一种肿瘤通用疫苗的设计方法及胰腺癌通用疫苗

摘要

本发明公开了一种肿瘤通用疫苗的设计方法及其在胰腺癌的应用，设计方法包括：寻找肿瘤的所有突变位点的数据；对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率；利用数据计算每个基因在对应癌症中的表达量；判断多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；若存在n个突变的组合满足其中n为满足条件的最小值，则为最大覆盖的最少突变组合；将突变组合输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列；通过这样的设计方法得到的通用型多肽疫苗组合覆盖患者的覆盖率高，缩短患者等待治疗的时间，提高免疫效果，降低肿瘤的耐药发生概率。

权利要求

1.一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：寻找肿瘤的所有突变位点的数据；

对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；

分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率，突变频率：F＝Nmut/Ntotal，其中F表示突变位点的群体频率，Nmut表示携带该突变的患者人数，Ntotal表示总患者数；若F<1％，则剔除该位点；

利用数据计算每个基因在对应癌症中的表达量，即RPKM值，若RPKM<1，则剔

除该位点；

对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；

对选取出的突变型多肽免疫原性强的位点，若存在n个突变的组合满足则Cn为最大覆盖的最少突变组合，其中n表示满足条件的最小值，Cn表示n个突变的组合，F表示覆盖患者的比例；该n个突变的组合为最大覆盖的最少位点组合；

将最大覆盖位点组合对应的短多肽，输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，寻找肿瘤的所有突变位点的数据；数据包括：TCGA所有33种癌症的体细胞突变数据和read counts数据；所述体细胞突变数据包括：染色体，位置，基因，功能，蛋白变化，突变样品；Read counts数据包括：所有基因在不同患者中reads丰度的信息。

3.根据权利要求1所述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；具体方法概述如下：

1)获得可递呈长度的多肽：

根据突变位点在基因组上的位置，在ensembl数据库中找出其对应的转录本编号，提取CDS序列，此序列为野生型序列；

根据突变信息对这条CDS序列进行修改，得到突变后的CDS序列，此为突变型CDS序列；

根据密码子与氨基酸的对应关系，将野生型和突变型CDS序列翻译成氨基酸序列；

根据基因组坐标Sdna换算成蛋白序列的坐标Sprotein：Sprotein＝∏Sdna/3，其中∏表示向上取整；根据突变在蛋白序列上的坐标，以突变氨基酸为中心，分别向前向后截取MHC II型分子能够结合的最大长度16个氨基酸，得到一条包含所有突变表位的长多肽；

2)根据样本数据库统计高频HLA分型及频率；

3)利用机器学习算法的软件预测每条突变型多肽，对应的野生型多肽与所有高频HLA的亲和力，通过整合软件的预测结果，得到每条多肽最终的亲和力等级，亲和力等级分为3种：强，弱，无；

4)统计每个突变位点对应的不同的亲和力等级的多肽数目，过滤掉没有强亲和力多肽的位点；

5)对于有亲和力的突变位点，若存在突变多肽的亲和力比对应的野生型多肽的亲和力强，则认为该突变可以增强野生多肽的免疫原性，保留该位点；

若所有多肽与所有高频HLA均无亲和力或者所有有亲和力的突变多肽的亲和力均不高于对应的野生型多肽的亲和力，则过滤掉该位点。

4.根据权利要求3所述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，根据样本数据库统计高频HLA分型及频率：样本数据库包括：公共数据库，临床患者数据库；将公共数据库，临床患者数据库的高频HLA合并去重之后作为通用多肽疫苗的候选HLA分型。

5.根据权利要求3所述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，所述机器学习算法的软件包括：netMHCpan，netMHC，Pickpocket。

6.一种胰腺癌通用疫苗，其特征在于，

疫苗设计过程如下：

寻找胰腺癌肿瘤的所有突变位点的数据；

对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；

分析每个突变位点在胰腺癌人群中的突变频率，突变频率：F＝Nmut/Ntotal，其中F表示突变位点的群体频率，Nmut表示携带该突变的患者人数，Ntotal表示总患者数；若F<1％，则剔除该位点；

利用数据计算每个基因在胰腺癌中的表达量，即RPKM值，若RPKM<1，则剔除

该位点；

对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；

对选取出的突变型多肽免疫原性强的位点，若存在n个突变的组合满足则Cn为最大覆盖的最少突变组合，其中n表示满足条件的最小值，Cn表示n个突变的组合，F表示覆盖患者的比例；该n个突变的组合为最大覆盖的最少位点组合；

将最大覆盖位点组合对应的短多肽，输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列；

得到的胰腺癌的多肽疫苗序列组合针对如下突变：KRAS-G12R，KRAS-G12V，CDKN2A-H83Y，KRAS-Q61H，TP53-R248W，CDKN2A-P94L。

说明书

一种肿瘤通用疫苗的设计方法及胰腺癌通用疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，特别是一种肿瘤通用疫苗的设计方法及其在胰腺癌的应用。

