一种肾脏组织类器官3D培养的培养基及类器官培养方法转让专利
申请号 : CN201811638443.8
文献号 : CN109609441B
文献日 : 2020-09-29
发明人 : 郑鸿平 , 黄敏
申请人 : 创芯国际生物科技(广州)有限公司
摘要 :
本发明公开了一种3D培养肾脏组织类器官的培养基及类器官培养方法，本发明的培养基针对于肾脏组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，肾脏细胞及肾癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。
权利要求 :
1.一种3D培养肾脏组织类器官的培养基，其特征在于，肾脏组织选自人或小鼠的肾脏组织；
(1)当肾脏组织为小鼠肾脏组织时，培养基包括以下成分：B27，40-60X稀释；N-
acetylcysteine，1-5mM；EGF，1-100ng/ml；Noggin，50-200ng/ml；R-spondin 1，200-
1000ng/ml或体积分数为10-50％的条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10，5-50ng/ml；
Nicotinamide，1-20mM；Y-27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM；
(2)当肾脏组织为人肾脏组织时，培养基在(1)的基础上，还包括CHIR99021、FGF9和Heparin，三个组分的含量为CHIR99021，1-20μM；FGF9，10-500ng/ml；Heparin，0.1-5μg/ml。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，肾脏组织为肾脏正常组织或肾脏癌组织。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，当肾脏组织为小鼠肾脏组织时，培养基各成分的含量如下：B27，50X稀释；N-acetylcysteine，1.25mM；EGF，50ng/ml；Noggin，
100ng/ml；R-spondin 1，500ng/ml或体积分数为30％的条件培养基；A83-01，500nM；FGF10，
20ng/ml；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM。
4.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，当肾脏组织为人肾脏组织时，各成分的含量如下：B27，50X稀释；N-acetylcysteine，1.25mM；EGF，5ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，500ng/ml或体积分数为30％的条件培养基；A83-01，500nM；FGF10，10ng/ml；
Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM；CHIR99021，5μM；FGF9，200ng/ml；Heparin，1μg/ml。
5.一种肾脏组织类器官培养方法，其特征在于，取肾脏组织冰上剪碎，加入胶原酶重悬，摇床消化，过滤细胞，滤液加入DMEM/F12终止消化，离心，去除上清；取红细胞裂解液重悬细胞，离心，去除上清，加入DMEM/F12重悬，离心，去除上清；细胞计数，混合matrigel，滴于孔板孔正中，放置培养皿，凝固Marteigel；每孔加入权利要求1-4任一项所述的培养基，细胞培养箱培养。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，取肾脏组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心，去除上清；取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min；然后离心，去除上清，加入
10ml DMEM/F12重悬，离心，去除上清；细胞计数，混合matrigel，20000细胞每40μl，滴于48孔板孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO2中10min，凝固Marteigel；每孔加入150μl权利要求
1-4任一项所述的培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养；每间隔3-4天更换一次培养基，使用权利要求1-4任一项所述的培养基。
说明书 :
一种肾脏组织类器官3D培养的培养基及类器官培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及类器官培养领域，进一步涉及肾脏组织类器官培养领域，特别是用于肾脏正常组织或癌组织3D培养的培养基及类器官培养方法。
背景技术
[0002] 现有的技术对肾脏组织主要是普通的培养技术，在二维培养过程中肾脏组织细胞难以或不能充分表达出肾脏组织的的特性，使得培养的肾脏组织细胞和活体的肾脏组织细胞有所差异，不利于研究的进行。而在3D培养中，缺少必要的适宜的培养基的情况下，肾脏组织的培养同样不利，难以充分模拟出体内肾脏组织细胞生理特点。
[0003] 虽然多种人源组织在不同的培养条件下可在体外成功培养成功类器官，但是目前暂无关于肾脏正常组织及癌组织类器官培养方法的研究及报道，尤其是具体的培养条件即培养基配方尚无尝试及报道，本发明专利配方价格适中，可操作性和重复性好。
发明内容
[0004] 本发明目的在于提供一种用于肾脏组织类器官培养的培养基，其配方价格适中，可操作性和重复性好。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：
