一种由铁皮石斛种子诱导愈伤组织的方法

摘要

一种由铁皮石斛种子诱导愈伤组织的方法，属农林领域的植物种苗繁育生物技术。铁皮石斛种子液体培养基含2,4‑D，培养瓶投入非球状表面粗糙小石子，常规高压灭菌。铁皮石斛种子接种到培养液，摇瓶机以较高转速振荡培养，种子可高效转化成初代愈伤组织。本发明方法操作简单，效果理想，易于推广应用。

权利要求

1.一种由铁皮石斛种子诱导愈伤组织的方法，铁皮石斛种子液体培养基添加2,4-D，浓度0.1-0.8mg/L培养液，培养瓶投入小石子，30-50粒/100ml培养液，高压灭菌，接种铁皮石斛种子振荡培养，摇瓶机转速140转-170转/分钟；

所述小石子非球状表面粗糙，体积30mm3-200 mm3/粒。

说明书

一种由铁皮石斛种子诱导愈伤组织的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种农林领域的植物种苗繁育生物技术。一种由铁皮石斛种子高效诱导初代愈伤组织的方法。

背景技术

[0002] 植物愈伤组织是植物组织受机械损伤或经组织培养脱分化形成的一种无定形状态薄壁细胞团。愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。

[0003] 兰花组织培养的一般程序为：由外植体诱导形成原球茎，原球茎大量增殖，芽诱导及丛芽大量增殖，兰花的愈伤组织不容易获得，仅在少数情况下会自发或通过添加某些特殊成分获得(田雪琪等，2006，分子植物育种，4(6S)：117-121)，“兰科植物的组培过程中,一但诱导出原球茎,即可以原球茎增殖原球茎的方式进行扩繁,很少再出现愈伤组织”(陈继敏等.2008，农业科技通讯，10：169-170)。此外，外植体诱导的初代愈伤组织，一般来说遗传稳定性好，扩繁、分化能力也较强，将愈伤组织切割、培养，可扩大繁殖出更多的下一代愈伤组织。组培物变异率随培养时间、继代次数的增加而提高有许多报道(刘玲梅等，2008，生物技术通报,5:22-27)，如霍山石斛愈伤组织的继代培养在4代以内才可稳定遗传(邱婧等，2008,分子植物育种，6(3)：532-536)。所以，兰科植物初代愈伤组织不易诱导获得，而为扩大繁殖而长期继代培养极可能出现无性系变异，限制了愈伤组织在生产上的广泛应用。

[0004] 石斛属(Dendrobium)植物可切割芽、茎尖、茎节、叶片、根尖和原球茎等诱导获得愈伤组织，由于用来切取外植体的材料来源有限、手工操作效率低下、诱导成功率低等原因以致无法获得大量初代愈伤组织。在石斛属偶有报道由种子直接诱导出愈伤组织，但愈伤组织只是发育成原球茎过程中出现的副产品，诱导率很低(陈娜等，2013，安徽农业科学,41(3):1038-1040；易明林等，1993，河南农业科学，(9)：43-44)，无法获得大量的初代愈伤组织。

[0005] 铁皮石斛种子细小，呈粉末状，种皮内有一细小的圆形胚，分化不明显，处于原胚阶段(专利申请号:CN200910191211)。种子接种到培养基后，原胚开始发育，形成黄白色点状突起，继而通过细胞不断分裂膨大形成卵形原球茎(宋顺等，2013，41(21):8850－8852)。王卜琼等(王卜琼等，2006,云南植物研究，28(4):399～402)也指出兰科植物种子吸水膨大长成小球体后才继续发育原球茎或根状茎。

[0006] 植物尤其是单子叶植物从外植体诱导愈伤组织的外源激素首选生长素2,4-D，2.4-D对铁皮石斛愈伤组织的诱导形成有促进作用有不少报道(张明等,2000，中国中药杂志，25(6):323-326；赵天榜等,1994，河南农业大学学报28(2):128-133)。

[0007] 种子萌发的芽、叶生长有背地性，根生长有向地性。液体培养基采用振荡培养时，原球茎不断翻滚，扰乱了萌芽长根的方向性，减缓萌芽长根速度。类似的例子有报道固体培养基上的铁皮石斛原球茎芽分化明显，胚状体弱小，悬浮振荡培养基上的原球茎芽分化不明显，胚状体均匀、粗壮(苏江等，2007，西北农业学报，16(4)：161～165)。对蝴蝶兰原球茎进行液体振荡培养,可以阻止生长中的原球茎出现极性分化,抑制芽和根的生长(徐文华，2007,长江大学学报(自科版)农学卷，4(4):71-72)。