背景技术

[0002] 癌症(cancer)也称恶性肿瘤，是由于机体细胞失去正常调控，过度增殖而引起的疾病。过度增殖的细胞称癌细胞，癌细胞常可侵犯周围组织(浸润，invasion)，甚至可经体内循环系统和/或淋巴系统转移到身体其他部分(癌症转移)。世界上影响因子最高的医学期刊——《临床肿瘤杂志》(CA:A Cancer Journal for Clinicians,CA Cancer J Clin)公布了2018年全球185个国家关于36种类型肿瘤的发病率和死亡率，预计到2018年，全球将有1810万肿瘤新发病例和960万肿瘤死亡病例。其中肺癌是发病率最高的癌症，占总病例数的
11.6％，并且是癌症死亡的主要原因，占癌症总死亡人数的18.4％。发病率较高的其他癌症分别为乳腺癌(11.6％)，结直肠癌(10.2％)，前列腺癌(7.1％)和胃癌(5.7％)。死亡率较高其他癌症分别为结直肠癌(9.2％)，胃癌(8.2％)和肝癌(8.2％)。国家癌症中心发布的最新的癌症数据显示，2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例,我国每天约有1万人确诊为癌症，相当于每分钟就有7人患癌。肿瘤发病率为278.07/10万，肿瘤死亡率为167.89/
10万。

[0003] 目前，绝大多数癌症的治疗原则仍然是以外科手术治疗为主，放疗、化疗为辅。多数癌症在早期并无明显的特征，当发现的时候已处于中、晚期，癌细胞很可能已经转移到了身体其他部分，手术的方法并不能完全切除肿瘤，术后五年生存率也低；一些癌症对放化疗敏感性较低，并不能从放、化疗中明显获益；化疗药物对杀灭肿瘤细胞并无特异性，在杀死癌细胞的同时也会大量杀死正常细胞现，使人体出现恶心、呕吐、脱发、白细胞减少等毒、副作用，常常使病人难以耐受，强大的毒副作用使化疗难以执行，过度化疗可能缩短患者的存活期。当传统的治疗方法不能够带来最好的治疗获益，靶向药治疗也作为一种可选的治疗方法。例如，NCCN指南中用于治疗子宫内膜癌的药物包括Bevacizumab和Trastuzumab；目前经CFDA批准的用于治疗胰腺癌的药物包括Gemcitabine,Capecitabine和Erlotinib等。但靶向药治疗也同样存在副作用较大的问题，而且随着用药时间的加长，病人很容易出现耐药性，从而对靶向药不敏感。相较于上述方法的弊端，免疫治疗显示出光明前景，但却只有一小部分人有效。以pembrolizumab为例，在黑色素瘤中有效率只有33％，在其它肿瘤中的有效率大多也在10-30％之间。

[0004] 在此背景下，肿瘤疫苗开始受到重视，利用肿瘤多肽疫苗诱导机体免疫应答从而消灭癌细胞的方法更为安全，有效。肿瘤多肽疫苗是一种精准的医疗策略，它可以特异性靶向癌细胞，理论上可以做到消除所有肿瘤及其转移灶。近年来，由于肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原的发现，以及人们对肿瘤诱导免疫应答和肿瘤逃避免疫监视机制的深入研究和理解，肿瘤多肽疫苗的研究已经取得了可喜的成就。2008年，Yang B等人利用KRAS G12V突变多肽负载树突状细胞，在小鼠体内引起了强烈的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，能够特异性的杀伤胰腺癌细胞。2011年，Synne Wedén等人研究发现，KRAS氨基酸序列上第5-21位，长度为17且其中第12位氨基酸发生突变的多肽序列，在胰腺癌患者体内能够引起强烈的免疫反应，并且能够有效的延长胰腺癌患者的生存周期。2016年，Doreen O.Jackson等人研究发现，在剂量为1000mcg时，多肽疫苗E39显著降低了子宫内膜癌的复发率，且2年无病生存率显著提高。多项研究表明，肿瘤多肽疫苗在肿瘤治疗甚至治愈方面有着特殊的优势和光明的前景。

[0005] 个体化多肽疫苗的一般设计流程，是根据肿瘤患者的个体遗传基因结构和功能差异，找出患者肿瘤组织特有的体细胞突变，分析出这些突变产生的新生抗原，用化学合成方法制备能够被患者组织相容性复合体(MHC)特异识别的多肽疫苗，注入患者体内，激活特异性T细胞应答和免疫风暴。然而，如果按照目前的个体化设计方法，必须针对每一位患者单独制备一组疫苗序列和治疗方案，这些序列和方案的普适性极低。目前从患者样本采集，到遗传信息检测，再到多肽疫苗制备完成，整个过程需要花费大概10-12周左右的时间。期间，患者不仅要遭受身体不适的煎熬，而且一旦病情有所恶化，就会错过最佳的治疗时机。虽然，有研究报道过部分可以用于治疗癌症的多疫苗肽，但这些研究的重点在于某一条或某几条疫苗肽的免疫效果，并没有考虑到疫苗肽的适用范围，研究成果只能覆盖一小部分患者。

