基因在半滑舌鳎其余组织中的表达量极低(图3)。

[0068] 实施例3：半滑舌鳎抗细菌病相关基因在感染哈维氏弧菌后免疫相关组织中的相对表达量分析

[0069] 采用陈松林实验室保存的哈维氏弧菌，对半滑舌鳎进行哈维氏弧菌感染实验。设置对照组和实验组，对照组注射0.01mol/L的无菌PBS，实验组注射浓度为1.0×104cfu的哈维氏弧菌，注射剂量约为0.1mL/10g。在注射后0h，12h，24h，48h，72h，96h的六个时间点，分别取肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃和皮肤6个组织。用荧光定量PCR的方法检测抗细菌病相关基因在上述6个组织中的表达量。所用引物、试剂和实验方法均同上所述。

[0070] 结果显示，在注射哈维氏弧菌后各组织的抗细菌病相关基因的表达水平均有不同程度的上调：其中在肠中，在12h至48h，抗细菌病相关基因的表达量一直升高，以12h时最高；在鳃中，除了12h和24h外，48h至96h基因的表达量一直处于升高状态；在脾、肾和皮肤中，基因的表达量从12h到96h几乎一直处于上升状态，72h时达到最高值；在肝中，除了12h外，抗细菌病相关基因的表达量从24h到96h均比对照组高。除了肠外，其余5个组织的表达量均在72h时达到最高。这些结果表明，哈维氏弧菌刺激后，除了肠和鳃外，正常情况下本发明的抗细菌病相关基因表达量极低的免疫相关组织中抗细菌病相关基因的表达量也明显升高，表明半滑舌鳎抗细菌病相关基因对哈维氏弧菌感染有强烈的免疫防御作用(图3)。

[0071] 实施例4、本发明筛选基因的体外重组表达及其产物抑菌活性分析(1)半滑舌鳎抗细菌病相关基因重组表达载体的构建方法：

[0072] 采用高保真性的平末端Pfu酶，通过PCR反应扩增抗细菌病相关基因的完整蛋白编码区序列。纯化后的PCR产物经过T4连接酶处理，插入Peasy E1原核表达载体。经测序正确后，提取阳性克隆菌株中的重组表达质粒。将重组表达质粒转化至感受态BL21(DE3)plyS工程菌中。经诱导，纯化，透析和复性后，获得了重组表达产物抗细菌病相关重组蛋白，结果见图4。实现上述目标的具体方案如下：

[0073] 1.抗细菌病相关基因重组表达载体的构建方法：

[0074] 以半滑舌鳎多组织混合cDNA为模板，采用高保真酶进行抗细菌病相关基因ORF区序列克隆，获得蛋白编码区。PCR产物纯化，插入pMD18-T载体，进行测序。将序列正确的克隆与全式金peasy E1表达载体连接，获得E1-抗细菌病相关重组载体，测序确认阳性克隆，提取目的质粒。将E1-抗细菌病相关质粒转化至感受态BL21(DE3)plyS细菌中，测序正确后备用。

[0075] 2.重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析

[0076] 将BL21(DE3)plyS-E1-抗细菌病相关基因菌株的单克隆接种至1ml含有终浓度50μg/mL AMP+的LB液体培养基中，37℃200rpm培养8h后，按1：500的接种比例接种至200ML氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养(条件同上)至OD600为0.4-0.6。添加终浓度1mM的IPTG,采用28℃、200rpm条件诱导6-12h。取1ml诱导表达后的菌液、对照组空载体和未诱导的菌液等三种菌液同时进行蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测，结果表明，在50KD-70KD之间有差异表达的蛋白条带出现(图4A)。将诱导后的菌液在4℃,8000r/min离心5-10min，收集全部菌体，而后加入裂解液(裂解液：每g菌体中加入结合缓冲液10ml，DNAase I 20U，PMSF 400μl(50mM)，溶菌酶400μl(10mg/ml)。其中，结合缓冲液配制方法如下：每1L无菌水中加入磷酸钠3.8g，氯化钠14.61g，咪唑1.02g)，室温裂解半个小时，然后冰浴中超声破碎20min，条件为超声0.5s，暂停2s。在菌液上清液和破碎后的菌体沉淀中按照1:1的比例加入2×SDS上样Buffer，煮沸5min；SDS-PAGE电泳检测表达结果，结果表明破碎后的菌体沉淀中蛋白含量明显高于上清，抗细菌病相关重组蛋白主要以包涵体的形式存在，结果见图4B。

[0077] 3.半滑舌鳎抗细菌病相关重组蛋白的纯化和验证

[0078] 将上述菌体沉淀采用7M尿素变性，直到沉淀基本溶解后，离心收集上清液，采用0.45μm微孔滤膜过滤后采用HisTrap FF crude纯化柱纯化分析，具体操作如下：

