小儿连翘苷连翘脂素及其衍生物的注射剂

摘要

本发明提供了连翘苷/连翘脂素及其衍生物的注射剂，尤其适合于小儿用药。本发明还包括该注射剂的脱水制剂以及制备方法和应用等。

权利要求

1.连翘苷/连翘脂素注射液剂，其包含连翘苷和连翘脂素，其还包含对于小儿注射给药安全的辅料，其由包括如下步骤的方法制备：取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，所述连翘苷/连翘脂素组合物B由连翘苷与连翘脂素组成，其中连翘苷与连翘脂素的重量之比为90：10，用体积比75：25的乙腈-乙醇混合液200mL溶解完全，备用；取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用；

保持温度为45℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌；滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥；

最终干燥产物加0.9％w/v NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封。

2.权利要求1所述的注射液剂的制备方法，其包括如下步骤：

取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，所述连翘苷/连翘脂素组合物B由连翘苷与连翘脂素组成，其中连翘苷与连翘脂素的重量之比为98：2，用体积比75：25的乙腈-乙醇混合液200mL溶解完全，备用；取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用；

保持温度为45℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌；滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥；

最终干燥产物加0.9％w/v NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封。

3.连翘苷/连翘脂素粉针剂，其包含连翘苷和连翘脂素，其还包含对于小儿注射给药安全的辅料，其由包括如下步骤的方法制备：取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，所述连翘苷/连翘脂素组合物B由连翘苷与连翘脂素组成，其中连翘苷与连翘脂素的重量之比为90：10，用体积比75：25的乙腈-乙醇混合液200mL溶解完全，备用；取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用；

保持温度为45℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌；滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥；

最终干燥产物加0.9％w/v NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装入西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥，加盖密封，即制得冻干粉针剂。

4.权利要求3所述的粉针剂的制备方法，其包括如下步骤：

取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，所述连翘苷/连翘脂素组合物B由连翘苷与连翘脂素组成，其中连翘苷与连翘脂素的重量之比为90：10，用体积比75：25的乙腈-乙醇混合液200mL溶解完全，备用；取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用；

保持温度为45℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌；滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥；

最终干燥产物加0.9％w/v NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装入西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥，加盖密封，即制得冻干粉针剂。

说明书

小儿连翘苷连翘脂素及其衍生物的注射剂

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，更确切的说，本发明涉及一种包含连翘苷和连翘脂素或连翘苷衍生物的注射剂及其制备方法等，该注射剂尤其适合于小儿。技术背景

[0002] 本发明人致力于中药提取物的研究，偶然并惊人地发现了，连翘苷和较少的连翘脂素组成药用组合物，在多种药用方面具有增效、尤其是协同增效的药用效果。例如，中国专利申请CN105362283A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在抗病毒中的应用；中国专利申请CN105796861A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在提高免疫力中的应用；中国专利申请CN106063788A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在治疗呕吐中的应用；中国专利申请CN106063789A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在治疗淋巴节结核病中的应用；中国专利申请CN106063790A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在抗衰老中的应用；中国专利申请CN106063791A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在抗炎症中的应用；中国专利申请CN106063792A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在缓解疼痛中的应用；中国专利申请CN106063793A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在治疗细菌感染中的应用；中国专利申请CN106063794A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在预防和治疗肝损伤中的应用；中国专利申请CN106063795A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在预防和治疗高血脂症中的应用；中国专利申请CN106063796A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在消肿中的应用；中国专利申请CN106063797A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在抗氧化中的应用；中国专利申请CN106176786A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在预防和治疗肥胖中的应用；中国专利申请CN106176788A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在治疗尿路感染中的应用；中国专利申请CN108066350A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在抗预防和治疗老年痴呆中的应用。

[0003] 然而，上述连翘苷/连翘脂素组合物虽然提示可以配制成注射剂来给药，但是由于连翘脂素在水中的溶解度小于20μg/g，连翘苷的溶解度也不高，所以这些专利申请仅公开了口服制剂的配方，没有研究出注射剂配方，而且口服制剂基本上包含环糊精及其衍生物，尤其是β-环糊精及其衍生物。