[0006] 此外，鉴于癌症治疗难，死亡率高的现状，提前做到有效预防就显得尤其重要。因此，针对这些问题，我们开发了兼具癌症治疗性及预防性的通用型多肽疫苗。

发明内容

[0007] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤通用疫苗的设计方法及胰腺癌通用疫苗，通过这样的设计方法得到的通用型多肽疫苗组合覆盖患者的覆盖率高，只需要简单的个别突变位点检测，就能够直接用于携带有突变的患者，缩短患者等待治疗的时间；组合疫苗肽的免疫效果要强于单条疫苗肽的免疫效果；且多靶点的治疗方案可以有效降低肿瘤的耐药发生概率，使得治疗效果更佳更持久。

[0008] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

[0009] 一种肿瘤通用疫苗的设计方法，包括如下步骤：

[0010] 寻找肿瘤的所有突变位点的数据；

[0011] 对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；

[0012] 分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率，突变频率：F＝Nmut/Ntotal，其中F表示突变位点的群体频率，Nmut表示携带该突变的患者人数，Ntotal表示总患者数；若F<1％，则剔除该位点；

[0013] 利用数据计算每个基因的在对应癌症中的表达量，即RPKM值，

[0014] 若RPKM<1，则剔除该位点；

[0015] 对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；

[0016] 对选取出的突变型多肽免疫原性强的位点，若存在n个突变的组合满足则Cn为最大覆盖的最少突变组合，其中n表示满足条件的最小值，Cn表示n个突变的组合，F表示覆盖患者的比例；该n个突变的组合为最大覆盖的最少位点组合；

[0017] 将最大覆盖位点组合对应的短多肽，输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列。

[0018] 前述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，寻找肿瘤的所有突变位点的数据；数据包括：TCGA所有33种癌症的体细胞突变数据和read counts数据；所述体细胞突变数据包括：染色体，位置，基因，功能，蛋白变化，突变样品；Read counts数据包括：所有基因在不同患者中reads丰度的信息。

[0019] 前述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；具体方法概述如下：

[0020] 1)获得可递呈长度的多肽：

[0021] 根据突变位点在基因组上的位置，在ensembl数据库中找出其对应的转录本编号，提取CDS序列，此序列为野生型序列；

[0022] 根据突变信息对这条CDS序列进行修改，得到突变后的CDS序列，此为突变型CDS序列；

[0023] 根据密码子与氨基酸的对应关系，将野生型和突变型CDS序列翻译成氨基酸序列；

[0024] 根据基因组坐标Sdna换算成蛋白序列的坐标Sprotein：Sprotein＝∏Sdna/3，其中∏表示向上取整；根据突变在蛋白序列上的坐标，以突变氨基酸为中心，分别向前向后截取MHCII型分子能够结合的最大长度16个氨基酸，得到一条包含所有突变表位的长多肽；

[0025] 2)根据样本数据库统计高频HLA分型及频率；

[0026] 3)利用机器学习算法的软件预测每条突变型多肽，对应的野生型多肽与所有高频HLA的亲和力，通过整合软件的预测结果，得到每条多肽最终的亲和力等级，亲和力等级分为3种：强，弱，无。

[0027] 4)统计每个突变位点对应的不同的亲和力等级的多肽数目，过滤掉没有强亲和力多肽的位点；

[0028] 5)对于有亲和力的突变位点，若存在突变多肽的亲和力比对应的野生型多肽的亲和力强，则认为该突变可以增强野生多肽的免疫原性，保留该位点；

[0029] 若所有多肽与所有高频HLA均无亲和力或者所有有亲和力的突变多肽的亲和力均不高于对应的野生型多肽的亲和力，则过滤掉该位点。

[0030] 前述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，根据样本数据库统计高频HLA分型及频率：样本数据库包括：公共数据库，临床患者数据库；将公共数据库，临床患者数据库的高频HLA合并去重之后作为通用多肽疫苗的候选HLA分型。

[0031] 前述的一种肿瘤通用疫苗的设计方法，机器学习算法的软件包括：netMHCpan，netMHC，Pickpocket。

[0032] 一种胰腺癌通用疫苗，

[0033] 疫苗设计过程如下：

[0034] 寻找胰腺癌肿瘤的所有突变位点的数据；

[0035] 对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；

[0036] 分析每个突变位点在胰腺癌人群中的突变频率，突变频率：F＝Nmut/Ntotal，其中F表示突变位点的群体频率，Nmut表示携带该突变的患者人数，Ntotal表示总患者数；若F<1％，则剔除该位点；