[0008] 铁皮石斛果实含成千上万粒种子,种子无菌培养可膨大获得大量小球体，本发明为一种培养铁皮石斛种子直接获得大量初代愈伤组织的方法。

发明内容

[0009] 本发明具体涉及由铁皮石斛(Dendrobium officinale)种子高效诱导初代愈伤组织的方法。

[0010] 铁皮石斛种子吸水，原胚膨大成点状颗粒和小球体，为未分化的细胞团，用来诱导愈伤组织几乎无须经历脱分化，易于诱导出愈伤组织，所以种子培养得到点状颗粒或小球体是本发明诱导愈伤组织的最佳材料。

[0011] 愈伤组织是外植体组织受机械损伤或经组织培养脱分化形成的，本发明采用液体振荡培养，在培养液投放非球状表面粗糙小石子，这样在培养过程中由种子膨大的培养物不断与小石子碰触摩擦，受机械损伤制造伤口，为诱导愈伤组织创造条件。培养基附加生长素2,4-D，有利进入分化时期的培养物(原球茎)受机械损伤后脱分化形成愈伤组织。

[0012] 兰科植物种子、愈伤组织、原球茎液体振荡培养，摇瓶机转速一般不高于120转/分钟，本发明为增加铁皮石斛小球体或幼嫩原球茎相互之间或与小石子碰触摩擦的频率和力度，以较高转速振荡培养种子。

[0013] 本发明采用液体振荡培养的另一个作用是，小球体及未成熟原球茎在培养液翻滚，可减缓原球茎成熟，破坏原球茎转化(萌发)成根、叶(根、叶为特化器官，很难脱分化形成愈伤组织)，振荡尤其是高速振荡使培养液中培养物较多停留在小球体和未成熟原球茎阶段，它们较易脱分化，可提高愈伤组织诱导率。

[0014] 本发明采用的技术方案：

[0015] 配制铁皮石斛种子液体培养基，含2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.1-0.8mg/L培养液，培养瓶投入非球状表面粗糙小石子，体积30mm3-200mm3/粒，30-50粒/100ml培养液，常规高压灭菌。铁皮石斛果实表面杀菌消毒，在无菌环境刨开果实，将种子抖落到培养液，振荡培养摇瓶机转速140转-170转/分钟(r/min)，培养温度为25±2℃，光照10-12h/d。种子得到绿色愈伤组织。

[0016] 本发明的有益效果：本发明培养铁皮石斛种子，种子能高频率膨大成初代愈伤组织，愈伤组织可用常规方法扩繁。该方法操作简单，成本低廉，效果理想，易于推广应用。

附图说明

[0017] 图1至图4为实施例铁皮石斛种子培养生成物的实物图，其中：

[0018] 图1为铁皮石斛种子液体振荡培养得到小球体。

[0019] 图2为采用本发明方法液体振荡培养铁皮石斛种子所得初代愈伤组织，示小石子。

[0020] 图3为采用常规液体振荡培养铁皮石斛种子所得原球茎，少数原球茎分化出芽长叶。

[0021] 图4为铁皮石斛初代愈伤组织继代扩繁得到大量愈伤组织。

[0022] 具体实施方法

[0023] 实施例一

[0024] 铁皮石斛种子基本培养液配方为MS+20％椰子汁(V/V)+蔗糖2.0％(W/V)，容器采用200ml三角瓶，每瓶灌装40-50ml培养液。对照为常规液体培养，采用基本培养液配方，常规高压灭菌。本发明方法的培养液为基本培养基附加2,4-D0.4mg/L，培养液投入20粒非球状表面粗糙小石子，小石子体积80mm3-150mm3/粒，常规高压灭菌。

[0025] 铁皮石斛未开裂果实用水洗净，在超净工作台用70-75％酒精浸泡瞬间杀菌，随后浸泡10％次氯酸钙溶液20分钟，无菌水冲洗2次，剖开铁皮石斛果实，将种子抖落到培养基。对照组摇瓶机转速120转/分钟，本发明方法摇瓶机转速150转/分钟。振荡培养温度为25±2℃，光照12h/d。

[0026] 铁皮种子振荡培养30天膨大成点状颗粒，转黄绿色，约50天膨大成草绿色小球体，直径1mm左右。再过约2个月，对照组常规液体振荡培养的小球体发育成原球茎，直径2mm-3mm，表面光滑，少数原球茎分化出芽长叶，本发明方法小球体则转变成绿色愈伤组织，形状不规则，大小悬殊，总体比对照组的原球茎稍大，表面粗糙，培养瓶没观察到原球茎，也没出芽长叶现象。

[0027] 将本发明方法所得愈伤组织不切割，直接转移到无激素的固体培养基MS+10％生香蕉泥(W/V)+蔗糖2.0％(W/V)+琼脂0.8％(W/V)，常规静置培养，愈伤组织可扩繁出大量的继代愈伤组织。