一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法

摘要

本发明采用三价肠毒素融合蛋白(LTB蛋白‑STa蛋白‑STb蛋白)和K88天然菌毛，或者进一步包含K88全菌灭活苗作为免疫原，免疫蛋鸡获得了一种新的卵黄抗体，该卵黄抗体具有高效价、高抑菌活性和广谱性，对多种血清型大肠杆菌保护效果均良好，克服了现有制备技术中卵黄抗体抗原特异性强的缺点，为猪腹泻病的治疗和预防提供了新手段。

权利要求

1.一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡，获得卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛；

所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG；

所述混合抗原进一步含有K88全菌灭活苗；

所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，K88全菌灭活苗1.0×109-5.0×109cfu；

卵黄抗体的提取方法为聚乙二醇沉淀，所述聚乙二醇沉淀提取卵黄抗体包括如下步骤：将卵黄与缓冲液混合后，加入聚乙二醇使其终浓度为2-5W/V％，搅拌后离心，取上清过滤，滤液中加入聚乙二醇使其终浓度为7-10W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解，加入聚乙二醇使其终浓度为10-15W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解并透析；

所述三价肠毒素融合蛋白的制备包括如下步骤：1)构建带有融合蛋白基因的质粒载体；2)转化宿主细菌；3)诱导表达目的蛋白；4)提取纯化目的蛋白；

所述步骤4)提取纯化目的蛋白，进一步包含以下步骤：离心收集菌体细胞，破碎菌体收集包涵体，裂解包涵体，采用亲和层析柱纯化目的蛋白，透析以使变性的目的蛋白复性；其中，采用镍亲和层析柱纯化目的蛋白，先用结合缓冲液清洗柱子除去杂蛋白，同时平衡柱子，然后以洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液，所述洗脱缓冲液的组成为：15-25mM pH 7.2-

7.6PB缓冲液，含0.4-0.6M NaCl、350-450mM咪唑和7-9M尿素；所述结合缓冲液的组成为：

15-25mM pH 7.2-7.6PB缓冲液，含0.4-0.6M NaCl、15-25mM咪唑和7-9M尿素。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:2～2:1。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg；K88全菌灭活苗为每只鸡每次1.0×109-5.0×109cfu。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.5mg。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，K88天然菌毛为每只鸡每次0.5mg。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，混合抗原的免疫用量为，K88全菌灭活苗为每只鸡每次2.5×109cfu。

7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，混合抗原和弗氏完全佐剂的体积比为2:1～1:

2；混合抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为2:1～1:2。

8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇沉淀提取卵黄抗体包括如下步骤：将卵黄与缓冲液混合后，加入聚乙二醇使其终浓度为3.2-3.8W/V％，搅拌后离心，取上清过滤，滤液中加入聚乙二醇使其终浓度为8.2-8.8W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解，加入聚乙二醇使其终浓度为11.5-12.5W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解并透析。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇为PEG2000～PEG6000。

10.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，将纯化的变性目的蛋白装入透析袋，连续用含有6、4、2、1和0mol/L尿素的pH 8.0-9.0复性缓冲液在4℃分步缓慢透析，其中最后两步不加甘油，每步透析12-24h，所述复性缓冲液的组成为：6、4、2、1或0M的尿素，15-

25mM pH 8.0-9.0PB缓冲液，4-6％甘油，0.04-0.06mM氧化型谷胱甘肽，0.4-0.6mM还原型谷胱甘肽。

11.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，裂解包涵体使用的变性缓冲液的组成为：15-25mM pH 7.2-7.6的PB缓冲液、0.4-0.6M NaCl和7-9M尿素。

12.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为PET28a，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21；采用0.1～1.0mmol/L的IPTG，在16℃～37℃下诱导表达目的蛋白。

13.由权利要求1-12任一项制备方法制备获得的卵黄抗体。

14.一种组合物，其特征在于含有权利要求13所述的卵黄抗体。

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物是饲料或药物制剂。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述药物制剂是含有卵黄抗体的注射液、粉针或口服制剂。

17.权利要求13所述的卵黄抗体在制备治疗或预防猪腹泻或者多血清产肠毒素大肠杆菌病的药物或饲料中的用途。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述猪腹泻是仔猪腹泻。

19.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述猪腹泻是由猪产肠毒素大肠杆菌引起的。

说明书

一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗体及其制备方法，具体地说，涉及抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