[0037] 利用数据计算每个基因在胰腺癌中的表达量，即RPKM值，

[0038] 若RPKM<1，则剔除该位点；

[0039] 对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；

[0040] 对选取出的突变型多肽免疫原性强的位点，若存在n个突变的组合满足则Cn为最大覆盖的最少突变组合，其中n表示满足条件的最小值，Cn表示n个突变的组合，F表示覆盖患者的比例；该n个突变的组合为最大覆盖的最少位点组合；

[0041] 将最大覆盖位点组合对应的短多肽，输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列；

[0042] 得到的胰腺癌的多肽疫苗序列组合针对如下突变：KRAS-G12R，KRAS-G12V，CDKN2A-H83Y，KRAS-Q61H，TP53-R248W，CDKN2A-P94L。

[0043] 本发明的有益之处在于：

[0044] 1.本发明的肿瘤通用疫苗设计方法，可以在大样本量的基础上分析各种癌症的通用型多肽疫苗组合，每种癌症的疫苗组合以最少的突变覆盖最多的患者，具有普适性和通用性。例如在胰腺癌中，按照本发明的方法筛选得到的6个突变位点覆盖患者比例达到46.2％。

[0045] 2.相比个体化定制的多肽疫苗，本发明提供的通用型多肽疫苗组合疗法，不需要经过基因组测序、数据分析及疫苗定制等步骤，而只需要简单的个别突变位点检测，就能够直接用于携带有突变的患者，将患者等待治疗的时间从70-90天缩短到1-2天，能够使患者不错过最佳治疗的时间窗口，也可以大幅度降低医疗成本；

[0046] 3.本发明给出的组合疫苗肽的免疫效果要强于单条疫苗肽的免疫效果。疫苗肽在体内被酶切成的短多肽，有些可以被I型HLA递呈刺激CD8+细胞的产生，有些可以被II型HLA递呈刺激CD4+细胞的产生。CD4+细胞分泌的细胞因子会刺激更多的CD8+细胞产生并聚集，从而更有效的杀伤肿瘤细胞。CD4+细胞和CD8+细胞与HLA之间的协同增效作用，能够产生更强的免疫反应；

[0047] 4.目前针对癌症治疗的靶向药大多数是靶向单个靶点，长时间的用药容易产生耐药性。本发明提供的通用型多肽疫苗可以同时靶向多个靶点，多靶点的治疗方案可以有效降低肿瘤的耐药发生概率，使得治疗效果更佳更持久；

[0048] 5.本发明给出的组合疫苗肽不仅可以用于治疗相关癌症，还可以用于预防相关癌症的发生和复发；当未患癌症的健康人或手术后的癌症患者注射本发明的组合疫苗后，体内会产生靶向相关疫苗的特异性杀伤性T细胞和记忆T细胞。在正常细胞癌变过程中，若产生突变组合中的一个或者多个，体内已存在的T细胞能够迅速识别并清除携带突变的细胞，从而有效的预防癌症的发生。

附图说明

[0049] 图1是本发明设计方法的一种实施例的流程图；

[0050] 图2是本发明胰腺癌的不同个数位点组合覆盖患者的比例图；

[0051] 图3是本发明胰腺癌多肽的免疫原性检测结果示意图；

[0052] 图4是本发明胰腺癌多肽诱导的细胞毒性实验的结果示意图；

[0053] 图5是本发明胰腺癌多肽疫苗在小鼠体内对胰腺癌的抑制效果示意图；

[0054] 图6是本发明胰腺癌多肽疫苗在小鼠体内对胰腺癌的预防效果示意图；

[0055] 图7是本发明胰腺癌单条多肽疫苗在小鼠体内对胰腺癌的抑制效果示意图。

具体实施方式

[0056] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

[0057] 如图1所示，一种肿瘤通用疫苗的设计方法，包括如下步骤：

[0058] 寻找肿瘤的所有突变位点的数据；

[0059] 数据包括：TCGA所有33种癌症的体细胞突变数据和read counts数据；所述体细胞突变突变数据包括：染色体，位置，基因，功能，蛋白变化，突变样品；Read counts数据包括：所有基因在不同患者中reads丰度的信息。

[0060] 对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点，这些突变能够改变蛋白氨基酸序列；剔除了位于基因内含子(intronic)、外显子的非转录区域(UTR)、基因间区(intergenic)、假基因(pseudo gene)等区域的突变，同时也剔除外显子转录区域的同义突变，因为这些突变要么在转录剪切阶段就被酶体特异性切除，要么在翻译阶段没有被翻译，不会对下游蛋白产物产生影响。

[0061] 分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率，突变频率：F＝Nmut/Ntotal，其中F表示突变位点的群体频率，Nmut表示携带该突变的患者人数，Ntotal表示总患者数；若F<1％，说明该突变位点很可能只是随机产生，在特定癌种中并不高发，不适宜作为候选突变，则剔除该位点；