[0004] 另外，本发明人还研究了连翘苷和连翘脂素的衍生物。例如，中国专利申请CN104650108A公开了一种连翘脂素硫酸酯，其将连翘脂素上的酚羟基硫酸酯化，可以形成相应的钠盐、钾盐、铵盐或其他盐，用于抗病毒；中国专利申请CN104945452A公开了一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物，包括33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷和33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷等，用于抗流感病毒；中国专利申请CN106188176A公开了另一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物，包括连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯、连翘脂素葡萄糖醛酸的钠盐和钾盐等。上述衍生物除了连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯之外，由于引入了酸根，可以成盐，在一定程度上改善了水溶性。

[0005] 当前，儿科用药普遍遵循“口服就不注射”的原则，因此研发适合于小儿的注射剂的需求很低，尤其是连翘苷/连翘脂素组合物可以与环糊精及其衍生物配制成注射剂，所以通常没有必要继续研发新的连翘苷/连翘脂素注射剂；进一步地，对于改善了水溶性的连翘苷和连翘脂素衍生物，更没有必要继续研发新的注射剂。然而，本发明人发现，注射剂对于小儿的快速、剂量准确的给药还是有利的；然而，本发明还发现，环糊精、尤其是β-环糊精会造成较强的溶血性和损伤性肾毒性，即使是本发明人从大量环糊精类型中优选出磺丁基醚-β-环糊精，长期使用后仍旧具有一定的肾脏毒性，这对于肾功能发育还不完全的小儿来说是不利的，至少不利于推广应用，所以，本发明认为还有研发适合于小儿的新的连翘苷/连翘脂素注射剂的必要。

[0006] 现有技术中的药用辅料种类繁多，不同种类间的组合和配比更是天文数字。本发明人经过长期的研究和实践，从大量无法预期效果的医用辅料中令人意外地发现了特定辅料来配制连翘苷/连翘脂素注射剂，在正常用药期内没有出现溶血性和肾毒性，优选的辅料甚至在长期用药后都没有出现溶血性和肾毒性，增强了对小儿用药的安全性，而且便于冷冻干燥和复溶，增强了剂型生产的灵活性，更令人意外的是，优选辅料配制的粉针剂甚至适于制成无针粉注射剂。而且，该剂型的适配性好，对于连翘苷和连翘脂素衍生物也适用。

[0007] 另外，本发明人还发现了连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物具备退热的功效，这可以单独口服应用，也可以配制成注射剂，尤其是适合上述小儿用药的注射剂，拓宽了本发明的应用范围。

发明内容

[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种新的连翘苷/连翘脂素注射剂，特别适合于小儿用药，而且还特别适合灵活生产为不同剂型的注射剂。而且，本发明还提供了该注射剂的制备方法。另外，本发明还提供了连翘苷衍生物的制药应用。

[0009] 具体而言，在第一方面，本发明提供了连翘苷/连翘脂素注射剂，其包含连翘苷和连翘脂素，其还包含对于小儿注射给药安全的辅料。另外，本发明第一方面还提供了连翘苷衍生物注射剂，其包含连翘苷衍生物，其还包含对于小儿注射给药安全的辅料。

[0010] 本发明第一方面的注射剂可以包含连翘苷和连翘脂素为活性成分，优选为仅有的活性成分，即，本发明第一方面的注射剂优选由连翘苷和连翘脂素以及药学上可接受的辅料组成。

[0011] 在本文中，如无相反指示，“连翘苷/连翘脂素”、“连翘苷和连翘脂素”和“连翘苷和连翘脂素组合物”可以互换使用，指的是由连翘苷与连翘脂素组成的组合物，即连翘苷/连翘脂素作为一个整体计量。优选在本发明第一方面的注射剂中，连翘苷与连翘脂素的重量比为2～98：2～98，优选为80～98：2～20，更优选为90～98：2～10，如90:10或98:2。根据本发明人的研究，该连翘苷/连翘脂素可应用于抗病毒等多种药用方面，并且多数产生了协同增效的效果。

[0012] 本发明第一方面的注射剂可以包含连翘苷衍生物为活性成分，优选为仅有的活性成分，即，本发明第一方面的注射剂优选由连翘苷衍生物以及药学上可接受的辅料组成。