[0079] 首先，用3-5mL无菌去离子水清洗纯化柱，而后使用5ml结合缓冲液(20mM/L Na3PO4，0.5M NaCl，20mM/L咪唑)孵育纯化柱，将收集的包含目的蛋白的上清液缓慢流过纯化柱，流速为1-2mL/min，而后使用5mL结合液清洗孵育纯化柱，而后采用5mL的洗脱缓冲液(20mM/L Na3PO4，0.5M NaCl，500mM/L咪唑)洗脱目的蛋白。收集纯化后的目的蛋白，采用12％浓度的SDS-PAGE电泳进行蛋白大小检测。确认后的目的蛋白采用浓度梯度降低的尿素进行透析，协助蛋白进行折叠，获得复性蛋白，电泳结果显示为单一条带(见图4C)。采用BCA蛋白定量试剂盒对透析后的蛋白进行定量分析。

[0080] 4.纯化的半滑舌鳎抗细菌病相关重组蛋白抑菌活性分析

[0081] 采用牛津杯抑菌圈的方法进行重组蛋白抑菌活性的检测。选用革兰氏阴性菌：爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等三种致病性病原菌进行抑菌效果检测，将上述病原菌培养至对数期，用PBS溶液稀释菌液至浓度为107～108个/ml备用。制作普通的培养基，厚度为0.5cm左右，放入5个灭菌后的牛津杯备用。将病原菌菌液与温度降到40度左右未凝固的固体培养基混合，倒入已经包含0.5cm深度的固体平板上，制作成为夹层培养基。在牛津杯中分别加入10mg/L的氨苄青霉素，0.6mg/ml，0.12mg/ml，0.054mg/ml的复性蛋白。28℃或者37℃(依据细菌种类而定)培养箱培养12h后观察并测量抑菌圈的大小。结果表明，重组蛋白对爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)表现出明显抑菌活性。重组蛋白对爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑菌活性随蛋白浓度增大而增强。低浓度时，在相同蛋白浓度下，重组蛋白对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑菌活性最低，但当蛋白浓度较高时(0.6mg/mL)，重组蛋白对爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑菌活性均较高。在重组蛋白浓度为0.054mg/mL时对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑菌效果很弱(图5)。

[0082] 实施例5:半滑舌鳎抗病家系和易感家系不同组织中抗细菌病相关基因表达水平的分析

[0083] 1、半滑舌鳎抗病和易感家系的制作：采用申请人陈松林以前发明的方法建立半滑舌鳎抗病家系和易感家系(陈松林等，2010)。

[0084] 2、抗病家系和易感家系不同组织抗细菌病相关基因表达水平的测定

[0085] (1)采取2014年半滑舌鳎抗病家系和易感家系各3条鱼的肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃和血液6个组织。RNA提取、定量PCR所用引物、试剂和实验方法均同前面介绍。荧光定量PCR和半定量PCR结果均显示：肝脏、肾脏、脾脏中抗细菌病相关基因的表达水平在抗病家系和易感家系中没有明显差别，而抗病家系鱼的肠、鳃中的抗细菌病相关基因的表达水平均高于易感家系(图6)。

[0086] (2)2017年抗病家系和易感家系不同组织中抗细菌病相关基因表达水平的检测[0087] 采取2017年的半滑舌鳎抗病家系和易感家系各5条鱼的肝、脾肾、肠和鳃5个组织。RNA提取方法、定量PCR所用引物、试剂和实验方法均同上一步。荧光定量PCR和半定量PCR结果均显示：肝脏、肾脏、脾脏中基因的表达水平在抗病家系和易感家系中没有明显差别，在抗病家系鱼的肠和鳃中基因的表达量比易感家系鱼的高，尤其肠中最为显著(图7)。由此重复出2014年抗病家系和易感家系的结果。

[0088] 通过对2014年和2017年的半滑舌鳎抗病家系和易感家系各个组织抗细菌病相关基因表达水平的检测，表明肠和鳃中的抗细菌病相关基因的表达水平与抗病力之间存在正相关关系。可以将肠或鳃中抗细菌病相关基因表达水平的高低作为抗病力的一个指标，用于抗病家系选育。

[0089] (3)半滑舌鳎肠中抗细菌病相关基因的表达水平作为抗病力评价指标的应用方法[0090] 采集半滑舌鳎家系鱼的肠，提取RNA，反转录成cDNA。

[0091] 按照常规定量PCR方法进行基因表达水平分析，采用actin作为内参，绘制表达水平图，比较不同家系半滑舌鳎成鱼肠中的抗细菌病相关基因的表达水平，表达水平越高，抗病力越强。选取抗细菌病相关基因表达水平高的家系中的成鱼培育成亲鱼用于繁殖后代，可以生产出抗细菌病能力提高的半滑舌鳎鱼苗。本发明的方法首次将肠中抗细菌病相关基因的表达水平作为鱼体抗细菌病能力评价的指标，由此建立了半滑舌鳎抗病力检测的一种分子方法，这个方法在半滑舌鳎抗病力测试及抗病家系选育中具有重大应用价值，也可以在其它鱼类抗病育种上进行推广应用。