[0062] 利用下载的read counts数据计算每个基因的在对应癌症中的表达量，即RPKM值，RPKM＝比对到基因区域的短读段数/(比对到全基因组外显子区域的总短读段数(millions)*基因外显子区域的长度(kb))，若RPKM<1，则说明该基因表达水平很低，其蛋白产物浓度可能极低，因此该蛋白上的突变片段被MHC提呈到细胞膜表面并成为新抗原的可能性不大，因此剔除该位点；

[0063] 对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；具体方法概述如下：

[0064] 1)获得可递呈长度的多肽：

[0065] 根据突变位点在基因组上的位置，在ensembl数据库中找出其对应的转录本编号，提取CDS序列，此序列为野生型序列；

[0066] 根据突变信息对这条CDS序列进行修改，得到突变后的CDS序列，此为突变型CDS序列；例如突变信息为G100T，就将第100位的鸟嘌呤(G)替换为胸腺嘧啶(T)，得到突变后的CDS序列(即突变型)；

[0067] 根据密码子与氨基酸的对应关系，将野生型序列和突变型CDS序列翻译成氨基酸序列；根据基因组坐标(Sdna)换算成蛋白序列的坐标(Sprotein)：Sprotein＝∏(Sdna/3)，其中∏表示向上取整，例如，基因组坐标100，蛋白序列则为∏(100/3)＝34；根据突变在蛋白序列上的坐标，以突变氨基酸为中心，分别向前向后截取MHC II型分子能够结合的最大长度16个氨基酸，得到一条包含所有突变表位的长多肽；

[0068] 2)根据样本数据库统计高频HLA分型及频率；样本数据库包括：公共数据库(IMGT/HLA及中华骨髓库)，临床患者数据库；将公共数据库，临床患者数据库的高频HLA合并去重之后作为通用多肽疫苗的候选HLA分型。需要说明的是：临床患者数据库可以有一个或多个，数量不受限制。

[0069] 3)利用机器学习算法的软件预测每条突变型多肽，对应的野生型多肽与所有高频HLA的亲和力，通过整合软件的预测结果，得到每条多肽最终的亲和力等级，亲和力等级分为3种：强，弱，无。作为一种实施例，机器学习算法的软件包括：netMHCpan，netMHC，Pickpocket；通过这三个软件预测每条突变多肽和对应的野生型多肽与所有高频HLA的亲和力，通过整合3个软件的预测结果，得到每条多肽最终的亲和力等级，亲和力等级分为3种：强，弱，无。

[0070] 4)统计每个突变位点对应的不同的亲和力等级的多肽数目，过滤掉没有强亲和力多肽的位点。

[0071] 5)对于有亲和力的突变位点，若存在突变多肽的亲和力比对应的野生型多肽的亲和力强，则认为该突变可以增强野生多肽的免疫原性，保留该位点；

[0072] 若所有多肽与所有高频HLA均无亲和力或者所有有亲和力的突变多肽的亲和力均不高于对应的野生型多肽的亲和力，则过滤掉该位点。

[0073] 对选取出的突变型多肽免疫原性强的位点，若存在n个突变的组合满足则Cn为最大覆盖的最少突变组合，其中n表示满足条件的最小值，Cn表示n个突变的组合，F表示覆盖患者的比例；即任意n+1个突变所覆盖的患者比例比某n个突变所覆盖的患者比例增加不超过1％，该n个突变的组合为最大覆盖的最少突变位点组合；这样可以使得患者以较低的治疗成本获得较大的适用概率。

[0074] 将最大覆盖的最少突变位点组合对应的短多肽，输入我们自主研发的疫苗设计程序iNeo-VaDes(V1.2)，设计多肽疫苗序列。疫苗设计程序考虑到了多肽疫苗下游化学合成的难易程度和安全性等多种因素。例如，影响多肽化学合成难易程度的因素包括多肽的长度，疏水率、酸性氨基酸、碱性氨基酸、连续疏水氨基酸、重复氨基酸，PH值等；影响多肽安全性的因素包括毒性，同源性等。综合上述因素，设计出易于合成，安全性高，覆盖尽可能多的表位，以及增加表位被递呈概率的多肽疫苗序列。

[0075] 实施例1，利用上述方法筛选胰腺癌的多肽疫苗序列组合；

[0076] 样本数据库中采用的临床患者数据库如下表所示：

[0077]

[0078]

[0079] TCGA中有突变数据的胰腺癌(PAAD)患者共182例，利用上述方法筛选得到如下6个突变，覆盖了46.2％(84/182)的患者。胰腺癌的多肽疫苗序列组合针对如下突变：KRAS-G12R，KRAS-G12V，CDKN2A-H83Y，KRAS-Q61H，TP53-R248W，CDKN2A-P94L；具体信息如下表所示：

[0080]