[0013] 在本文中，如无相反指示，“连翘苷衍生物”和“连翘苷和连翘脂素衍生物”可以互换使用，指的是本发明人研究获得的连翘苷和连翘脂素的衍生物，包括中国专利申请CN104650108A记载的连翘脂素硫酸酯或其盐、中国专利申请CN104945452A记载的连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物、或中国专利申请CN106188176A连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物或其盐或其酯。优选地，连翘苷衍生物包括连翘脂素硫酸酯或其盐(如钠盐、钾盐或铵盐)、33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、连翘脂素葡萄糖醛酸、连翘脂素葡萄糖醛酸盐(如钠盐或钾盐)或连翘脂素葡萄糖醛酸酯(如，甲酯)。

[0014] 优选本发明第一方面的注射剂是单位制剂(如，一针)，其中连翘苷和连翘脂素含量(即，单位剂量)为5～100mg，优选为20～50mg，如20mg或50mg；或者，其中连翘苷衍生物含量(即，单位剂量)为5～100mg，优选为20～50mg，如20mg或50mg。这样的单位剂量适合小儿施用。在本文中，小儿指的是2至12岁的幼儿或儿童。对于成人，单位剂量可以增加。

[0015] 在本文中，药学上可接受的辅料指基本无毒且不影响活性成分起效的填充剂、稀释剂、增溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂、保护剂、防腐剂或其他制剂辅料。pH调节剂包括药学上可接受的有机酸、无机酸、有机碱和/或无机碱，在本发明的具体实施方式中，pH调节剂是盐酸。渗透压调节剂可以是NaCl或葡萄糖。优选本发明的第一方面的注射剂的pH为6.5～7.5，更优选为7.0～7.3。

[0016] 然而，药学上可接受的辅料非常多，例如常用的β-环糊精，然而它会造成较强的溶血性和损伤性肾毒性，并不适合安全地对小儿注射给药；又如上述pH调节剂和渗透压调节剂，它们无法单独将连翘苷/连翘脂素或连翘苷衍生物配制成稳定的注射剂。现有技术没有给出既能将连翘苷/连翘脂素或连翘苷衍生物配制成稳定的注射剂，又能安全地对小儿注射给药的辅料。

[0017] 本发明第一方面的注射剂包含对于小儿注射给药安全的辅料。优选在本发明第一方面的注射剂中，所述辅料包括L-精氨酸或磺丁基醚-β-环糊精。这些辅料不但能将连翘苷/连翘脂素或连翘苷衍生物配制成稳定的注射剂，而且在正常用药期内不会出现溶血性和肾毒性，对于肾功能发育还不够完全的小儿来说，后者是特别有益的。更优选所述辅料包括L-精氨酸，用它配制的连翘苷/连翘脂素或连翘苷衍生物注射剂即使长期给药，也不会出现溶血性和肾毒性，更加保证了对小儿用药的安全性。优选本发明第一方面的注射剂连续用药7天不产生肾脏毒性，更优选连续用药30天不产生肾脏毒性。

[0018] 具体地，本发明第一方面的注射剂由A和B以及任选的C组成，其中A是连翘苷和连翘脂素或是连翘苷衍生物，B是L-精氨酸或磺丁基醚-β-环糊精，C是水、pH调节剂和/或渗透压调节剂。例如，本发明第一方面的注射剂可以由连翘苷和连翘脂素和L-精氨酸以及水、盐酸和NaCl组成，也可以由连翘苷和连翘脂素和磺丁基醚-β-环糊精以及NaCl组成；又如，本发明第一方面的注射剂可以由连翘苷衍生物和L-精氨酸以及水、盐酸和NaCl组成，也可以由连翘苷衍生物和磺丁基醚-β-环糊精以及NaCl组成。

[0019] 优选在本发明第一方面的注射剂中，连翘苷和连翘脂素与L-精氨酸的重量比为1：10～50，更优选为1：20～30；或者，连翘苷衍生物与L-精氨酸的重量比为1：10～50，更优选为1：20～30。

[0020] 也优选在本发明第一方面的注射剂中，连翘苷和连翘脂素与磺丁基醚-β-环糊精的重量比1：30～150，更优选为1：60～75；或者连翘苷衍生物，与磺丁基醚-β-环糊精的重量比1：30～150，更优选为1：60～75。

[0021] 在本文中，注射剂具有本领域的通常含义，指的是用于注射的剂型的统称。优选本发明第一方面的注射剂是注射液剂，即，所述注射剂包括水。更优选所述注射液剂的制备方法包括连翘苷和连翘脂素与所述辅料混合的步骤；或者，所述注射液剂的制备方法包括连翘苷衍生物与所述辅料混合的步骤。

