一种快速、高效选育高油酸花生品种的方法

摘要

本发明涉及花生育种技术领域，提供了一种快速、高效选育高油酸花生品种的方法。该方法基于单粒花生种子中AhFAD2基因突变个数与其油酸含量的规律，借助近红外检测单粒花生中油酸含量，通过设置不同的油酸含量的选择条件，无需依赖分子标记，便可以实现在杂交的早期世代对油酸含量进行选择，以快速、高效选育高油酸花生品种，该方法快速、高效、简便、易操作，有效加快高油酸花生品种的育种进程，提高育种效率，并且很大程度上降低了成本。

权利要求

1.一种选育高油酸花生品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以AhFAD2基因型为AABB的普通油酸含量的花生品种冀花4号为母本，以AhFAD2基因型为aabb的高油酸含量的花生品种开农58为父本，进行杂交，得到后代F1；

(2)将F1代自交，分单株收获种子，即F2；

(3)利用近红外光谱检测单粒F2花生种子中油酸的含量，选择油酸含量在70％以上的花生种子；

(4)将F2代按照油酸含量由高到低种植，自交，分单株收获种子，即F3；

(5)利用近红外光谱检测单粒F3花生种子中油酸的含量，选择油酸含量在75％以上的花生种子；

(6)将F3代按照油酸含量由高到低种植，自交，收获单株，即获得F4；

(7)利用近红外光谱检测同一株收获的10粒F4种子中油酸含量，如果10粒种子油酸含量都高于75％，保留这一单株收获的所有F4种子，否则，淘汰；

(8)获得高油酸花生品种；

所述步骤(3)中选择油酸含量在70％以上的花生种子即保留了AhFAD2基因型为aabb、Aabb和aaBb的花生种子；

所述步骤(5)中选择油酸含量在75％以上的花生种子即仅保留AhFAD2基因型为aabb的花生种子；

所述步骤(7)中收获的种子的AhFAD2基因型为aabb。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)将F3代按照油酸含量由高到低种植，自交，进一步根据其农艺性状进行选择，收获农艺性状优异的单株，获得F4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(8)具体包括将选择得到的高油酸花生株系进行扩大繁殖，参加后续株行、株系和产量比较试验，获得高油酸花生品种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(8)进一步包括根据农艺性状对高油酸花生株系进行精选的步骤。

说明书

一种快速、高效选育高油酸花生品种的方法

技术领域

[0001] 本发明属于花生育种技术领域，具体涉及一种快速、高效培育高油酸花生品种的方法。

背景技术

[0002] 花生(Arachis hypogaeaL.)是世界范围内主要的油料与经济作物之一。在国内大宗油料作物中，花生总产、单位面积产油量、种植业产值均居首位，在花生总产仅一半用于榨油的情况下，花生油年产量约270万吨，占国产植物油产量的四分之一，是国产植物油的第二大来源(仅次于菜籽油)。

[0003] 脂肪酸组成是影响花生及其加工产品的营养保健价值、加工特性与效率、耐储藏能力以及市场竞争力的关键品质性状。花生油中的油酸和亚油酸占总脂肪酸的80％左右。油酸是单不饱和脂肪酸，它能选择性地降低人体血液中有害的低密度胆固醇，而保持有益的高密度胆固醇，可有效预防心血管疾病的发生，被誉为“安全脂肪酸”。同时，油酸比亚油酸氧化稳定性强，在高温下不易氧化变质，保质期长。油酸是影响花生油理化稳定性和营养价值的重要品质指标，对花生及其制品的耐储性和人体健康有着非常重要的作用。我国现有普通花生品种油酸含量一般为40％-50％，高油酸花生资源非常匮乏。因此，培育高油酸花生品种已成为现阶段及今后相当长一段时期内花生最重要的育种目标之一。

[0004] 已知FAD2(△12脂肪酸脱氢酶)是脂肪酸生物合成途径中催化油酸在第12碳位引入双键行成亚油酸的关键酶。花生中高油酸性状的产生是由于其基因组中主要在种子中行使功能的两个AhFAD2基因，即AhFAD2A和AhFAD2B都发生了突变，导致其蛋白丧失功能，不能将油酸转变为亚油酸，造成了油酸的大量积累。