[0002] 畜牧养殖中抗生素滥用会导致细菌产生耐药性，一方面对于今后的畜禽疾病治疗产生困难，另一方面，畜禽产品被人类食用之后，会间接食入在畜禽体内残留的抗生素，导致人类感染疾病之后抗生素治疗效果大打折扣。因此，在畜禽养殖过程中，必须严格按照规定使用抗生素。最近，农业部再出重拳，发布公告第2638号，停止在食品动物中使用喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3种兽药。此次禁止后，养殖业就仅剩11种抗菌药允许添加到商品饲料中，随着日本、欧盟等国家和地区的全面禁止在养殖业中使用抗生素，中国预计在不远的将来也会全面禁止使用抗生素。因此，抗生素替代品的研发与应用成为养殖业一个迫切解决的难题。

[0003] 卵黄抗体是一种将特定病原菌注射在蛋鸡体内，由其生产的鸡蛋蛋黄中提取相应抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗的抗体。卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体还可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞，或使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性。因此，目前卵黄抗体作为一种很有潜力的抗生素替代品被广泛关注。

[0004] 断奶仔猪腹泻是常见的断奶应激性疾病，严重影响仔猪生产性能。产肠毒素大肠杆菌的肠毒素是导致腹泻发生的直接致病因子，根据热稳定性可以分为耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)两类，二者可单独或共同存在于菌株中。LT有两种亚型LT-I和LT-II，前者具有致病性，由一个A亚基(LTA)和5个B(LTB)亚基组成。A亚基是毒素的活性部分，B亚基是毒素的免疫原性中心，单独的A或B亚基均没有生物学活性，只有聚合在一起才具有全毒素的生物学功能。ST根据在甲醇中的溶解性和致病性，一般分为ST1和ST2两类，其中ST1又根据宿主种类和核苷酸数目的差异分为ST1a(也称STa)和ST1b(也称STb)两种亚型，STb分子量较小，免疫原性很弱。目前，细菌性腹泻的防治主要采用大肠杆菌多价苗免疫和抗菌药治疗，但效果不是很明显。

[0005] 卵黄抗体作为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂在防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻中显示出明显的效果，为该病的防治开辟了新的途径。将LTB与STa和STb蛋白融合起来具有良好的免疫原性；大肠杆菌的菌毛蛋白也具有良好的免疫原性，给机体免疫后产生的抗体在不同血清型大肠杆菌间均具有交叉保护效果。到目前为止已经有许多学者研究了抗大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法，包括免疫原采用全菌灭活苗、大肠杆菌菌毛、融合蛋白及不同组合的联合免疫原等制备相应的卵黄抗体。如王吉潭等制备了抗大肠杆菌K88、K99和987P的卵黄抗体；陈娟、刘国华等制备了大肠杆菌菌毛抗原，并用于卵黄抗体的制备。彭健等采用TSB液体培养菌株和纯化获得特异菌毛黏附素蛋白，与佐剂混合制成免疫原，免疫产蛋鸡，制备预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体。由于大肠杆菌种类多，变异大、血清型复杂，目前这些方法产生的抗体特异性强，只针对免疫菌株有作用，对大肠杆菌的其他血清型细菌没有作用，很难在实际生产中进行推广应用。另外，有研究表明，多种抗原混合免疫蛋鸡时，免疫保护效果与单一抗原免疫相比可能有协同效应，也可能有负面影响(李建梅，2011)。

[0006] 因此，研究出一种广谱性的抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体，探究多种抗原混合免疫与单独免疫的免疫保护效果就显得愈发重要，这不仅减少了资源的浪费，提高了工作效率，而且有利于卵黄抗体在畜禽养殖中的推广应用，起到预防或治疗仔猪腹泻，为养殖业的健康发展和食品安全提供保障。

发明内容

[0007] 为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种针对猪产肠毒素大肠杆菌的广谱性、高效价卵黄抗体及其制备方法，以及该抗体或其制剂在制备治疗猪腹泻药物中的应用。本发明的方法克服了现有制备技术中抗原特异性强的缺点，建立了一种采用混合抗原作为免疫原的卵黄抗体的制备方法，并获得了高效价、高抑菌活性、可针对多种血清型的产肠毒素大肠杆菌、且无毒副作用，易于推广经济适用的抗体。

[0008] 本发明的目的通过如下技术方案来实现：

[0009] 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡获得的卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛。

[0010] 根据本发明，所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的融合蛋白，在所述三个蛋白之间存在或不存在柔性连接序列，例如，所述融合蛋白可以是LTB蛋白-STa蛋白-STb蛋白，或者LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-STb蛋白，LTB蛋白-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白。

[0011] 优选，在所述三个基因序列之间有柔性连接序列。例如，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-STb蛋白，LTB蛋白-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白。

[0012] 在本发明的一个实施例中，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG。

[0013] 在本发明的另一个实施例中，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为DPRVPSS，柔性连接序列2的氨基酸序列为DPRIPSS。

[0014] 根据本发明，所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:5～5:1，优选为1:2～2:1，例如1:1。