[0022] 在本发明的一个具体实施方式中，包括如下步骤：

[0023] (1)溶于有机溶剂的连翘苷和连翘脂素与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0024] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0025] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂。

[0026] 在本发明的另一个具体实施方式中，包括如下步骤：

[0027] (1)溶于溶剂的连翘苷衍生物与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0028] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0029] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂。

[0030] 也优选本发明第一方面的注射剂是粉针剂，即，所述注射剂不包括水。更优选所述粉针剂的制备方法包括干燥上述注射液剂的步骤。干燥可以是喷雾干燥，也可以是冷冻干燥。在本发明的具体实施方式中，包括如下步骤：

[0031] (4)冷冻干燥上述注射液剂。

[0032] 也优选本发明第一方面的注射剂是无针粉注射剂，即，所述注射剂不包括水，所述辅料包括L-精氨酸，而且所述注射剂的颗粒大小适合无针粉注射。更优选所述无针粉注射剂的制备方法包括筛分上述粉针剂的步骤，例如，包括筛分上述粉针剂至颗粒大小介于400目和120目之间的步骤，在本发明的具体实施方式中，包括如下步骤：

[0033] (5)润湿上述粉针剂，制粒、压片并粉碎，然后筛分收集颗粒大小介于400目和120目之间的粉末。

[0034] 在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的注射剂的制备方法，其包括连翘苷和连翘脂素与对于小儿注射给药安全的辅料混合的步骤；或者，其包括连翘苷衍生物与对于小儿注射给药安全的辅料混合的步骤。所述辅料优选包括L-精氨酸或磺丁基醚-β-环糊精。

[0035] 优选本发明第二方面的制备方法是注射液剂的制备方法，其包括连翘苷和连翘脂素与所述辅料混合的步骤；或者，其包括连翘苷衍生物与所述辅料混合的步骤。

[0036] 在本发明的一个具体实施方式中，该注射液剂的制备方法包括如下步骤：

[0037] (1)溶于有机溶剂的连翘苷和连翘脂素与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0038] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0039] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂。

[0040] 在本发明的另一个具体实施方式中，该注射液剂的制备方法包括如下步骤：

[0041] (1)溶于溶剂的连翘苷衍生物与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0042] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0043] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂。

[0044] 也优选本发明第二方面的制备方法是粉针剂的制备方法，其包括干燥上述注射液剂的步骤。

[0045] 在本发明的一个具体实施方式中，该粉针剂的制备方法包括如下步骤：

[0046] (1)溶于有机溶剂的连翘苷和连翘脂素与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0047] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0048] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂；

[0049] (4)冷冻干燥步骤(3)获得的注射液剂。

[0050] 在本发明的另一个具体实施方式中，该粉针剂的制备方法包括如下步骤：

[0051] (1)溶于溶剂的连翘苷衍生物与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0052] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0053] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂；

[0054] (4)冷冻干燥步骤(3)获得的注射液剂。

[0055] 也优选本发明第二方面的制备方法是无针粉注射剂的制备方法，其包括筛分上述粉针剂的步骤，而且其中，辅料包括L-精氨酸。优选该无针粉注射剂的制备方法包括筛分上述粉针剂至颗粒大小介于400目和120目之间的步骤。

[0056] 在本发明的一个具体实施方式中，该无针粉注射剂包括如下步骤：

[0057] (1)溶于有机溶剂的连翘苷和连翘脂素与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0058] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0059] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂；

[0060] (4)冷冻干燥步骤(3)获得的注射液剂；

[0061] (5)润湿步骤(4)获得的粉针剂，制粒、压片并粉碎，然后筛分收集颗粒大小介于400目和120目之间的粉末。

[0062] 在本发明的另一个具体实施方式中，该无针粉注射剂包括如下步骤：

[0063] (1)溶于溶剂的连翘苷衍生物与溶于水中的辅料混合均匀后减压干燥；

[0064] (2)步骤(1)获得的干燥产物溶于水后减压干燥；

[0065] (3)步骤(2)获得的干燥产物溶于水，并任选加入pH调节剂和/或渗透压调节剂；

[0066] (4)冷冻干燥步骤(3)获得的注射液剂；

[0067] (5)润湿步骤(4)获得的粉针剂，制粒、压片并粉碎，然后筛分收集颗粒大小介于400目和120目之间的粉末。

[0068] 在第三方面，本发明提供了连翘苷衍生物在制备用于解热的药物中的应用。在本文中，解热和退烧可以互换使用，指的是降低发热的体温，优选降至正常体温。在本发明的具体实施方式中，发热是由异源抗原(如，酵母)注射引发的。