[0005] 目前，高油酸花生育种主要采用分子标记在杂交的早期世代进行选择，针对AhFAD2基因的突变位点已经开发了AS-PCR、CAPS、KASP等分子标记，例如中国专利CN108893551A公开了一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用，其通过针对AhFAD2B突变位点设计的特异引物进行PCR，再进行相应酶切最终确定基因型，根据基因型选择得到高油酸株系；中国专利CN103525931A公开了一种花生高油酸性状基因选择方法，其提取花生叶片基因组，采用特异性引物从基因组中扩增AhFAD2A和AhFAD2B基因，测序比对查找突变或插入位点，据此来判定品种油酸含量高低；中国专利CN105519432A公开了一种花生高油酸隐性突变系Ahfad2a-1植株的选育方法，其对花生种子进行γ射线诱变处理，对诱变处理后代进行油酸含量的定向选择，利用近红外检测技术进行单粒检测，获得O/L高于3.0的株系进行鉴定，提取DNA，以Ahfad2a基因特异引物进行PCR，测序分析筛选Ahfad2a-1突变体，以此来判断各株系的油酸含量高低；再如张照华等利用回交和标记辅助选择快速培育高油酸花生品种，其通过杂交、回交和自交得到后代，利用PCR鉴定其基因型，在回交后代中筛选基因型AaBb的后代作为下代回交父本，自交后代基因型鉴定采用KASP分型，获得高油酸(基因型aabb)后代(“利用回交和标记辅助选择快速培育高油酸花生品种及其评价”，张照华等《，中国农业科学》，第51卷第9期，2018年)；Barkley等建立了荧光定量PCR法鉴别花生FAD2突变以鉴定高油酸花生(“Development of a real-time PCR genotyping assay to identify high oleic acid peanuts”，Barkley N A et al.，《Molecular Breeding》，第25卷，2010年)。然而，上述方法需要进行PCR、酶切和/或依赖于昂贵的荧光定量设备和探针，费时费力、操作繁琐，还需要专业人员和昂贵设备、试剂，检测成本高；同时，由于AhFAD2A和AhFAD2B基因序列的高度相似性，会导致鉴定结果具有一定比例的假阳性，这些都限制了上述方法在花生高油酸育种中的应用。

[0006] 而近红外光谱(NIR)检测技术利用有机物质在近红外光谱区的光学特征，能够测定样品中一种或多种化学成分的含量，具有成本低、无损、快速、操作简便、不污染环境等优点，成为了许多育种家脂肪酸检测的首选方法。本发明基于单粒花生种子中AhFAD2基因突变个数与其油酸含量的规律，借助近红外检测单粒花生中油酸含量，实现在杂交的早期世代对油酸含量进行选择，建立了一种不依赖分子标记，依然可以在杂交的早期世代对油酸含量进行选择的快速、高效育种方法。本方法的建立为加速高油酸花生育种进程提供了良好的技术基础，有利于缩短育种周期，提高花生育种效率。

发明内容

[0007] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提出一种快速、高效选育高油酸花生品种的方法。

[0008] 实现本发明上述目的的具体技术方案为：

[0009] 一种选育高油酸花生品种的方法，包括如下步骤：

[0010] (1)将AhFAD2基因型AABB的普通油酸含量的花生亲本，与基因型aabb的高油酸含量的花生亲本杂交，得到后代F1；

[0011] (2)将F1代自交，分单株收获种子，即F2；

[0012] (3)利用近红外光谱检测单粒F2花生种子中油酸的含量，选择油酸含量在70％以上的花生种子，即保留了AhFAD2基因型为aabb、Aabb和aaBb的花生种子，理论上得到这三种基因型种子的概率为31.25％；

[0013] (4)将F2代按照油酸含量由高到低种植，自交，分单株收获种子，即F3；

[0014] (5)利用近红外光谱检测单粒F3花生种子中油酸的含量，选择油酸含量在75％以上的花生种子，即仅保留AhFAD2基因型为aabb的花生种子，理论上得到这种基因型种子的概率为40.00％；

[0015] (6)将F3代按照油酸含量由高到低种植，自交，可根据其农艺性状进行选择，收获农艺性状优异的单株，即获得F4；

[0016] (7)利用近红外光谱检测同一株收获的10粒F4种子中油酸含量，如果10粒都为种子油酸含量都高于75％，保留这一单株收获的所有F4种子，否则，淘汰；

[0017] (8)将选择得到的高油酸花生株系，进行扩大繁殖，参加后续株行、株系和产量比较试验，即可获得高油酸花生品种。

[0018] 本发明选育高油酸花生品种的方法的原理如下：本研究通过分析花生单粒种子中突变的AhFAD2基因的个数与其油酸含量的关系(如表1所示)，发现突变的AhFAD2基因数量对油酸含量具有累加效应：当4个AhFAD2基因都发生突变(基因型为aabb)时，其油酸含量在75％以上；当3个AhFAD2基因都发生突变(基因型为Aabb或aaBb)时，其油酸含量在65％～
75％之间；当突变的AhFAD2基因数目少于3个(基因型为AaBb、AAbb、aaBB、AABb、AaBB或AABB)时，其油酸含量不超过70％。根据此规律，利用近红外光谱检测单粒花生种子中油酸的含量，根据油酸含量就可以快速选择出AhFAD2基因型为aabb的高油酸花生种子。