[0015] 根据本发明，所述混合抗原中进一步含有K88全菌灭活苗。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗1.0×109-5.0×109cfu。优选，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.5mg，K88天然菌毛0.5mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗2.5×109cfu。

[0017] 根据本发明，混合抗原的免疫用量为：三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg。当混合抗原中进一步含有K88全菌灭活苗时，则K88全菌灭活苗的免疫用量为每只鸡每次1.0×109-5.0×109cfu，优选为2.5×109cfu。

[0018] 根据本发明，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂可以是本领域已知的各类佐剂，包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、CpG等。在本发明的一个实施方式中，所述佐剂是弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，混合抗原和弗氏完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1；混合抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1。

[0019] 根据本发明，蛋鸡的免疫程序为三次免疫，首次免疫后第2-4周进行第二次免疫，首次免疫后第4-6周进行第三次免疫。在本发明的一个实施方式中，分别在第0、3、5周进行免疫，即，首次免疫后第3周进行第二次免疫，首次免疫后第5周进行第三次免疫。在本发明的另一个实施方式中，分别在第0、2、6周进行免疫，即，首次免疫后第2周进行第二次免疫，首次免疫后第6周进行第三次免疫。

[0020] 优选，首次免疫时，使用混合抗原和弗氏完全佐剂，第二次和第三次免疫使用混合抗原和弗氏不完全佐剂。

[0021] 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法以及由该方法制备的卵黄抗体。

[0022] 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡，获得卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛。

[0023] 根据本发明，所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的融合蛋白，在所述三个蛋白之间存在或不存在柔性连接序列，例如，所述融合蛋白可以是LTB蛋白-STa蛋白-STb蛋白，或者LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-STb蛋白，LTB蛋白-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白。

[0024] 优选，在所述三个基因序列之间有柔性连接序列。例如，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-STb蛋白，LTB蛋白-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白。

[0025] 在本发明的一个实施例中，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG。

[0026] 在本发明的另一个实施例中，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为DPRVPSS，柔性连接序列2的氨基酸序列为DPRIPSS。

[0027] 根据本发明，所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:5～5:1，优选为1:2～2:1，例如1:1。

[0028] 根据本发明，所述混合抗原中进一步含有K88全菌灭活苗。

[0029] 在本发明的一种实施方式中，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗1.0×109-5.0×109cfu。优选，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.5mg，K88天然菌毛0.5mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗2.5×109cfu。

[0030] 根据本发明，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg。当混合抗原中进一步含有K88全菌灭活苗时，则K88全菌灭活苗的免疫用量为每只鸡每次1.0×109-5.0×109cfu，优选为2.5×109cfu。

[0031] 根据本发明，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂可以是本领域已知的各类佐剂，包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、CpG等。在本发明的一个实施方式中，所述佐剂是弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，混合抗原和弗氏完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1；混合抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1。

[0032] 根据本发明，蛋鸡的免疫程序为三次免疫，首次免疫后第2-4周进行第二次免疫，首次免疫后第4-6周进行第三次免疫。在本发明的一个实施方式中，分别在第0、3、5周进行免疫，即，首次免疫后第3周进行第二次免疫，首次免疫后第5周进行第三次免疫。在本发明的另一个实施方式中，分别在第0、2、6周进行免疫，即，首次免疫后第2周进行第二次免疫，首次免疫后第6周进行第三次免疫。

[0033] 优选，首次免疫时，使用混合抗原和弗氏完全佐剂，第二次和第三次免疫使用混合抗原和弗氏不完全佐剂。

[0034] 根据本发明，所述制备方法进一步包括提取卵黄抗体。卵黄抗体的提取方法为聚乙二醇沉淀或者盐酸水稀释法。

[0035] 根据本发明，采用聚乙二醇沉淀提取卵黄抗体，包括如下步骤：将卵黄与缓冲液混合后，加入聚乙二醇使其终浓度为2-5W/V％，优选3.2-3.8W/V％，搅拌后离心，取上清过滤，滤液中加入聚乙二醇使其终浓度为7-10W/V％，优选为8.2-8.8W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解，加入聚乙二醇使其终浓度为10-15W/V％，优选11.5-12.5W/V％，搅拌后离心，沉淀物用缓冲液溶解并透析。

[0036] 优选聚乙二醇为PEG 2000～PEG 6000。在本发明的一个实施方式中，所述聚乙二醇为PEG-6000。

[0037] 所述缓冲液可以是本领域已知的各种常用缓冲液，包括但不限于pH值为7.0-7.8范围内的PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPE缓冲液和PB缓冲液等。在本发明的一个实施方式中，所述缓冲液是pH值为7.4的PBS缓冲液。

[0038] 根据本发明，采用盐酸水稀释法提取卵黄抗体，包括如下步骤：将卵黄与无菌水按1:5～1:15，优选1:6～1:10的体积比混匀，用盐酸调节pH至5.0-5.2，静置后离心去除脂类，收集上清。

