提高NK细胞靶向作用力的方法及CCR5基因的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高NK细胞靶向作用力的方法及CCR5基因在提高NK细胞对肿瘤特异性运动能力中的应用，该方法可以通过转基因CCR5到NK细胞中，高表达CCR5的NK将具备更强的肿瘤特异性运动能力，更好的控制肿瘤。

权利要求

1.过表达CCR5基因的NK细胞在制备治疗结肠癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的过表达CCR5基因的NK细胞在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于：所述CCR5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的过表达CCR5基因的NK细胞在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于：在NK细胞中转导入CCR5基因。

4.根据权利要求3所述的过表达CCR5基因的NK细胞在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于：在NK细胞中转导入CCR5基因具体包括以下步骤：（1）获取CCR5编码序列：利用Trizol试剂提取人外周血单核细胞的总RNA后，将其反转录成 c D N A ，P C R 扩 增获 得 C C R 5的 编 码 序 列 ，上 游 引 物 序列 ：5’‑ ggatccatggattatcaagtgtcaag‑3’，下游引物序列：5’‑gcggccgccaagcccacagatatttc‑3’；

（2）重组质粒构建：将慢病毒质粒pCDH‑EF1‑MSC‑T2A‑conGFP与CCR5编码序列PCR产物分别用BamHI和NotI进行双酶切，酶切产物电泳鉴定后，利用快速连接酶连接，得表达人CCR5的慢病毒载体pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP；

（3）病毒包装：将pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP质粒与包装质粒混合，利用磷酸钙转染试剂进行293T细胞转染；

（4）NK细胞感染：将收集的293T细胞转染上清液与活化的NK细胞及polybrene孵育，得感染的NK细胞。

说明书

提高NK细胞靶向作用力的方法及CCR5基因的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高NK细胞靶向作用力的方法及CCR5基因的应用。

背景技术

[0002] 自然杀伤细胞(NK)是一群具备较强肿瘤杀伤能力的免疫细胞，具有良好的临床应用前景。临床试验已经证明NK细胞输注治疗能够有效控制肿瘤、改善患者生存。然而，传统应用的NK细胞向肿瘤部位定向运动的能力较弱，仅有少量NK细胞能够浸润恶性组织，极大地限制了NK细胞治疗。趋化因子及其受体在影响免疫细胞向特异组织定向运动过程中发挥了重要作用，高表达特异趋化因子受体能够增强NK细胞的特异组织聚集能力。研究表明趋化因子CCL5在多种肿瘤中高表达，表达相应受体CCR5的T细胞具有更强的肿瘤浸润能力。

发明内容

[0003] 本发明主要提供了一种提高NK细胞靶向作用力的方法及CCR5基因的应用，可以通过转基因CCR5到NK细胞中，高表达CCR5的NK将具备更强的肿瘤特异性运动能力，更好的控制肿瘤。其技术方案如下：

[0004] CCR5基因在提高NK细胞对肿瘤特异性运动能力中具有生物学应用。

[0005] 一种慢病毒表达载体，所述载体载有CCR5基因，CCR5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 优选的，所述CCR5基因为在pCDH‑EF1‑MSC‑T2A‑conGFP质粒中表达，形成pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP质粒。

[0007] 一种慢病毒，所述慢病毒为将上述慢病毒表达载体与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染包装细胞293T得到。

[0008] 一种提高NK细胞靶向作用力的方法，具体的为，在NK细胞中转导入CCR5基因。

[0009] 优选的，具体方法包括以下步骤：

[0010] (1)获取CCR5编码序列：利用Trizol试剂提取人外周血单核细胞的总RNA后，将其反转录成cDNA，PCR扩增获得CCR5的 编码序列 ，上游引物序列 ：5’‑ggatccatggattatcaagtgtcaag‑3’，下游引物序列：5’‑gcggccgccaagcccacagatatttc‑3’；

[0011] (2)重组质粒构建：将慢病毒质粒pCDH‑EF1‑MSC‑T2A‑conGFP与CCR5编码序列PCR产物分别用BamHI和NotI进行双酶切，酶切产物电泳鉴定后，利用快速连接酶连接，得表达人CCR5的慢病毒载体pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP；

[0012] (3)病毒包装：将pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP质粒与包装质粒混合，利用磷酸钙转染试剂进行293T细胞转染；

[0013] (4)NK细胞感染：将收集的293T细胞转染上清液与活化的NK细胞及polybrene孵育，得感染的NK细胞。

[0014] 一种NK细胞，其由上述方法制备而成。

[0015] 采用上述方案，本发明具有以下优点：

[0016] 本发明方法能够快速获得大量具备肿瘤靶向运动特性的NK细胞，同时不会对NK细胞的杀伤能力产生影响。此种CCR5工程化NK细胞具备更强的肿瘤浸润能力，能够更好得抑制肿瘤生长，具有较好临床转化前景。