[0081] 注：G12R表示氨基酸序列上第12位置上的甘氨酸G突变成了甘氨酸R；下划线字体表示突变氨基酸。

[0082] 需要说明的是，在体内起到免疫作用的是包含突变氨基酸，长度为8-16的连续短多肽，由这些连续短多肽演变的所有序列都在本发明的保护范围内。

[0083] 对比例1：

[0084] 以“KRAS-G12D”替代实施例1中的“KRAS-G12V”，6个位点的组合最大能覆盖53.8％的患者。

[0085] 但是对比例1的免疫效果远不如实施例1；下文中的实验2证明KRAS-G12D免疫原性极其微弱。

[0086] 对比例2：

[0087] 在所有候选位点中，随机抽取1个位点、2个位点组合、3个位点组合……9个位点组合各1000次，每次抽取结果覆盖患者比例如图2所示。横坐标表示不同个数的位点组合，纵坐标表示覆盖患者的比例，箱线图中间加粗黑线表示中位数，红色虚线代表覆盖率为46.2％。每种位点组合的箱线图代表随机抽取1000次的结果；由图可知，6个位点的组合已经可以达到46.2％的患者覆盖，多于6个位点的组合覆盖患者比例不超过46.2％。

[0088] △实验1：构建含特定突变位点的稳转细胞系；

[0089] 实验目的：为了验证本发明中胰腺癌多肽疫苗的治疗及预防效果，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系。

[0090] a.构建突变位点真核表达质粒

[0091] 采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部6条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associated membrane glycoprotein 1，LAMP1)，6条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，6条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为mut6-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为wild6-pcDNA3.1(+)。为了验证靶的特异性，另设计了只含有本发明中的1个突变位点—KRAS-G12R的突变多肽，命名为mut1-pcDNA3.1(+)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建，氨基酸序列如下所示：

[0092] 其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列；

[0093] wild6氨基酸序列

[0094]

[0095]

[0096] mut6氨基酸序列

[0097]

[0098] mut1氨基酸序列

[0099]

[0100] b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系

[0101] 人胰腺癌细胞株BxPC-3以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将2.5μg mut6-pcDNA3.1(+)质粒、2.5μg wild6-pcDNA3.1(+)质粒和2.5μg mut1-pcDNA3.1(+)质粒稀释于3份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTM Reagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于3份含有1000μl无血清RPMI-
1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。同时转染pcDNA3.1(+)-Hygro空载体质粒作同法抗性筛选，作为对照细胞，命名为BxPC-3(含有pcDNA3.1(+))。上述方法中，用mut6-pcDNA3.1(+)质粒，wild6-pcDNA3.1(+)质粒和mut1-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名为mut6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))、wild6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))，mut1-BxPC-3(含有mut1-pcDNA3.1(+))。

[0102] △实验2：多肽的免疫原性测定

[0103] 实验目的：通过ELISpot实验，验证本发明中6条多肽在人源化小鼠体内均能引起免疫反应，且6条多肽混合的免疫效果强于单条多肽的免疫效果；并且，对比例1中的未入选位点KRAS-G12D几乎不能引起免疫反应。

[0104] 实验方法：

[0105] 为了检测多肽的免疫反应，实施IFN-γ酶联免疫吸附(ELISPOT)测定法。详细的实验过程如下：选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)27只，随机分为9组，每组3只。适应一周后，分为阴性对照组编号1、6个单条多肽组编号3-8(共6组)、6条混合多肽组编号9、未入选位点KRAS-G12D对应多肽组编号10。采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只,再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，共三周，第三次免疫后10天，取的小鼠脾脏，制备小鼠淋巴细胞悬液，用于ELISPOT检测。留取编号3-9部分小鼠淋巴细胞悬液用于实验3。

[0106] ELISPOT检测结果中，IFN-γ呈阳性结果的多肽，即判定为阳性候选多肽。将小鼠淋巴细胞稀释成浓度为1-2*106/mL，铺24孔板，每孔1mL，分为对照组(与多肽相同浓度的DMSO)、6个单条多肽组、6条多肽混合组、对比例1中KRAS-G12D对应的多肽组，PHA阳性对照组编号2(PHA组淋巴细胞来源于阴性对照组)，共计10组，分别加入相应的多肽(10μg/mL)，预孵育72h后离心分离细胞，调整细胞浓度为2*106/mL，上IFN-γ Elispot板，按照IFN-γ ELISPOT试剂盒的说明书方法进行显色，运用CTL-ImmunoSpotS5系列酶联斑点分析仪读取产生的斑点数。IFN-γ阳性结果表明有抗原特异性T细胞产生，视为多肽能引起机体的免疫反应，斑点数的多少反映其免疫的强弱。

[0107] 实验结果：

[0108] 实验结果如图3所示，1为对照组，2为PHA组，3-8为6个单条多肽组，9为6条多肽混合组，10为未入选位点KRAS-G12D对应多肽组，a，b代表每组随机选择2只小鼠，每只小鼠3个重复。每百万个细胞中，6个单条多肽组都能产生约30-150个斑点，说明6条多肽单独都能引起免疫反应。对比例1中KRAS-G12D对应多肽组基本无斑点产生，说明该多肽几乎不能引起免疫反应；同时，6条多肽混合组诱导产生的斑点数平均达400个以上，显著高于6个单条多肽组，说明其组合能引起更强的免疫反应。