[0039] 根据本发明，所述三价肠毒素融合蛋白的制备方法包括如下步骤：1)构建带有融合蛋白基因的质粒载体；2)转化宿主细菌；3)诱导表达目的蛋白；4)提取纯化目的蛋白。

[0040] 根据本发明，所述质粒载体为PET质粒，包括但不限于：PET28a，PET30a，PET32a等。在本发明的一个实施方式中，所述质粒载体为PET28a。

[0041] 根据本发明，所述宿主细胞为大肠杆菌，包括但不限于BL21，DH5α，JM109等。在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞为BL21。

[0042] 根据本发明，在使用BL21为宿主细胞时，采用0.1～1.0mmol/L的IPTG，在16℃～37℃下诱导表达目的蛋白。优选使用0.4mmol/L的IPTG，在25℃下的诱导表达。

[0043] 根据本发明，所述步骤4)提取纯化目的蛋白，进一步包含以下步骤：离心收集菌体细胞，破碎菌体收集包涵体，裂解包涵体，采用亲和层析柱纯化目的蛋白，透析以使变性的目的蛋白复性。

[0044] 根据本发明，裂解包涵体使用的变性缓冲液的组成为：15-25mM PB缓冲液(pH 7.2-7.6)、0.4-0.6M NaCl和7-9M尿素。在本发明的一个实施方式中，所述变性缓冲液的组成为：20mM PB缓冲液(pH 7.4)、0.5M NaCl和8M尿素。

[0045] 根据本发明，采用镍亲和层析柱纯化目的蛋白，先用结合缓冲液清洗柱子除去杂蛋白，同时平衡柱子，然后以洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液。

[0046] 优选，结合缓冲液的组成为：15-25mM pH 7.2-7.6PB缓冲液，含0.4-0.6M NaCl、15-25mM咪唑和7-9M尿素。在本发明的一个实施方式中，结合缓冲液的组成为：20mM pH 
7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl、20mM咪唑和8M尿素。

[0047] 优选，洗脱缓冲液的组成为：15-25mM pH 7.2-7.6PB缓冲液，含0.4-0.6M NaCl、350-450mM咪唑和7-9M尿素。在本发明的一个实施方式中，洗脱缓冲液的组成为：20mM pH 
7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl、400mM咪唑和8M尿素。

[0048] 根据本发明，将纯化的变性目的蛋白装入透析袋，连续用含有6、4、2、1和0mol/L尿素的复性缓冲液(pH 8.0-9.0)在4℃分步缓慢透析，其中最后两步不加甘油，每步透析12-24h。所述复性缓冲液的组成为：15-25mM pH 8.0-9.0PB缓冲液、4-6％甘油、0.04-0.06mM氧化型谷胱甘肽、0.4-0.6mM还原型谷胱甘肽和x M(分别为6、4、2、1、0M)尿素。在本发明的一个实施方式中，复性缓冲液的组成为：20mM pH 8.0PB缓冲液、5％甘油、0.05mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽和x M(分别为6、4、2、1、0M)尿素。

[0049] 根据本发明，K88天然菌毛的制备可采用本领域已知的各种方法进行。例如在60℃水浴中震荡使菌毛脱落，用饱和硫酸铵沉淀菌毛。

[0050] 由本发明方法制备的卵黄抗体可用于多血清产肠毒素大肠杆菌病的预防和治疗。

[0051] 一种组合物，其特征在于含有前述的卵黄抗体。

[0052] 根据本发明，所述组合物可以是饲料、药物制剂。所述饲料可以是添加纯化后的卵黄抗体，或者是添加含有卵黄抗体的卵黄粉，所述卵黄粉可由被免疫的蛋鸡所产蛋的卵黄喷雾干燥或冷冻干燥制备得到，其中含有卵黄抗体。

[0053] 所述制剂可以是含有卵黄抗体的注射液、粉针和口服制剂等。可采用本领域已知的制剂制备技术制备本发明的药物制剂。

[0054] 本发明所述的卵黄抗体在制备治疗或预防多血清产肠毒素大肠杆菌病的药物或饲料中的用途。

[0055] 本发明所述的卵黄抗体在制备治疗或预防猪腹泻的药物或饲料中的用途。

[0056] 根据本发明，所述猪腹泻是仔猪腹泻。

[0057] 根据本发明，所述猪腹泻是由猪产肠毒素大肠杆菌引起的。

[0058] 根据本发明，所述药物可以是本领域常用的各种制剂类型，包括但不限于注射液、粉针和口服制剂等。

[0059] 为描述方便，如无特殊说明，本发明中用“LSS”指代LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的三价肠毒素融合蛋白；用IgY指代卵黄抗体；用“LSS+K88菌毛”或“K88菌毛+LSS”指代融合蛋白LSS和K88天然菌毛蛋白的二价混合抗原，各种形式的含义等同；用“K88+LSS+K88菌毛”、“K88+K88菌毛+LSS”、“K88菌毛+K88+LSS”、“K88菌毛+LSS+K88”、“LSS+K88菌毛+K88”或“LSS+K88+K88菌毛”指代K88全菌灭活苗、融合蛋白LSS和K88天然菌毛蛋白的三价混合抗原，各种形式的含义等同。