[0069] 优选本发明第三方面的应用是连翘苷衍生物单独作为活性成分的应用，即优选本发明第三方面提供了连翘苷衍生物单独在制备用于解热的药物中的应用。

[0070] 优选在本发明第三方面的应用中，所述连翘苷衍生物是33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷、9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷或33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷。

[0071] 本发明的有益效果在于，提供了稳定的连翘苷/连翘脂素或连翘苷衍生物注射剂，安全性高，尤其适合肾功能还未发育完全的小儿；剂型的灵活性高，可以灵活转换生产注射液剂、粉针剂和无针粉注射剂等不同注射剂型；剂型的适配性好，适用于多种比例的连翘苷/连翘脂素和多种连翘苷衍生物；另外，本发明提供了连翘苷衍生物在解热方面的应用，拓宽了连翘苷衍生物的适应症。

[0072] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

[0073] 图1示例性地显示了出现了肾小管空泡的肾脏组织切片的照片。

[0074] 图2示例性地显示了未见异常(包括未见肾小管空泡)的肾脏组织切片的照片。

具体实施方式

[0075] 以下通过实施例进一步示例性地说明本发明。如未特别指明，实施例中所用的方法均记载于本领域的技术文献和药品监管机构的规范文件中，仪器、原料和试剂均为公开市场所购买的。

[0076] 实施例1连翘苷衍生物及连翘苷与连翘脂素的组合物对酵母所致家兔衰发热实验的影响

[0077] 1试验材料

[0078] 1.1药品与试剂

[0079] 连翘苷，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.5％，并用中国药品生物制品含量测定用连翘苷对照品标定和确认其含量为99.5％。

[0080] 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(连翘苷衍生物A)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为98.5％。

[0081] 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(连翘苷衍生物B)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.2％。

[0082] 33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(连翘苷衍生物C)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为98.7％。

[0083] 酵母，市售。

[0084] 阳性对照药：阿司匹林，金陵药业合肥利民药厂，批号:130809

[0085] 1.2实验动物

[0086] 大白兔，体重2.5土0.5kg，雌雄各半，购自大连医科大学实验动物中心，质量合格证号：SCXK(13)2012-0008。

[0087] 2试验方法：

[0088] 2.1剂量选择

[0089] 根据受试物的人体推荐用量及样品的最大可能灌胃剂量设置3个连翘苷实验组，即连翘苷低、中、高剂量组，剂量分别为3、6、12mg/kg；

[0090] 连翘苷衍生物A、B、C分别设置3个连翘苷衍生物实验组，即连翘苷衍生物A低、中、高剂量组，剂量分别为3、6、12mg/kg；连翘苷衍生物B低、中、高剂量组，剂量分别为3、6、12mg/kg；连翘苷衍生物C低、中、高剂量组，剂量分别为3、6、12mg/kg；

[0091] 另设一个空白对照组和阳性药物对照组(阿司匹林，250mg/kg)。

[0092] 2.2分组与给药

[0093] 取健康大白兔，体重2.5±0.5kg，雌雄不孕，测肛温(温度计深入3cm左右，两次误差不超过0.2℃)，筛选出36-38℃的100只家兔，随机分为20组，每组5只，即空白对照组、连翘苷药组(低，中，高三个剂量组)、连翘苷衍生物A、B、C(低，中，高三个剂量组)、阳性药对照组(阿司匹林，250mg/kg/d)。

[0094] 空白对照组：生理盐水(NS)灌胃给药，每天1次，连续给药3天；连翘苷组、连翘苷衍生物A、B、C组分别灌胃给药相应剂量的药物，每天灌胃给药1次，连续给药3天；阳性药对照组:给予阿司匹林灌胃给药250mg/kg，每天1次，连续给药3天。

[0095] 末次给药后1小时，在受试家兔皮下按4.5g/kg注射酵母悬液，并于至热后0 5h，lh，2h，4h，8h测其肛温，结果如表1所示。

[0096] 3实验结果

[0097] 表1连翘苷衍生物、连翘苷衍生物/连翘脂素对对酵母所致家兔衰发热实验的影响(x±s n＝5)

