用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组和试剂盒

摘要

本发明公开了用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组和试剂盒，属于疾病检测技术领域，本发明试剂盒引物组，引物组包括引物组Ⅰ和引物组Ⅱ，引物组Ⅰ包括如SEQ ID NO:1～304所示的上下游引物序列，引物组Ⅱ包括如SEQ ID NO:305～606所示的上下游引物序列。本发明设计的引物组是针对ATP7B整个基因，不仅可以检测已知高发突变，还可发现新的突变位点。

权利要求

1.用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组，其特征在于，包括引物组Ⅰ和引物组Ⅱ，所述引物组Ⅰ包括如SEQ ID NO:1～304所示的上下游引物序列，所述引物组Ⅱ包括如SEQ ID NO:305～606所示的上下游引物序列。

2.一种用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组，所述引物组Ⅰ中上下游引物等量混合稀释，引物组Ⅰ中上下游引物的浓度均为400nM；所述引物组Ⅱ中上下游引物等量混合稀释，引物组Ⅱ中上下游引物的浓度均为

400nM。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还至少包括PCR反应液、DNA连接酶、引物消化液、连接缓冲液、P1接头、Barcode X特异性接头、文库扩增反应液、文库扩增引物液、AMPureXP磁珠和无核酸酶水中的一种。

说明书

用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于疾病检测技术领域，尤其涉及用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组和试剂盒。

背景技术

[0002] 肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration，HLD)，又称为Wilson病(Wilson’s desease，WD)，其是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病，为常见的神经系统遗传病。资料显示，本病在世界范围内不同人群的发病率为15～30/100万，患病率为1/3万，携带者频率约为1/90。WD主要是由于ATP7B基因突变而引起的铜代谢障碍，由于铜大量沉积在脑、肝、肾、角膜等组织并产生自由基，造成多个器官的损害，临床表现复杂多样，具有很高的临床异质性，主要表现为急、慢性神经/精神症状、肾功能障碍和角膜K-F环等。根据其临床症状可分为脑型、肝型、混合型和其他类型。WD主要是通过其临床表现和生化检查来确诊，生化检查包括检测血清铜蓝蛋白、24小时尿铜和基因突变分析。WD是少数可以治疗的遗传病之一，若患者在患病早期或症状前期被确诊并及时控制铜摄入和进行排铜治疗，大多患者预后良好；反之病情则会逐渐加重甚至危及生命。

[0003] 肝豆状核变性病的致病基因是ATP7B基因，ATP7B基因位于13q14.3，全长80Kb，含21个外显子和 20个内含子，共编码1465个氨基酸，其编码一个P型铜转运ATP酶。该ATP酶有
6个铜离子结合区、8 个跨膜功能区、1个转导区、1个离子通道及磷酸化区、1个核酸结合域和1个ATP结合区。目前报道ATP7B 基因已有超过800种基因突变，分布于整个基因，基因突变的方式包括插入突变、缺失突变、移码突变、剪接突变等，尤以点突变中的错义突变为主，且大多数突变出现在外显子上，少数出现在外显子和内含子的交界侧翼区中。另外，也有研究报道在其外显子之外的DNA序列(如内含子、启动子以及其他调控区) 可能存在一些未知的改变，这些改变影响着ATP7B基因的表达。

[0004] 目前，ATP7B基因突变的检测方法有：RFLP/STR/SNP-家系连锁分析、PCR-SSCP分析、PCR酶切和荧光PCR技术、变性高效液相色谱(DHPLC)分析、DNA测序技术、DNA微阵列技术等。

[0005] 近几十年以来，测序技术高速发展，Sanger测序法和化学降解法作为第一代测序法的代表已被广泛应用于医学、生命科学等相关的领域，虽然其测序读长长、准确、可靠，但却因依赖于电泳分离技术而难以实现微量化和高通量化，这就造成测序成本高、效率低。近年来以芯片测序、合成测序和焦磷酸测序为代表的下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)能弥补一代测序的不足，实现快速、通量高的规模化测序。以Ion Torrent PGMTM(个体基因组测序仪)以及更高通量的Ion Torrent Proton测序仪为代表的半导体测序技术，其不属于荧光检测、核酸标记的生化技术，与其他二代测序技术相比更简单、性价比更高，并且具有强大的扩展性。Ion Torrent测序原理的核心是采用半导体技术将化学信号转化成数字信号，该技术采用布满小孔的半导体芯片，每一个小孔都是一个测序反应池，边合成边测序，每一个核苷酸经 DNA聚合酶添加到正在合成的DNA链上时，都会释放出一个氢离子，从而引起反应池中pH值的变化，此时反应池下方的离子感受器能够感受此信号，将化学信号直接转化成数字信号，从而读出DNA序列。