[0060] 本发明中，K88天然菌毛是由大肠杆菌中直接获得的菌毛，不经过任何基因工程改造等处理。

附图说明

[0061] 图1大肠杆菌K88生长曲线

[0062] 图2融合蛋白LSS在E.coli BL21中的诱导表达的SDS-PAGE图。图中，全：未加诱导剂的全菌蛋白；全+：加IPTG诱导后的全菌蛋白；上：上清，即可溶性蛋自；沉：沉淀，即包涵体。

[0063] 图3融合蛋白LSS纯化前后SDS-PAGE对照。图中，全：未加诱导剂的全菌蛋白；全+：加IPTG诱导后的全菌蛋白；LSS：纯化后的融合蛋白。

[0064] 图4ELISA法测定三免后特异性卵黄抗体的效价。

[0065] 图5不同剂量的特异性IgY对大肠杆菌K88生长的抑制作用曲线

[0066] 图6不同组合抗原的特异性IgY对大肠杆菌K88生长的抑制作用曲线

具体实施方式

[0067] 以下结合实施例对本发明做进一步描述。

[0068] 以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。

[0069] 以下实施例中所使用的制剂及其配制方法：

[0070] (1)LB液体培养基按照如下方法制备：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，超纯水溶解后，用NaOH调pH至7.0，加水定容到1L，高压蒸汽灭菌20min，4℃储存备用；

[0071] (2)LB固体培养基按照如下方法制备：在LB液体培养液中加入15g/L琼脂，高压灭菌20min，4℃储存备用；

[0072] (3)pH7.4PBS缓冲液按照如下方法制备：0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)，1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。

[0073] (4)20mM pH 7.4PB缓冲液按照如下方法制备：

[0074] A液：取Na2HPO4 28.392g溶于蒸馏水，定容至1000mL；

[0075] B液：取NaH2PO4·2H2O 31.202g溶于蒸馏水，定容至1000mL。

[0076] 取A液81mL与B液19mL混合，调pH至7.4，配制成200mM的PB母液，然后用纯水按1:9的体积比稀释成20mM pH 7.4PB缓冲液。

[0077] (5)洗涤液Ⅰ按照如下方法制备：20mM pH 7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl、0.5mM EDTA、1％Triton X-100、1M尿素和1mM DTT。

[0078] (6)洗涤液Ⅱ按照如下方法制备：20mM pH 7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl。

[0079] (7)变性缓冲液按照如下方法制备：20mM pH 7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl和8M尿素。

[0080] (8)结合缓冲液按照如下方法制备：20mM pH 7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl、20mM咪唑和8M尿素。

[0081] (9)洗脱缓冲液按照如下方法制备：20mM pH 7.4PB缓冲液，含0.5M NaCl、400mM咪唑和8M尿素。

[0082] (10)复性缓冲液按照如下方法制备：20mM pH 8.0PB缓冲液，含5％甘油、0.05mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽和x M(分别为6、4、2、1、0M)尿素。

[0083] (11)改良Minca肉汤液体培养基按照如下方法制备：称取改良Minca肉汤培养基15.4g，另取甘油5mL，加热溶解于1000mL蒸馏水中，116℃高压灭菌30分钟，备用。

[0084] (12)显色液按照如下方法制备：

[0085] A液：称取一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O)22.5732g，二水合柠檬酸纳(Na3C6H5O7·2H2O)16.6413g溶解于800mL超纯水中，用二水合柠檬酸纳或者氢氧化钠调节pH至4.0，加入
800μL H2O2。

[0086] B液：称取0.07883g TMB溶解于8mL DMF中。

[0087] 以下实施例中使用的仪器：

[0088] 超纯水机：Milli-Q Biocel型，密理博中国有限公司；精密pH计：PHS-3B型，上海安亭科学仪器厂；高速低温离心机：5804R，Eppendorf公司；恒温磁力搅拌器：85-1型，江苏省金坛市荣华仪器制造公司；蛋白纯化仪：AKTApure，美国GE公司；垂直电泳槽及电泳仪：DYY-24A型，北京六一仪器厂；恒温振荡培养箱：HNY-2102型，天津欧诺仪器仪表有限公司；凝胶成像分析系统：TFX-20LM型，Vilber Lourmat公司；摇床(染色和脱色用)：TS-1型，江苏其林贝尔公司；移液枪：P1000，P200，P100，P20，P2型，Gilson公司。