[0098]

[0099] 通过解热实验可知，空白对照组兔体温显著升高，而与模型对照组相比连翘苷、连翘苷衍生物各给药防治组解热效果显著，中高剂量组具有显著差异p＜0.01，各低剂量组与本组致热前相比P<0.05，与模型对照相比P

[0100] 实施例2连翘苷/连翘脂素注射液剂

[0101] 1试验药品

[0102] 连翘苷/连翘脂素组合物A：连翘苷(纯度99.5％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产；连翘脂素(纯度为99.2％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产；连翘苷与连翘脂素的重量之比为98：2。

[0103] 连翘苷/连翘脂素组合物B：连翘苷(纯度99.5％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产；连翘脂素(纯度为99.2％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产；连翘苷与连翘脂素的重量之比为90：10。

[0104] 2连翘苷/连翘脂素注射液剂的制备

[0105] 2.1配方1

[0106] 取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，用乙腈-乙醇混合液(体积比75：25)200mL溶解完全，备用。取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用。

[0107] 保持温度为45℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌。滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0108] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的连翘苷/连翘脂素注射剂(配方1)。

[0109] 2.2配方2

[0110] 取2g连翘苷/连翘脂素组合物A，用无水乙醇400mL溶解完全，备用。取磺丁基醚-β-环糊精120g，加注射用水280mL，加热至40℃溶解完全，备用。

[0111] 保持温度为40℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以10mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌。滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加80mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0112] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液溶解，定容至80mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：50mg的连翘苷/连翘脂素注射剂(配方2)。

[0113] 2.3配方3

[0114] 取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，用乙腈-乙醇混合液(体积比70：30)250mL溶解完全，备用。取L-精氨酸50g，加注射用水450mL，溶解完全，备用。

[0115] 在室温下，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述精氨酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌15min。搅拌完成后上样于旋转蒸发器以0.04MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以
0.04MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0116] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液150mL溶解，用5N盐酸溶液调节pH至7.2，加0.9％(w/v)NaCl水溶液定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的连翘苷/连翘脂素注射剂(配方3)。

[0117] 2.4配方4

[0118] 取2g连翘苷/连翘脂素组合物A，用乙腈-乙醇混合液(体积比75：25)200mL，备用。取L-精氨酸60g，加注射用水340mL，加热至35℃溶解完全，备用。

[0119] 保持温度为35℃，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述精氨酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌10min。搅拌完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加80mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0120] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液50mL溶解，用5N盐酸溶液调节pH至7.2，加0.9％(w/v)NaCl水溶液定容至，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：50mg的连翘苷/连翘脂素注射剂(配方4)。

[0121] 2.5配方5

[0122] 取2g连翘苷/连翘脂素组合物B，用乙腈150mL溶解完全，备用。取L-精氨酸40g，加注射用水360mL，溶解完全，备用。

[0123] 在室温下，将上述连翘苷/连翘脂素组合物溶液以5mL/min的速度滴加到上述精氨酸溶液中，边滴加边搅拌。滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.04MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.04MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0124] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液150mL溶解，用5N盐酸溶液调节pH至7.2，加0.9％(w/v)NaCl水溶液定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的连翘苷/连翘脂素注射剂(配方5)。

[0125] 3连翘苷/连翘脂素注射液剂的稳定性研究

[0126] 将参照上述配方制备的注射液剂放置在25℃条件下，进行稳定性研究180天，结果如表2所示。

[0127] 表2本发明的连翘苷/连翘脂素注射液剂的常温稳定性

[0128]

[0129] 结果表明，通过本发明的制备方法，无论是以磺丁基醚-β-环糊精为辅料，还是以精氨酸为辅料，都能充分溶解连翘苷/连翘脂素组合物，基本没有连翘苷/连翘脂素活性物质的损失，并且稳定性良好，在室温水平能长期稳定保存。

[0130] 实施例3连翘苷衍生物注射液剂

[0131] 1试验药品

[0132] 33-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(衍生物A，纯度98.5％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。

[0133] 9-羟基-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(衍生物B，纯度为99.2％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。

[0134] 33，34-亚甲基二氧-连翘脂素葡萄糖醛酸苷(衍生物C，纯度为98.7％)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。