[0006] 一种3D培养肾脏组织类器官的培养基，上述培养基包括以下成份：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、rhFGF10、Nicotinamide、Y-27632、Prostaglandin E2和SB202190。
[0007] 进一步地，肾脏组织为肾脏正常组织或肾脏癌组织。
[0008] 进一步地，肾脏组织选自人或小鼠的肾脏组织。
[0009] 进一步地，培养基各成分的含量如下：B27，40-60X稀释；N-acetylcysteine，1-5mM；EGF，1-100ng/ml；Noggin，50-200ng/ml；R-spondin1，200-1000ng/ml或体积分数为10-
50％的条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10，5-50ng/ml；Nicotinamide，1-20mM；Y-
27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM。
50％的条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10，5-50ng/ml；Nicotinamide，1-20mM；Y-
27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM。
[0010] 进一步地，当肾脏组织为小鼠肾脏组织时，培养基各成分的含量如下：B27，50X稀释；N-acetylcysteine，1.25mM；EGF，50ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，500ng/ml或体积分数为30％的条件培养基；A83-01，500nM；FGF10，20ng/ml；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM。
[0011] 进一步地，当肾脏组织为人肾脏组织时，培养基还包括CHIR99021、FGF9和Heparin中的一种或多种。
[0012] 进一步地，上述人肾脏组织类器官培养基各成分的含量如下：B27，40-60X稀释；N-acetylcysteine，1-5mM；EGF，1-100ng/ml；Noggin，50-200ng/ml；R-spondin 1，200-1000ng/ml或体积分数为10-50％的条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10，5-50ng/ml；
Nicotinamide，1-20mM；Y-27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM；
CHIR99021，1-20μM；FGF9，10-500ng/ml；Heparin，0.1-5μg/ml。
Nicotinamide，1-20mM；Y-27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM；
CHIR99021，1-20μM；FGF9，10-500ng/ml；Heparin，0.1-5μg/ml。
[0013] 进一步地，上述人肾脏组织类器官培养基各成分的含量如下：B27，50X稀释；N-acetylcysteine，1.25mM；EGF，5ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin1，500ng/ml或体积分数为30％的条件培养基；A83-01，500nM；FGF10，10ng/ml；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM；CHIR99021，5μM；FGF9，200ng/ml；Heparin，1μg/ml。
[0014] 本发明还公开了一种肾脏组织类器官培养方法，具体步骤为：取肾脏组织冰上剪碎，加入胶原酶重悬，摇床消化，过滤细胞，滤液加入DMEM/F12终止消化，离心，去除上清；取红细胞裂解液重悬细胞，离心，去除上清，加入DMEM/F12重悬，离心，去除上清；细胞计数，混合matrigel，滴于孔板孔正中，放置培养皿，凝固martrigel；每孔加入发明内容中的培养基，细胞培养箱培养。
[0015] 进一步地，上述方法的步骤为：取肾脏组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，5min)，去除上清；取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min；然后离心(4℃，200g，5min)，去除上清，加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min)，去除上清；细胞计数，混合matrigel，20000细胞每40μl，滴于48孔板孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO2中
10min，凝固martrigel；每孔加入150μl发明内容中的培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养；每间隔3-4天更换一次培养基，使用发明内容中的培养基。
10min，凝固martrigel；每孔加入150μl发明内容中的培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养；每间隔3-4天更换一次培养基，使用发明内容中的培养基。