[0089] 实施例1猪产肠毒素大肠杆菌K88全菌灭活苗、融合蛋白LSS和天然菌毛蛋白的制备与无菌检验

[0090] 1、大肠杆菌K88全菌灭活苗的制备

[0091] 将大肠杆菌K88菌株于37℃，200rpm振荡培养过夜作为种子液，按1％接菌量转接到100mL LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养，每隔两小时取样，稀释到合适的浓度，以无菌培养液为对照，用酶标仪测定OD600值，同时进行平板计数，绘制细菌生长曲线，结果见图1。

[0092] 取对数生长期(6h)的菌液，用pH 7.4PBS缓冲液洗涤2-3次后将活菌数调节为2.5×109cfu/mL，加入0.3％甲醛37℃灭活48h，期间每隔8h摇晃振荡一次，取完成灭活操作的菌液，接种于LB固体培养基上37℃倒置培养48h，观察细菌生长状况，若无菌落生长，即灭活完全。用PBS缓冲液洗涤菌液，去除甲醛，分装冻存于-20℃。

[0093] 2、三价肠毒素融合蛋白LSS的表达和纯化

[0094] a.构建三价肠毒素表达载体pET28a-LSS

[0095] 参照GenBank中发表的三种肠毒素基因：LTB基因序列(登录号：M17873.1)、STa基因序列(登录号：M25607.1)和STb基因序列(登录号：M35729.1)，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成融合蛋白LTB-STa-STb基因序列，在融合基因的两端分别引入NcoⅠ和HindⅢ酶切位点；LTB、STa和STb序列之间引入编码柔性氨基酸linker(SGGGGSGGGGSGGGG)的核苷酸序列。将目的基因和载体pET28a用NcoⅠ和HindⅢ分别双酶切，双酶切产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将切胶回收纯化LSS基因片段及表达载体片段，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌BL21，均匀平铺到含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR筛选，获得阳性菌株用于重组蛋白的诱导表达。

[0096] b.目的蛋白的诱导表达与纯化

[0097] (1)目的蛋白的表达与细胞内定位

[0098] 挑取单菌落接种于10mL LB液态培养基(含100μg/mL卡那霉素)中，于200rpm摇床转速、37℃条件下活化培养12h，次日按1％(v/v)的接种量接种于10mL LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)中，200rpm，37℃培养至OD600值为0.4-0.6，分别加入终浓度为0.1、0.4、
0.8和1.0mmol/L的IPTG，分别在16℃、20℃、25℃和37℃以220rpm摇床转速继续培养菌体
6h，进行重组蛋白的小量诱导表达。实验结果表明，终浓度为0.4mmol/L的IPTG，在25℃下的诱导条件最佳。

[0099] 将小量诱导表达的重组菌10,000rpm，4℃离心10min收获菌体细胞，按1:10加入pH 7.4无菌PBS缓冲液充分重悬细胞得到细胞悬浮液，将细胞悬浮液在4℃冰水浴中进行超声破碎10min(30％功率，工作3秒，停7秒)。将细胞破碎液10,000rpm，4℃离心20min，获得的上清(可溶性表达)和沉淀(包涵体)分别进行SDS-PAGE检测，对目的蛋白在细胞内定位，剩余的上清和沉淀冻存于-20℃待用。研究发现目的蛋白在包涵体内。结果如图2所示。

[0100] 按小量诱导中得到的最佳诱导条件对目的蛋白进行大量诱导表达。

[0101] (2)包涵体的裂解、纯化、变性、复性和蛋白定量

[0102] 将超声破碎获得的包涵体沉淀用洗涤液Ⅰ悬浮，剧烈震荡混合均匀，10,000rpm离心20min，弃上清，重复上述步骤2-3次，去除包涵体表面的杂质(如外膜蛋白等)。用洗涤液Ⅱ继续洗2-3次，去除包涵体表面残留的EDTA和DTT，便于后续进行镍柱纯化。最后用含8mol/L尿素的变性缓冲液重悬包涵体，至于室温1h，或4℃过夜，震荡混匀，使包涵体充分溶解在变性缓冲液中，再通过0.22μm滤膜过滤后，进行镍亲和层析柱(直径1mL)纯化。先用含
20mM咪唑的结合缓冲液清洗柱子除去杂蛋白，同时平衡柱子，然后以含400mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液。将变性纯化的目的蛋白装入透析袋，连续用含有6、4、2、1和0mol/L尿素的复性缓冲液(pH8.0-9.0)在4℃分步缓慢透析，其中最后两步不加甘油，每步透析12-
24h。10％SDS-PAGE电泳检测收集洗脱液目标蛋白的纯度。蛋白质定量用BCA蛋白分析试剂盒进行。结果如图3所示。