[0135] 连翘脂素硫酸钠(衍生物D)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.9％。

[0136] 连翘脂素葡萄糖醛酸钠(衍生物E)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.3％。

[0137] 连翘脂素葡萄糖醛酸甲酯(衍生物F)，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产。经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.6％。

[0138] 2连翘苷衍生物注射液剂的制备

[0139] 2.1衍生物A配方1

[0140] 取2g衍生物A，用50％(体积比)乙醇200mL溶解完全，备用。取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用。

[0141] 保持温度为45℃，将上述衍生物A溶液以10mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌。滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0142] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的衍生物A注射剂(配方A1)。

[0143] 2.2衍生物A配方2

[0144] 取2g衍生物A，用50％(体积比)乙醇200mL溶解完全，备用。取L-精氨酸50g，加注射用水450mL，溶解完全，备用。

[0145] 在室温下，将上述衍生物A溶液以10mL/min的速度滴加到上述精氨酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌10min。搅拌完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0146] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液150mL溶解，用5N盐酸溶液调节pH至7.2，加0.9％(w/v)NaCl水溶液定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的衍生物A注射剂(配方A2)。

[0147] 2.3衍生物B配方1

[0148] 参照上述衍生物A配方1的制备方法，所不同的仅在于用衍生物B代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物B注射剂(配方B1)。

[0149] 2.4衍生物B配方2

[0150] 参照上述衍生物A配方2的制备方法，所不同的仅在于用衍生物B代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物B注射剂(配方B2)。

[0151] 2.5衍生物C配方1

[0152] 参照上述衍生物A配方1的制备方法，所不同的仅在于用衍生物C代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物C注射剂(配方C1)。

[0153] 2.6衍生物C配方2

[0154] 参照上述衍生物A配方2的制备方法，所不同的仅在于用衍生物C代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物C注射剂(配方C2)。

[0155] 2.7衍生物D配方1

[0156] 参照上述衍生物A配方1的制备方法，所不同的仅在于用衍生物D代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物D注射剂(配方D1)。

[0157] 2.8衍生物D配方2

[0158] 参照上述衍生物A配方2的制备方法，所不同的仅在于用衍生物D代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物D注射剂(配方D2)。

[0159] 2.9衍生物E配方1

[0160] 参照上述衍生物A配方1的制备方法，所不同的仅在于用衍生物E代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物E注射剂(配方E1)。

[0161] 2.10衍生物E配方2

[0162] 参照上述衍生物A配方2的制备方法，所不同的仅在于用衍生物E代替衍生物A，制备得规格为2mL：20mg的衍生物E注射剂(配方E2)。

[0163] 2.11衍生物F配方1

[0164] 取2g衍生物F，用氯仿200mL溶解完全，备用。取磺丁基醚-β-环糊精150g，加注射用水350mL，加热至45℃溶解完全，备用。

[0165] 保持温度为45℃，将上述衍生物F溶液以5mL/min的速度滴加到上述磺丁基醚-β-环糊精溶液中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌5min。滴加完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以
0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0166] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液溶解，定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的衍生物F注射剂(配方F1)。

[0167] 2.12衍生物F配方2

[0168] 取2g衍生物F，用氯仿-乙醇混合液(体积比75：25)200mL溶解完全，备用。取L-精氨酸50g，加注射用水450mL，溶解完全，备用。

[0169] 在室温下，将上述衍生物F溶液以5mL/min的速度滴加到上述精氨酸溶液中，边滴加边搅拌，滴加完成后继续搅拌15min。搅拌完成后上样于旋转蒸发器以0.05MPA的真空度和100℃减压干燥，回收溶剂，干燥产物加200mL注射用水溶解后重复以0.05MPA的真空度和100℃旋转蒸发干燥。

[0170] 最终干燥产物加0.9％(w/v)NaCl水溶液150mL溶解，用5N盐酸溶液调节pH至7.2，加0.9％(w/v)NaCl水溶液定容至200mL，0.22um过滤除菌后，分装、密封，制备得规格为2mL：20mg的衍生物F注射剂(配方F2)。

[0171] 3连翘苷衍生物注射液剂的稳定性研究

[0172] 将参照上述配方制备的注射液剂放置在25℃条件下，进行稳定性研究180天，结果如表3所示。

[0173] 表3本发明的连翘苷衍生物注射液剂的常温稳定性

[0174]