[0016] 本发明的3D培养肾脏组织的类器官培养基包括了多种针对于肾脏组织及肾癌组织细胞培养所需要的细胞因子，信号通路调控因子，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，使得肾脏组织细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于活体肾脏组织的综合特性，用此培养基3D培养的肾肿瘤细胞，成团聚集，中间缺氧，类似于肾肿瘤组织。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0018] 本发明的肾脏组织类器官的培养基针对于肾脏组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子、信号通路调控因子含量适宜，肾脏细胞及肾癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。
[0019] 本发明的培养基，可以有效的维持组织细胞特异性、干细胞特性、基因分型高度一致，组织形态也高度相似。除了满足科学研究的需要，在临床用药指导方面，目前肾癌患者没有合适的靶向药物，活检样本的体外3D培养为患者的药物用药指导提供了很好的一个有益的选择。此外，本发明的培养基可以完成肾脏/肾癌组织的传代培养，达到大规模复制肺组织类器官的需求，控制培养得到的类器官具有高度的一致性。
附图说明
[0020] 图1，肾脏癌组织类器官3D培养1、3、5、7天效果图。
[0021] 图2，关键成份重要性研究，5天3D肾脏癌组织类器官培养效果图。
[0022] 图3，关键成份重要性研究，肾脏癌组织类器官培养第1、3、5、7、9天数量折线图。
[0023] 图4，关键成份重要性研究，肾脏癌组织类器官培养第5、7天平均直径柱状图。
[0024] 图5，关键成份重要性研究，肾脏癌组织类器官培养第1、3、5、7、9天数量折线图。
[0025] 图6，关键成份重要性研究，肾脏癌组织类器官培养第5天平均直径柱状图。
具体实施方式
[0026] 下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
[0027] 材料说明：
[0028] DMEM:购自GIBCO公司，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。正常肾脏组织短途运输用DMEM4度低温保存。
[0029] DMEM/F12:购自GIBCO公司，F12培养基Ham’s F12nutrient medium动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的，现在常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1:1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。
[0030] Matrigel:从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出Matrigel基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸卵巢素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
[0031] B27:购自GIBCO公司,即B27补充剂，可维持原代大鼠、小鼠和人PSC来源及胚胎来源的神经元，使人PSC来源和胚胎来源的神经干细胞(NSC)分化成神经元。
[0032] N-acetylcysteine:购自SIGMA公司,N-乙酰半胱氨酸.
[0033] EGF:购自R&D公司，表皮生长因子。
[0034] Noggin,购自Peprotech公司，细胞生长蛋白成分。
[0035] R-spondin 1，购自PeproTech。
[0036] A83-01,购买自Tocris Bioscience。
[0037] FGF10:购自Peprotech公司,成纤维细胞生长因子。
[0038] Nicotinamide：购自SIGMA公司，烟酰胺。
[0039] Y-27632：购自Abmole Bioscience，ROCK特异性通路阻断剂。
[0040] Prostaglandin E2：购自Sigma公司，前列腺素E2。
[0041] SB202190，购自Selleckchem公司。
[0042] CHIR99021，购自SIGMA公司。
[0043] FGF9，购自SIGMA公司。
[0044] Heparin，购自SIGMA公司。
[0045] 实施例1
[0046] 一种3D培养肾脏组织类器官的培养基，上述培养基包括以下成份：B27，50X稀释；N-acetylcysteine，1.25mM；EGF，50ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，500ng/ml或体积分数为30％的条件培养基；A83-01，500nM；FGF10，20ng/ml；Nicotinamide，10mM；Y-
27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM。
27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM。
[0047] 实施例2
[0048] 取小鼠肾脏正常组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。
[0049] 取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min。然后离心(4℃，200g，5min)，去除上清，加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min),去除上清。细胞计数，混合matrigel，20000细胞每40ul,滴于48孔孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO2中10min,凝固martrigel。每孔加入