[0103] 3、大肠杆菌K88天然菌毛的制备

[0104] 将大肠杆菌K88接种于改良Minca液体培养基中，200rpm，37℃振荡培养过夜，作为种子液。按1％的接种量将种子液接种于200mL改良Minca液体培养基，37℃振荡培养18h-20h，将培养液于4℃，8000rpm离心10min，用PBS(pH 7.4)重悬菌体，反复洗涤3次，用20mL PBS重悬菌体沉淀，于60℃水浴震荡30min，期间不断摇晃，使菌毛脱落；10,000rpm离心
20min，弃沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，向滤液中缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度50％，同时冰浴搅拌2h，4℃静止过夜，使K88菌毛沉淀，于8000rpm离心20min，沉淀物用适量PBS溶解，4℃透析24h，每隔12h换一次液，用BCA蛋白定量试剂盒定量后分装，-20℃保存备用。

[0105] 4、无菌检验

[0106] 将上述制备的K88全菌灭活苗、LSS融合蛋白、K88菌毛蛋白涂布在营养肉汤琼脂培养基上，37℃倒置培养过夜观察有无细菌生长。无菌生长的抗原混合后与佐剂乳化用于免疫蛋鸡。

[0107] 实施例2蛋鸡饲养管理与免疫

[0108] 选用健康的开产前30天(90日龄)的海兰褐壳蛋鸡60只。随机分为6个处理，分别为：A(K88灭活菌免疫)、B(LSS融合蛋白免疫)、C(K88天然菌毛免疫)、D(LSS融合蛋白+K88天然菌毛免疫)、E(K88全菌灭活苗+LSS融合蛋白+K88天然菌毛免疫)，和F(对照，不免疫试验用抗原)。每个处理10个重复(笼)，每个重复1只鸡，阶梯式单笼饲养，鸡只自由采食，不同阶段蛋鸡日粮购自正大有限公司。室内温度为24±2℃，相对湿度为70％±10％，光照时间为12～16h，光照强度为16Lux。

[0109] 初免和追加免疫时分别将混合抗原与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按体积比1:1混合。LSS融合蛋白和K88菌毛蛋白免疫剂量均为0.5mg/只，全菌灭活苗免疫剂量为2.5×109cfu/只。在试验鸡的胸腹部肌肉、分多点注射(每点约0.2mL)，共计注射1mL。每个剂量免疫蛋鸡10只，以个体为单位，每隔10d收集鸡蛋于4℃保存。分别在初免后3周、5周进行两次追加免疫，免疫的剂量和方式与初免相同。

[0110] 实施例3卵黄抗体的提取

[0111] 将高免鸡蛋用清水洗净蛋壳表面的污物后将其浸泡于新洁尔灭溶液中，浸泡1-3min，取出用纱布擦干后，再用75％酒精擦一遍，自然晾干，尽量保证在无菌条件下去除卵白，刺破卵黄膜，收集卵黄。对卵黄液分别采用聚乙二醇沉淀法和水稀释法进行提取。具体方法如下：

[0112] 聚乙二醇沉淀法(polyethylene glycol precipitation,PEG)：将卵黄与pH 7.4PBS缓冲液1:2(V/V)混合，混匀，加入3.5％(W/V，下同)的PEG-6000，充分搅拌，在摇床上室温作用20min。离心(14,000rpm，4℃，20min，下同)后，轻轻倒出上层液体两层滤纸过滤，同时弃去沉淀物，测量所得滤液体积，加8.5％PEG-6000，在摇床室温作用20min，离心。弃上清，沉淀物加10mL PBS溶解，加12％(1.2g)PEG-6000，在摇床上室温作用10min，离心。弃上清，沉淀物加1.2mL PBS溶解，转移到透析袋中，在PBS溶液中透析24h，隔12h换一次液，透析结束后将透析袋内IgY取出，做好标记，4℃备用(Schade R.等，2001)。

[0113] 盐酸水稀释法：将卵黄原液与无菌超纯水按1:9(V/V)混匀，用盐酸调节pH至5.0-5.2，4℃过夜，使脂蛋白自然沉淀，12,000rpm，4℃离心25min去除脂类，收集上清(胡小苗等，2006)。

[0114] 用SDS-PAGE比较两种不同提取方法提取的卵黄抗体纯度，用间接ELISA方法比较两种不同提取方法提取的卵黄抗体效价。结果显示，用聚乙二醇沉淀法提取的卵黄抗体较水稀释法提的卵黄抗体纯度高，但两者提取的卵黄抗体效价差异不显著，1mg/mL卵黄抗体稀释100倍后，ELISA检测OD450均为1.10左右。