[0175] 结果表明，通过本发明的制备方法，无论是以磺丁基醚-β-环糊精为辅料，还是以精氨酸为辅料，配制的连翘苷衍生物注射液剂，基本没有连翘苷衍生物活性物质的损失，并且稳定性良好，在室温水平能长期稳定保存。

[0176] 实施例4连翘苷/连翘脂素注射液剂的安全性研究

[0177] 取Wistar大鼠27只(雄性，体重120～150g)，随机分成9组，每组3只，使用实施例2的配方1-4注射给药。分组情况如下；

[0178] 空白对照组(静脉注射生理盐水)、配方1七天组(以连翘苷/连翘脂素组合物计5mg/kg静脉注射配方1的注射剂，每天一次，连续七天)、配方1一月组(以连翘苷/连翘脂素组合物计5mg/kg静脉注射配方1的注射液剂，每天一次，连续30天)、配方2七天组(换用配方
2，其余同配方1七天组)、配方2一月组(换用配方2，其余同配方1一月组)、配方3七天组(换用配方3，其余同配方1七天组)、配方3一月组(换用配方3，其余同配方1一月组)、配方4七天组(换用配方4，其余同配方1七天组)、配方4一月组(换用配方4，其余同配方1一月组)。

[0179] 给药期间各组小鼠体重、摄食正常，没有观察到溶血现象出现。末次给药后1小时处死大鼠(空白对照组中两只随七天组处置，另两只随一月组处置)，取肾脏组织，切片染色后镜检。镜检发现，配方1一月组和配方2一月组中各有两只大鼠出现了肾小管空泡(其典型的组织切片如图1所示)；其余(包括空白对照组、配方1七天组、配方2七天组、配方3七天组、配方3一月组、配方4七天组和配方4一月组的所有动物)均没有发现异常(其典型的组织切片如图2所示)。

[0180] 结果表明，以磺丁基醚-β-环糊精为辅料的连翘苷/连翘脂素注射液剂在正常用药周期(通常是3天，不超过7天)内安全性良好，但是如果超量长期持续用药，则会出现一定的肾脏毒性；而以精氨酸为辅料的连翘苷/连翘脂素注射液剂安全性良好，无论短期使用，还是长期持续使用，均没有出现肾脏毒性。

[0181] 实施例5连翘苷/连翘脂素及其衍生物的粉针剂

[0182] 将实施例2的配方1～5的注射液剂和实施例3的配方A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1和F2分别过滤除菌后分装入西林瓶中，每瓶2ml，冷冻干燥，加盖密封，即制得各配方的冻干粉针剂。临给药时，用注射用水复溶，各配方的冻干粉针剂均能在10秒内复溶，溶液澄清，无沉淀。

[0183] 实施例6连翘苷/连翘脂素及其衍生物的无针粉注射剂

[0184] 实施例2的配方3～5和实施例3的配方A2、B2、C2、D2、E2和F2的冻干粉针剂还适合制成无针粉注射剂，而实施例2的配方1～2和和实施例3的配方A1、B1、C1、D1、E1和F1的冻干粉针剂难以有效穿透表皮，不合适制成无针粉注射剂。

[0185] 分别取实施例2的配方3～5和实施例3的配方A2、B2、C2、D2、E2和F2的冻干粉针剂，用适量注射用水润湿(能成型但没有水滴)，过20目筛制粒，用压片机压片后粉碎，过120目筛，收集通过筛的粉末，再过400目筛，收集未过筛的粉末，即制得各配方的无针粉注射剂。

[0186] 猪腿内侧全皮剥离，从而制得猪皮；取30g明胶，加入蒸馏水加热溶解，定容至100mL，置于方形容器中凝固，从而制得仿人皮。将配方3～5的无针粉注射剂分别装入Powderject粉末注射器，以4MPa的压力分别对猪皮和仿人皮进行加压喷射注射，然后分别取样各皮上不同深度的部分，HPLC检测连翘苷，检出连翘苷的最大深度如表4所示。

[0187] 表4本发明的无针粉注射剂的最大注射深度

[0188]

[0189] 结果表明，实施例2的配方3～5和实施例3的配方A2、B2、C2、D2、E2和F2的无针粉注射剂预计均能被输送穿透约0.1mm厚的人表皮，进入真皮毛细血管，从而可以无针注射给药连翘苷/连翘脂素及其衍生物。