[0006] 已有关于ATP7B基因突变检测的专利报道，如首都医科大学附属北京友谊医院的黄坚等人发明的肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，但其只针对个别外显子上的高发突变位点进行检测，而未覆盖检测ATP7B整个基因。

发明内容

[0007] 本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组和试剂盒，本发明设计的引物组是针对ATP7B整个基因，不仅可以检测已知高发突变，还可发现新的突变位点。

[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组，其包括引物组Ⅰ和引物组Ⅱ，所述引物组Ⅰ包括如SEQ ID NO:1～304所示的上下游引物序列，所述引物组Ⅱ包括如SEQ ID NO:305～606所示的上下游引物序列。

[0009] 另外，本发明还提供一种用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的试剂盒，其包括所述的引物组。

[0010] 作为上述技术方案的改进，所述引物组Ⅰ中上下游引物等量混合稀释，引物组Ⅰ中上下游引物的浓度均为400nM；所述引物组Ⅱ中上下游引物等量混合稀释，引物组Ⅱ中上下游引物的浓度均为400nM。

[0011] 作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还至少包括PCR反应液、DNA连接酶、引物消化液、连接缓冲液、P1接头、Barcode X特异性接头、文库扩增反应液、文库扩增引物液、AMPure XP磁珠和无核酸酶水中的一种。

[0012] 另外，本发明还提供一组肝豆状核变性致病基因ATP7B的突变信息：通过查找文献等相关资料，利用 NCBI(美国国立生物信息中心)官网，筛选OMIM(在线孟德尔遗传)数据库、clinvar数据库等确定肝豆状核变性病ATP7B的碱基变化、以及在染色体上的位置等信息。

[0013] 另外，本发明还提供检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的一种方法，包含有文库构建和高通量测序两部分；文库构建包括以下步骤：目的基因扩增，部分引物消化，接头连接，连接产物纯化，文库扩增，文库纯化，文库定量；高通量测序包括以下步骤：模板扩增，模板富集，上机测序。

[0014] 另外，本发明还提供了一种分析方法，采用测序仪配套的服务器和软件进行序列比对和分析，运行 Variant Caller和Coverage Analysis插件获得样本的测序结果。

[0015] 本发明的有益效果在于：本发明提供用于检测肝豆状核变性病ATP7B基因突变的引物组和试剂盒，本发明试剂盒包含引物组，引物组包括引物组Ⅰ和引物组Ⅱ，引物组Ⅰ包括如SEQ ID NO:1～304所示的上下游引物序列，引物组Ⅱ包括如SEQ ID NO:305～606所示的上下游引物序列；本发明设计的引物组是针对 ATP7B整个基因，不仅可以检测已知高发突变，还可发现新的突变位点。

附图说明

[0016] 图1为序列测序长度分布图。

具体实施方式

[0017] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

[0018] 针对ATP7B基因，设计的引物组

[0019] 利用Ion AmpliSeq Designer在线设计扩增ATP7B基因的引物，通过英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物，根据引物的序列特点和Tm值等特点将引物组分为2组，本发明设计的引物如表1所示。

[0020] 表1

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[0037] ATP7B基因突变检测方法

[0038] 试剂

[0039] 核酸提取或纯化试剂(广州市达瑞生物技术股份有限公司)、Qubit dsDNA HS Assay Kit、Ion Ampliseq  Library Kit 2.0、Ion Xpress Barcode adapters1-96、无水乙醇、AMPure XP beads、测序反应通用试剂盒(半导体法)(广州市达瑞生物技术股份有限公司，备案号：粤穗械备20160061号)、异丙醇、氢氧化钠等。

[0040] 引物组的配置

[0041] 每个组的引物取等量混合后稀释到400nM，配置成引物组I和引物组II。

[0042] 样本DNA提取及定量

[0043] 根据核酸提取或纯化试剂配套的说明说进行实验操作获取样本DNA，随后用Qubit 3.0荧光定量仪(life  technology)测得DNA浓度。

[0044] 文库构建

[0045] 1)目的基因扩增：按表2在PCR管中配制反应体系，按表3进行PCR反应扩增；每个样本用引物组Ⅰ，引物组Ⅱ分别进行2个反应；

[0046] 表2

[0047]