[0115] 实施例4卵黄抗体效价的测定

[0116] 酶联免疫吸附实验方法(ELISA法)参照《免疫学常用实验技术》(科学出版社，2002)介绍的方法。具体步骤如下：

[0117] 将抗原(K88)分别以1:10、1:200、1:2000的比例用包被缓冲液稀释；抗原LSS和K88天然菌毛分别稀释到5、2.5、1和0.5μg/mL作为抗原包被浓度，加入96孔板中，每孔100μL，37℃1h。洗涤液洗板3次，每次3分钟，拍干。每孔加入200μL 5％脱脂牛奶封闭液，37℃封闭1h。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟，拍干。阴性对照为未免疫蛋鸡的卵黄抗体。

[0118] 将卵黄抗体稀释(1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000和256000)倍加入孔中，每孔100μL，于37℃孵育1h，弃去液体，洗涤液洗板3次，每次3分钟，拍干。加入1:10000倍稀释的鼠抗鸡HRP-IgY，每孔100μL，37℃孵育1h，弃去液体，洗涤液洗板3次，每次
3分钟，拍干。

[0119] 取A、B显色液，按1:40的比例混匀使用。每孔加入显色液100μL，室温观察颜色变化，反应5-10min。当阳性对照出现明显颜色变化或阴性对照略有显色时，每孔加入2M H2SO4终止液50μL。用酶标仪测定OD450值，每个样品三个平行(实测OD值-阴性对照OD值)/阴性对照OD值≥2.1时的最高稀释度判定为其效价。结果如图4所示，抗K88全菌灭活苗IgY效价达1:16000，抗K88菌毛IgY效价达1：64000，抗LSS融合蛋白IgY效价达256000。抗LSS和K88菌毛二价混合抗原的IgY抗体，以及抗K88全菌灭活苗、LSS和K88菌毛三价混合抗原的IgY抗体均能识别K88全菌、LSS和K88菌毛，混合免疫得到的IgY能达到以K88全菌灭活苗、LSS或菌毛为抗原单独免疫蛋鸡得到的IgY抗体效价。从产肠毒素大肠杆菌致病机理，即，大肠杆菌通过菌毛先粘附于肠道绒毛上再分泌肠毒素入手，制备获得了有效的广谱性卵黄抗体。

[0120] 采用相同的实验方法，将大肠杆菌K99和987P分别作为包被原，测定抗LSS和K88菌毛二价混合抗原的IgY抗体，以及抗K88全菌灭活苗、LSS和K88菌毛三价混合抗原的IgY抗体效价。结果显示，抗LSS和K88菌毛二价混合抗原的IgY抗体，以及抗K88全菌灭活苗、LSS和K88菌毛三价混合抗原的IgY抗体同样可以识别K99和987P，效价分别为1:1000和1:2000，表明所述抗体能与K99和987P发生交叉反应，对不同血清型的产肠毒素大肠杆菌也有结合作用，具有一定的广谱性。

[0121] 实施例5特异性IgY对病原菌的生长抑制作用

[0122] 将抗K88的特异性IgY经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，溶于LB液体培养基中至所需浓度：0、1、5和10mg/mL。将E.coli K88加入上述培养基中，使菌终浓度为107cfu/mL。10mg/mL非特异IgY为阴性对照，于37℃180rpm/min振荡培养，每隔2h取样，用酶标仪检测培养的吸光值，检测波长600nm，探究不同剂量的抗K88IgY对E.coli K88生长抑制作用。

[0123] 将10mg/mL的抗K88菌毛、LSS、LSS+K88菌毛二价抗原和K88+LSS+K88菌毛三价抗原的特异性IgY经0.22μm微孔滤膜过滤除菌溶于LB液体培养基中，将E.coli K88加入上述培养基中，使菌终浓度为107cfu/mL。10mg/mL非特异IgY为阴性对照，于37℃180rpm/min振荡培养，每隔2h取样，用酶标仪检测培养的吸光值，检测波长600nm，观察不同组合抗原的特异性IgY对E.coli K88生长的抑制作用。

[0124] 体外抑菌结果表明，特异性IgY与细菌特异性结合，产生白色絮状物，沉淀于培养瓶底部，培养基澄清，当抗体浓度达5mg/mL及以上时可明显抑制E.coli K88的生长，但随着时间的增加，培养基又逐渐浑浊，特异性IgY与细菌的结合程度与剂量正相关。其中，LSS+K88菌毛二价抗原的IgY抗体，以及抗K88全菌灭活苗、LSS融合蛋白和K88菌毛的三价抗原的IgY抗体的体外抑菌效果与单独免疫得到的抗K88IgY效果相当(图5和图6)。