150μl实施例1制备的条件培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养。每间隔3-4天更换一次培养基，使用实施例1制备的条件培养基。
150μl实施例1制备的条件培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养。每间隔3-4天更换一次培养基，使用实施例1制备的条件培养基。
[0050] 实施例3
[0051] 一种3D培养肾脏组织类器官的培养基，上述培养基包括以下成份：细胞因子B27 50x稀释；N-acetylcysteine 1.25mM；EGF 5ng/ml；Noggin 100ng/ml；R-spondin 1 500ng/ml；A83-01 500nM；FGF10 10ng/ml；烟酰胺10mM；Y-2763210uM；Prostaglandin E2 1μM；
SB202190 10μM；CHIR99021 5μM；FGF9 200ng/ml；Heparin 1μg/ml。
SB202190 10μM；CHIR99021 5μM；FGF9 200ng/ml；Heparin 1μg/ml。
[0052] 实施例4
[0053] 肾脏癌组织类器官培养：
[0054] 取人肾脏癌组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，
5min)，去除上清。
5min)，去除上清。
[0055] 取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min。然后离心(4℃，200g，5min)，去除上清，加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min),去除上清。细胞计数，混合matrigel，20000细胞每40ul,滴于48孔孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO2中10min,凝固martrigel。每孔加入
150μl实施例3制备的条件培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养。每间隔3-4天更换一次培养基，使用实施例3制备的条件培养基。
150μl实施例3制备的条件培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养。每间隔3-4天更换一次培养基，使用实施例3制备的条件培养基。
[0056] 培养效果图参见图1。
[0057] 对比例1
[0058] 对比其他的普通培养基
[0059] 采用现有的普通的培养基(DMEM+10％FBS)3D条件下培养的分散的肾脏组织细胞，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基，结果肾脏组织细胞在培养过程中细胞附着在培养皿底部，与一般细胞培养结果类似，无法形成有结构的、多细胞成份的类器官。
[0060] 对比例2
[0061] 对比无前列腺素的条件培养基
[0062] 采用与实施例4相同但无前列腺素的条件培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肾脏组织类器官形成缓慢，Q-PCR检测肾脏组织相关基因表达发现其中内分泌相关基因水平低于来源的肾脏组织，且传代次数有限(10代之后生长缓慢)。
[0063] 对比例3
[0064] 对比无R-spondin 1的条件培养基
[0065] 采用与实施例4相同但无R-spondin 1的条件培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肾脏组织类器官形成缓慢，肾脏癌类器官生长缓慢，且传代次数有限(10代之后生长缓慢)。
[0066] 对比例4
[0067] 对比无CHIR99021、FGF9、Heparin的条件培养基
[0068] 采用与实施例4相同但无CHIR99021、FGF9、Heparin的条件培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肾脏组织类器官形成缓慢，肾脏癌类器官生长缓慢，且传代次数有限(10代之后生长缓慢)，冻存复苏后难以生存。
[0069] 对比例5
[0070] 对比无CHIR99021的条件培养基
[0071] 采用与实施例4相同但无CHIR99021的条件培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肾脏组织类器官形成比较缓慢，对传代次数及复苏后生存状态无显著影响。
[0072] 对比例6
[0073] 对比无FGF9的条件培养基
[0074] 采用与实施例4相同但无FGF9的条件培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肾脏组织类器官形成比较缓慢，对传代次数及复苏后生存状态无显著影响。
[0075] 对比例7
[0076] 对比无Heparin的条件培养基
[0077] 采用与实施例4相同但无Heparin的条件培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肾脏组织类器官形成比较缓慢，肾脏癌类器官生长比较缓慢，对传代次数及复苏后生存状态无显著影响。
[0078] 各对比例的5天3D肾脏癌组织类器官培养效果图可参见图2，其中正常培养基为实施例4的效果图。
[0079] 各对比例在不同培养时间的3D肾脏癌组织类器官数量对比效果图可参见图3。
[0080] 各对比例在不同培养时间的3D肾脏癌组织类器官平均直径对比效果图可参见图4。
[0081] 各对比例在不同培养时间的3D肾脏癌组织类器官数量对比效果图可参见图5。
[0082] 各对比例在5天的3D肾脏癌组织类器官平均直径对比效果图可参见图6。
[0083] 以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。