[0019] 本发明利用近红外光谱检测单粒后代花生种子中油酸含量，在杂种的早期世代针对油酸含量进行选择时，选择条件至关重要，如果选择的条件过于严苛，例如只选75％以上的种子保留，可能造成保留的F2代种子太少，难以在其后代中筛选得到农艺性状优良的单株；如果选择的条件过于宽松，例如选择油酸含量高于65％的种子都保留，可能造成引入携带AaBb、AAbb或aaBB这些基因型的种子，当这些种子再自交一代后，其后代分离复杂(AaBb)或不再分离产生高油酸花生(AAbb或aaBB)，都为后续的选择工作增加了负担。本发明对于选择条件进行了优化，选择在F2代时保留油酸含量在70％以上的花生种子，是依据“当突变的AhFAD2基因数目少于3个(基因型为AaBb、AAbb、aaBB、AABb、AaBB或AABB)时，其油酸含量不超过70％”这一规律确定的，并不是单纯的折中选择，这样保留了基因型为aabb、Aabb和aaBb的花生种子，其后代分离简单，易于选择，并且为后续的农艺性状筛选保留了足够多的F2种子；选择在F3代时选择保留油酸含量在75％以上的花生种子，此时提高选择条件可以确保所选择的花生种子基因型都为aabb，不再混入其它基因型的种子，在后续选择中可以不再针对油酸性状进行选择，减少工作量。

[0020] 本发明基于单粒花生种子中AhFAD2基因突变个数与其油酸含量的规律，借助近红外检测单粒花生中油酸含量，成功地实现了不依赖分子标记，依然可以在杂交后代的早期世代对油酸含量进行选择，其最终筛选到的花生种子AhFAD2基因型均为aabb，并成功选育出高油酸花生品种中花215，该品种已完成区域试验，准备于2019年登记。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0022] (1)本发明提供的选育高油酸花生品种的方法，基于单粒花生种子中AhFAD2基因突变个数与其油酸含量的规律，借助近红外检测单粒花生中油酸含量，实现在杂交的早期世代对油酸含量进行选择，该方法快速、高效、简便、易操作，有效加快高油酸花生品种的育种进程，提高育种效率，并且很大程度上降低了成本。

[0023] (2)本发明的选育高油酸花生品种的方法不依赖分子标记，依然可以在杂交后代的早期世代对油酸含量进行选择，克服了现有技术中使用分子标记方法费时费力、操作繁琐、需要专业人员和昂贵仪器设备、成本高等缺陷。

[0024] (3)本发明通过近红外光谱检测单粒花生中油酸含量，以单粒花生作为检测样品，无需大量花生样品，且样品无需进行预处理，无破坏性，也不会污染环境。

[0025] (4)本发明选择在F2代时保留油酸含量在70％以上的花生种子，保留了基因型为aabb、Aabb和aaBb的花生种子，其后代分离简单，易于选择，并且为后续的农艺性状筛选保留了足够多的F2种子；选择在F3代时选择保留油酸含量在75％以上的花生种子，确保所选择的花生种子基因型都为aabb，不再混入其它基因型的种子，在后续选择中可以不再针对油酸性状进行选择，减少工作量。最终筛选到的花生种子AhFAD2基因型均为aabb，并成功选育出高油酸花生品种中花215，该品种属普通型高油酸花生品种，全生育期123.7天，株高37.43cm，平均亩产荚果370.98公斤，籽仁252.93公斤，百果重194.8克，百仁重84.16克，出仁率67.45％，油酸含量80.2％，亚油酸含量1.6％，含油量53.3％。

具体实施方式

[0026] 以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

[0027] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0028] 实施例1

[0029] 本发明选育高油酸花生品种的方法的原理如下：本研究通过分析花生单粒种子中突变的AhFAD2基因的个数与其油酸含量的关系(如表1所示)，发现突变的AhFAD2基因数量对油酸含量具有累加效应：当4个AhFAD2基因都发生突变(基因型为aabb)时，其油酸含量在75％以上；当3个AhFAD2基因都发生突变(基因型为Aabb或aaBb)时，其油酸含量在65％～
75％之间；当突变的AhFAD2基因数目少于3个(基因型为AaBb、AAbb、aaBB、AABb、AaBB或AABB)时，其油酸含量不超过70％。根据此规律，利用近红外光谱检测单粒花生种子中油酸的含量，根据油酸含量就可以快速选择出AhFAD2基因型为aabb的高油酸花生种子。

[0030] 表1花生中AhFAD2基因突变个数与油酸含量的关系

[0031]