[0109] △实验3：体外细胞杀伤实验

[0110] 实验目的：验证6条多肽在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果，且6条多肽混合之后的杀伤效果强于单条多肽的杀伤效果。

[0111] 实验方法：

[0112] (1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记mut6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))和wild6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。

[0113] (2)杀伤实验

[0114] a.准备效应细胞：

[0115] 将实验2中留取的7组小鼠淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。

[0116] b.效应细胞CTL的诱导培养：

[0117] 分别将7组淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodium pyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。

[0118] 将mut6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与7种效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。

[0119] 将wild6-BxPC-3(含有mut6-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与7种效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。

[0120] 将96孔板放在37℃培养箱培养4h。

[0121] 将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/mL，染色3min，马上进行流式上机检测。

[0122] 实验结果：

[0123] 如图4所示，A为BxPC-3(wild)诱导的细胞毒性实验图；B为BxPC-3(mut6)诱导的细胞毒性杀伤实验图；E:T代表效应T细胞个数:靶细胞个数，纵坐标表示细胞裂解率。peptide i(i＝1…6)分别代表本发明中的6条多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组,control代表阴性对照。实验组(图4B)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-80％不等，杀伤效率明显高于对照组(图4A)，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，且对比单条多肽，混合多肽的杀伤效率更高，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达90％以上。该实验说明6条突变多肽及其混合组均能有效地激活特异性T细胞免疫应答，且6条多肽混合的杀伤效率明显高于单条多肽引起的杀伤效率。

[0124] △实验4：人源化小鼠模型中本发明疫苗对肿瘤治疗效力的评价；

[0125] 实验目的：验证6条多肽在体内能够激发T细胞对肿瘤细胞的杀伤，且6条多肽混合的杀伤效果强于单条多肽的杀伤效果。

[0126] 实验过程：

[0127] 选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)24只，适应一周后，收集对数生长期的BxPC-3(mut6)细胞，制备成5*106/mL细胞悬液，以0.2mL种于小鼠左前肢腋下。以皮下肿瘤结节直径达5 mm左右为成瘤标准，9-12天内成瘤，选择无出血、无坏死、无感染的小鼠，随机分为8组，每组3只，分6个单条多肽组，6条多肽混合组和空白组(PBS)，分组之后当天免疫，采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只，再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，免疫三次。第28天处死小鼠，用游标卡尺日测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积；

[0128] TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长径和短径，根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)，RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积，绘制相对肿瘤体积曲线，并记录各组动物体重。

[0129] 实验结果：

[0130] 分组处理之前各组移植瘤的生长情况基本一致，体积大小无明显差异(P>0.05)。如图5所示，横坐标表示疫苗注射后的天数，纵坐标表示相对肿瘤体积。peptide i(i＝1…
6)分别代表本发明中的6条多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组，control代表空白对照组。免疫后1周，各组移植瘤生长与对照组相比，其体积大小无明显差异(P>0.05)，随着免疫次数增多和时间的延长，实验组与对照组相比，瘤体大小受抑程度越来越明显，说明6条多肽均能在小鼠体内起到抑制肿瘤生长的作用。同时，从第二周起，6条多肽混合组比每条多肽单独引起的抑制效率显著提高(P<0.01)，说明各多肽之间存在协同增效作用。免疫后2周，其肿瘤已出现缩小的情况，说明疫苗激发的免疫响应对肿瘤细胞产生了杀伤作用。

[0131] △实验5：人源化小鼠模型中本发明疫苗对肿瘤预防效力的评价

[0132] 实验目的：验证6条多肽在人源化小鼠上安全有效且能有效预防肿瘤的发生。

[0133] 实验过程：

[0134] 选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)24只，随机分为8组，每组3只，适应一周后，采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只，再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，分6个单条多肽组，6条多肽混合组和空白组(PBS)，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，免疫三次。第三次免疫后1周，收集对数生长期的BxPC-3(mut6)细胞，制备成5*106个/mL细胞悬液，以0.2mL种于小鼠左前肢腋下。

[0135] 每天记录各组动物的肿瘤发生情况，肿瘤长出来后，用游标卡尺日测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长径和短径，并记录各组动物体重。评价：接种肿瘤四周后，处死所有小鼠，终止实验，计算抑瘤率并进行评价。

[0136] 抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100％。

[0137] 数据处理：采用SPSS软件进行统计学分析，采用单因素方差分析进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