附图说明

[0017] 图1为CCR5慢病毒过表达质粒结构示意图；

[0018] 图2为CCR5转基因在NK细胞中的表达结果图；

[0019] 图3为CCR5转基因NK细胞的杀伤活性结果图；

[0020] 图4为CCR5转基因NK细胞的定向运动能力结果图；

[0021] 图5为CCR5转基因NK细胞浸润肿瘤的能力结果图；

[0022] 图6为CCR5转基因NK细胞的抗肿瘤能力结果图。

具体实施方式

[0023] 以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。

[0024] 1.CCR5编码序列的获得

[0025] 利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取人外周血单核细胞的总RNA后，将其反转录成cDNA。然后，PCR扩增获得CCR5的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)，其中上游引物序列：5’‑ggatccatggattatcaagtgtcaag‑3’(下划线为BamHI酶切位点)，下游引物序列：5’‑gcggccgccaagcccacagatatttc‑3’(下划线为NotI酶切位点)。

[0026] 2.CCR5慢病毒过表达质粒构建

[0027] 将慢病毒质粒pCDH‑EF1‑MSC‑T2A‑conGFP或CCR5编码序列PCR产物分别用BamHI和NotI进行双酶切。酶切产物电泳鉴定后，利用快速连接酶(NEB公司)进行连接。连接产物转化大肠杆菌，获得单克隆菌落后，进行测序鉴定。测序正确的质粒即为表达人CCR5的慢病毒载体(pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP)，其结构示意如图1所示。

[0028] 3.病毒包装与NK细胞感染

[0029] 包装细胞293T铺板24小时后，将pCDH‑EF1‑MSC‑T2A‑conGFP(对照质粒)或pCDH‑EF1‑CCR5‑T2A‑conGFP质粒(CCR5表达质粒)与包装质粒(psPAX2与pMD2.G)混合，利用磷酸钙转染试剂进行293T细胞转染。转染48小时后，收集上清待用；利用NK细胞分离试剂盒(美天旎公司)，分离自健康人外周血的NK细胞经100IU/mL白介素2(IL‑2)活化48小时，然后与病毒上清及polybrene(8μg/mL)孵育过夜。次日，离心清洗3次后继续加入含IL‑2(100IU/mL)和5％太牛血清的RPMI1640培养基进行培养。72小时后检测NK细胞CCR5表达及相应功能。

[0030] 4.CCR5转基因在NK细胞中的表达

[0031] NK细胞感染后72小时，利用流式细胞术检测CCR5与绿色荧光蛋白GFP的表达。如图2中A所示，感染对照病毒(NK‑MIG)和CCR5表达病毒(NK‑CCR5)的NK细胞中均有GFP表达，说明外源基因被有效整合入NK细胞基因组并能够被有效表达。此外，目的基因CCR5也能够通过病毒转导入NK细胞并表达(图2中B所示)。与普通NK细胞(NK)和对照病毒感染NK细胞(NK‑MIG)相比，CCR5表达病毒感染的NK细胞(NK‑CCR5)中CCR5阳性率显著上调。

[0032] 5.NK细胞杀伤功能未受转基因影响

[0033] 病毒感染后7天，取不同病毒感染的NK细胞与靶细胞HCT116共孵育6小时，其中效靶比(效应细胞:靶细胞，E:T)分别为0:1，0.2:1，1:1和5:1。如图3所示，病毒感染的NK细胞(NK‑MIG或NK‑CCR5)的杀伤活性与普通NK细胞没有差异，说明CCR5转基因不会影响NK细胞本身的杀伤能力。

[0034] 6.转基因NK细胞的定向运动能力增强

[0035] 在Transwell板(康宁公司)下室加入1 mL含人CCL5重组蛋白的无血清RPMI1640培养基，上市加入病毒感染7天的NK细胞或对照NK细胞。细胞培养箱中静置1小时后，吸取下室培养基100μL，对其中的细胞数进行流式计数，并计算迁移指数(Migration Index，＝不同处理组迁移到下室的细胞数量/对照NK细胞迁移到下室的数量)。如图4所示，与普通NK细胞(NK)和对照病毒感染NK细胞(NK‑MIG)相比，CCR5表达病毒感染的NK细胞(NK‑CCR5)的定向运动能力显著增强，提示CCR5转基因能够改善NK细胞的靶向运动能力。

[0036] 7.动物实验证明CCR5转基因NK细胞的肿瘤浸润增强

[0037] 免疫缺陷小鼠皮下接种5×106个HCT116肿瘤细胞。10天后，尾静脉输注5×106个经Cy5.5NHS酯(Cy5.5NHS easter)标记的NK细胞(NK‑MIG或NK‑CCR5)。NK细胞输注后3天，利用小动物成像设备观察NK细胞在肿瘤中的聚集情况。如图5所示，CCR5转基因NK细胞在肿瘤中的聚集显著强于对照病毒感染的NK细胞(A)，统计分析也支持这一结论(B)，说明CCR5过表达确实能够提高NK细胞向肿瘤的定向运动。

[0038] 8.动物实验证明CCR5转基因NK细胞的肿瘤清除能力更强

[0039] 免疫缺陷小鼠皮下接种5×106个HCT116肿瘤细胞。10天后，尾静脉输注5×106个NK细胞(NK‑MIG或NK‑CCR5)。在NK细胞输注后，每周称量肿瘤体积2次，以分析不同NK细胞的治疗效果。如图6所示，相对磷酸盐缓冲液治疗组(PBS)，对照病毒处理的NK细胞(NK‑MIG)能够控制肿瘤生长，而CCR5转基因NK细胞能够进一步提高治疗效果，更加明显地抑制了肿瘤生长，说明CCR5转基因NK细胞具备较强的抗肿瘤能力。

[0040] 对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。