[0032] 一、杂交亲本

[0033] 母本材料是普通油酸含量花生品种冀花4号，其油酸含量为51.9％，父本材料是高油酸花生品种开农58，其油酸含量为80.5％。

[0034] 二、选育及相关验证

[0035] (1)以普通油酸含量花生品种冀花4号(油酸含量51.9％)为母本，高油酸花生品种开农58(油酸含量为80.5％)为父本，进行杂交，收获12粒F1种子；其中母本AhFAD2基因型为AABB，父本基因型为aabb；

[0036] (2)将F1代自交，分单株收获，共收获174粒F2种子；

[0037] (3)利用近红外光谱检测单粒F2花生种子中油酸的含量，共筛选得到38粒油酸含量在70％以上的花生种子，结果如表2所示；选择油酸含量在70％以上的花生种子即保留了AhFAD2基因型为aabb、Aabb和aaBb的花生种子，理论上得到这三种基因型种子的概率为31.25％；

[0038] (4)将F2代按照油酸含量由高到低种植，自交，分单株收获，共收获563粒F3种子；

[0039] (5)利用近红外光谱检测单粒F3花生种子中油酸的含量，共筛选得到196粒油酸含量在75％以上的花生种子，结果如表3所示；选择油酸含量在75％以上的花生种子即仅保留AhFAD2基因型为aabb的花生种子，理论上得到这种基因型种子的概率为40.00％；

[0040] (6)将F3代按照油酸含量由高到低种植，自交，可根据其农艺性状进行选择，收获农艺性状优异的10个F4单株；

[0041] (7)利用近红外光谱检测同一株收获的10粒F4种子中油酸含量，发现这10个株系的10粒F4种子的油酸含量全部高于75％，结果如表4所示。为了进一步验证，本研究将上述10粒种子混合取样，并利用气相色谱分析其油酸含量，发现其油酸含量均在80％及以上，均属于高油酸花生种子，结果如表4所示；

[0042] (8)将来源于同一单株F4种子种植于1-3行内，按行收集该行内每一单株的一片新叶，提取混合样的DNA，利用KASP标记检测AhFAD2的基因型，发现这10个F4株系基因型全部为aabb，结果如表5所示；

[0043] (9)根据农艺性状进行精选，通过扩大繁殖、参加株系和产量比较试验，最终选育出高油酸花生品种中花215；该品种已完成区域试验，准备于2019年登记；该品种属普通型高油酸花生品种，全生育期123.7天，株高37.43cm，平均亩产荚果370.98公斤，籽仁252.93公斤，百果重194.8克，百仁重84.16克，出仁率67.45％，油酸含量80.2％，亚油酸含量1.6％，含油量53.3％。

[0044] 表2单粒近红外光谱检测油酸含量在70％以上的F2花生种子

[0045]

[0046]

[0047] 表3单粒近红外光谱检测油酸含量在75％以上的F3花生种子

[0048]

[0049]

[0050] 表4单粒近红外光谱检测花生F4种子中的油酸含量(％)及其混样气相色谱检测结果

[0051]

[0052] 表5各F4株系AhFAD2的基因型

[0053]

[0054] 本方法的难点在于如何在杂种的早期世代针对油酸含量进行选择，如果选择的条件过于严苛，例如只选75％以上的种子保留，可能造成保留的F2代种子太少，难以在其后代中筛选得到农艺性状优良的单株；如果选择的条件过于宽松，例如选择油酸含量高于65％的种子都保留，可能造成引入携带AaBb、AAbb或aaBB这些基因型的种子，当这些种子再自交一代后，其后代分离复杂(AaBb)或不再分离产生高油酸花生(AAbb或aaBB)，都为后续的选择工作增加了负担。本方法选择在F2代时保留油酸含量在70％以上的花生种子，是依据“当突变的AhFAD2基因数目少于3个(基因型为AaBb、AAbb、aaBB、AABb、AaBB或AABB)时，其油酸含量不超过70％”这一规律确定的，并不是单纯的折中选择，这样保留了基因型为aabb、Aabb和aaBb的花生种子，其后代分离简单，易于选择，并且为后续的农艺性状筛选保留了足够多的F2种子。本方法选择在F3代时选择保留油酸含量在75％以上的花生种子，此时提高选择条件可以确保所选择的花生种子基因型都为aabb，不再混入其它基因型的种子，在后续选择中可以不再针对油酸性状进行选择，减少工作量。

[0055] 根据上文所示实验结果，本发明基于单粒花生种子中AhFAD2基因突变个数与其油酸含量的规律，借助近红外检测单粒花生中油酸含量，成功地实现了不依赖分子标记，依然可以在杂交后代的早期世代对油酸含量进行选择，其最终筛选到的花生种子AhFAD2基因型均为aabb。该方法快速、高效、简便、成本低廉、易操作，有效加快高油酸花生品种的育种进程，提高育种效率，并且很大程度上降低成本。

[0056] 最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。