[0138] 实验结果：

[0139] 如图6所示，横坐标表示疫苗注射后的天数，纵坐标表示肿瘤体积。peptide i(i＝1…6)分别代表本发明中的6条多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组，control代表阴性对照组。接种肿瘤10天之后，对照组肿瘤开始缓慢增大，各实验组肿瘤体积抑制明显。与对照组相比，第16天时，各实验组仍无肿瘤形成。随着时间的延长，各实验组瘤体大小缓慢增大，但增长速度明显低于对照组。同时，自接种肿瘤23天起，6条多肽混合组比每条多肽单独引起的抑制效率显著提高(P<0.01)，且在接种肿瘤28天时，6条多肽混合组的瘤体几乎无增长。本试验证实了6条多肽及其混合均能预防特异肿瘤发生，且6条多肽混合的预防效果显著优于每条多肽单独引起的预防效果。

[0140] △实验6：人源化小鼠模型中本发明疫苗对单个位点突变肿瘤的治疗效力的评价。

[0141] 实验目的：为了更真实的模拟现实中的临床情况，即多数患者一般只携带本发明中的1个突变(例如在我们分析的患者人群中，本发明6个突变覆盖的84位患者中，93％的患者(78位)都只携带1个突变)，验证6条多肽混合对单突变肿瘤的治疗效果要优于对应的单条多肽治疗效果。

[0142] 实验过程：

[0143] 选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)15只，适应一周后，收集对数生长期的BxPC-3(mut1)细胞，制备成5*106个/mL细胞悬液，以0.2mL种于小鼠左前肢腋下。以皮下肿瘤结节直径达5 mm左右为成瘤标准，9-12天内成瘤，选择无出血、坏死、感染的小鼠进行组，随机分为4组，每组3只，分多肽组1(相关多肽)，多肽组3(无关多肽)，6条多肽混合组和空白组(PBS)，分组之后当天免疫，采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只，再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，免疫三次。第28天处死小鼠，用游标卡尺日测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积；

[0144] TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长径和短径，根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)，RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积，绘制相对肿瘤体积曲线，并记录各组动物体重。

[0145] 实验结果：

[0146] 分组处理之前4组移植瘤的生长情况基本一致，体积大小无明显差异(P>0.05)。如图7所示，横坐标表示疫苗注射后的天数，纵坐标表示相对肿瘤体积。peptide 1代表突变对应的多肽，peptide 3代表突变无关多肽，peptide pool代表6条多肽的混合组，control代表空白对照。免疫后1周，各组移植瘤生长与对照组相比，其体积大小无明显差异(P>0.05)，随着免疫次数增多和时间的延长，多肽组1和6条多肽混合组的瘤体大小受抑越来越明显，而对照组和不相关多肽组3的肿瘤生长相近，证明了该多肽诱导的杀伤T细胞具有特异性。自21天起，6条多肽混合组比多肽组1单独引起的抑制效率显著提高(P<0.01)，免疫后2周，其肿瘤已出现缩小的情况。说明各多肽之间存在协同作用。

[0147] 通用疫苗对胰腺癌患者的运用方法包括：

[0148] 步骤一，合成多肽疫苗序列；多肽序列可以采用化学合成的方法获得；也可以利用核酸分子(例如DNA或者RNA)通过转录和翻译的方法获得，或者可以通过细菌或病毒为载体表达得到，但不限于上述方法。

[0149] 步骤二，对多肽进行修饰；可以对多肽进行修饰，以增加活体内半衰期、细胞靶向、抗原摄取、抗原处理、MHC亲和力、MHC稳定性或抗原呈递能力。例如偶联至载体蛋白、偶联至配体、偶联至抗体、聚乙二醇化等等。

[0150] 步骤三，皮试；首次注射前，取多肽注射液0.05mL-1mL在前臂进行皮试(若有多组，则每组均进行皮试)，观察15min，看有无红肿等过敏反应，如果有红肿或过敏需要进行异丙嗪注射。

[0151] 步骤四，将多肽疫苗给药到患者，给药周期：5次基础免疫，时间分别为第1、4、8、15、22天；2次加强免疫，时间分别为第78、162天。

[0152] 多肽疫苗给药到患者的过程包括：

[0153] 步骤一，注射佐剂：取40μg免疫佐剂GM-CSF溶液，皮下注射于上臂、腹部等多个位点，简单标记注射位点。佐剂也可以为CpG-ODN、polyIC、STING激动剂、吕盐及纳米颗粒等。

[0154] 步骤二，注射多肽：免疫佐剂注射30min后，取多肽注射液1mL皮下注射至免疫佐剂相同位点或邻近区域，每条多肽总量为100μg-500μg(1cm2内，若有多组，做法相同)。

[0155] 本发明提供一种肿瘤通用疫苗的设计方法及其在胰腺癌的应用，通过这样的设计方法得到的通用型多肽疫苗组合覆盖患者的覆盖率高，只需要简单的个别突变位点检测，就能够直接用于携带有突变的患者，缩短患者等待治疗的时间；组合疫苗肽的免疫效果要强于单条疫苗肽的免疫效果；且多靶点的治疗方案可以有效降低肿瘤的耐药发生概率，使得治疗效果更佳更持久。

[0156] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。