[0048]

[0049] 表3

[0050]

[0051] 2)部分引物消化：扩增结束后取出PCR管，静置到室温后低速离心3～5秒，使管壁和盖子上无明显液滴，将同一样本的2个引物组PCR反应管混合为一管，体积为20μL。向PCR管中加入2μL FuPa Reagent，涡旋震荡混匀并低速离心3～5秒，置于PCR仪上按表4反应条件进行反应；

[0052] 表4

[0053]

[0054] 3)接头连接：接头按表5进行稀释，连接反应体系的配置如表6所示，连接反应的程序如表7所示；

[0055] 表5

[0056]

[0057] 表6

[0058]

[0059] 表7

[0060]

[0061] 4)连接产物纯化：向连接产物中加入45μL AMPure XP beads进行纯化，得到晾干了的吸附着DNA的磁珠。

[0062] 5)文库扩增：根据表8配制扩增反应液，加进步骤4晾干的AMPure XP beads中，并转移到PCR管；文库扩增的程序如表9所示；

[0063] 表8

[0064]

[0065] 表9

[0066]

[0067] 6)文库纯化与定量：向PCR管中加入36.4μL的AMPure XP beads，吹打混匀，转移到新的1.5mL 的EP管中，室温放置5分钟；把EP管放到磁力架上，待溶液澄清，把上清液转移到新的EP管中，弃去磁力架上的EP管；在EP管中加入57.2μL的AMPure XP beads进行纯化，最后得到22μL的文库；用Qubit 3.0荧光定量仪测得文库浓度；

[0068] 7)高通量测序：将各文库等量混合成OT mix，如各取3ng进行混合，混合后的OT mix用Qubit 3.0 荧光定量仪测其文库浓度，根据公式 稀释到200pM，使用测序反应通用试剂盒对文库进行测序，实验操作按照试剂盒配套的说明书进行；

[0069] 8)数据分析：采用测序仪配套的服务器和软件进行序列比对和分析，运行Variant Caller和Coverage  Analysis插件获得样本的测序结果，每个样本生成一个包含所有检测位点信息的Excel表；当突变频率为 0则为野生型，突变频率在50％左右为杂合突变型，突变频率在100％左右为纯合突变型。

[0070] 临床样本测序质量分析

[0071] 按上述方法对临床收集的20例全血样本进行试验，如图1所示，测序完成后运用MultiQC V1.0进行测序质量分析，其中Total_Reads表示测到的总Reads数，Mean Reads Length表示测序片段平均长度，Mapping  Reads表示与Hg19比对上的Reads数，Reads Mapped to Target Region表示与目标基因比对上的Reads数，Mean  Depth of Target Region表示目标基因区域的平均测序深度，Fraction of target covered≥100X(％)表示目的片段测序深度达100X的占比，Uniformity of Target Region(％)表示目标区域的测序均一性，Coverage of Target  Region(％)表示目标序列的测序覆盖率，Capture Specificity(％)表示捕获特异性比率，即Reads Mapped to  Target Region与Total Reads的比例，结果如表10所示下。

[0072] 表10

[0073]

[0074] 从以上20个样本的测序结果分析来看，平均每个样本的测序reads数为1387406.25，各样本平均测序片段长度最大为199.85bp，最小为150.1bp，20个样本的测序平均长度为183.58bp，测序平均深度为1859×，目标区域测序深度100×的占比平均值为
95％以上，目标区域的测序均一性平均达86.22％，目标区域的测序覆盖率达99.44％，捕获特异性比率为59.26％；这说明本次临床样本测序质量较好。

[0075] 临床样本的ATP7B突变点分析

[0076] 1)突变点的确定：查找确定的突变热点如表11所示：NM号为NM_000053；

[0077] 表11

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[0079]

[0080]

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[0082]

[0083]

[0084]

[0085]

[0086] 2)临床样本检测：按照上述方法对临床收集的93例临床收集的肝豆病人进行测序，运行相关插件，结果如表12所示。

[0087] 表12

[0088]

[0089]

[0090]

[0091] 这93例样本共检测到28种突变类型，平均测序深度为4421×，远远超出市场上测序深度100×的要求，杂合突变频率落在37.7％～55.1％之间，纯合突变频率落在90.5％～100％之间，这完全符合本发明的结果判定要求。由此可见，本发明检测方法的准确性好、通量高以及应用于临床研究的可行性好。

[0092] 最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。