一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法

摘要

本发明公开一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK‑tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物的水解度大于50%，相对于无血清培养基的终浓度为1.0‑4.0mg/ml。本发明利用花生蛋白酶解物代替谷氨酰胺，用于重组CHO细胞的体外培养方法，以提高TNK‑tPA的表达水平。在培养周期内，TNK‑tPA的表达、分泌水平可以达到较高水平，将TNK‑tPA的终产量提高了近数倍，并且易于后续的规模放大和工业化生产。

权利要求

1.一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，其特征在于：利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述流加培养前，将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖；所述花生蛋白酶解物的水解度大于50%，相对于无血清培养基的终浓度为1 .0-4 .0mg/ml；所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：(1)脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；

(2)将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物；

所述含有花生蛋白酶解物的无血清培养基中不含谷氨酰胺。

2.如权利要求1所述的一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，其特征在于： 所述终浓度为2 .0-4 .0mg/ml。

3.如权利要求1所述的一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，其特征在于： 所述终浓度为4 .0mg/ml。

4.如权利要求1所述的一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，其特征在于： 所述中性条件为pH 6 .5-7 .5。

5.如权利要求1所述的一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述碱性条件为pH 7 .5-8 .5。

说明书

一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明属于治疗性重组蛋白质药物领域，具体涉及一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法。

背景技术

[0002] 近年来，利用哺乳动物细胞制备治疗性蛋白质药物的市场需求日益增强。在重组蛋白质药物领域，哺乳动物细胞的流加批次(Fed-batch)培养和灌流（Perfusion）培养是大规模生产重组糖基化蛋白的两大平台。对于具体的蛋白质药物而言，在考虑平台选择时，需要综合考虑诸多参数和影响因素，如目标蛋白的理化性质、细胞系的生物学性质、目标蛋白的表达分泌水平、终产品的质量与稳定性、生产规模、分离纯化能力、成本等。

[0003] 但哺乳动物细胞作为“生物微工厂”存在着产能较低、成本较高等问题。为克服这些障碍，研究人员在诸如细胞系选择、克隆技术筛选、表达载体构建、培养基优化、代谢工程优化、生物反应器工艺改进等方面做了大量研究。其中，通过优化培养基配方联合流加批次（fed-batch）培养已经成为改善哺乳动物细胞产能的最为有效途径。利用此组合技术，在过去的10余年间重组蛋白的产量从50mg/L增加到了10g/L。

[0004] 为获得哺乳动物细胞的高生长速率、高细胞密度和高产能，通常在流加培养时需要补充高浓度的谷氨酰胺作为细胞生产的能量。但是，高浓度谷氨酰胺在细胞培养过程中会产生副产物铵盐。由于流加批次培养常需要20天以上，致使铵盐的浓度可以累积高至20mM，这样高浓度的代谢副产物铵盐反过来会抑制细胞的生产和产能，致使重组蛋白的终产量降低。为减轻铵盐的累积速率，研究人员通过降低谷氨酰胺的流加速率、离子交换层析、肝细胞共培养、筛选谷氨酰胺代替物等技术手段来减低铵盐的浓度。

[0005] TNK-tPA即重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体，也称TNKase或Tenecteplase。 TNK-tPA属于第三代溶栓药物，通过激活血栓表面的纤溶酶原而启动机体的溶纤系统临床上主要用于心脑血管栓塞、肺栓塞等的溶栓治疗。

[0006] 国内公开的TNK-tPA规模培养技术有两项：在“一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的方法”（专利授权号为CN100543131C）的发明专利中，公开了动物细胞无血清结团灌流培养工艺，据其介绍，采用超声-沉降双结合的灌流系统，可以使动物细胞形成团状聚集，从而达到提高细胞密度的目的。这项技术的缺点是要求特定的发酵系统、工艺复杂而难以自动化、细胞结团的影响因素过多而致批间差增大等。在“微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂tnk突变体的工艺”（公开号为CN101096655A）的发明专利中，公开了重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(rhTNK-tPA) （ TNK-tPA）的生产新工艺，此工艺采用Cytopore多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体，产量可以达到55mg/L。

[0007] 从上述授权专利或专利申请的内容可以看出，两者都存在着TNK-tPA产量过低的缺陷，致使大规模工业化生产的产能不足、成本过高，难以实现产业化和商业化。

发明内容

[0008] 有鉴于此，本发明提供一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法。

[0009] 本发明是通过下述技术方案实现的。

[0010] 一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，其特征在于：利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物的水解度大于50%，相对于无血清培养基的终浓度为1.0-4.0mg/ml。

[0011] 优选地，所述终浓度为2.0-4.0mg/ml；

[0012] 进一步优选地，所述终浓度为4.0mg/ml；

[0013] 进一步地，所述流加培养前，将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖；

[0014] 本发明中，所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：

[0015] (1) 脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；

[0016] （2）将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。

[0017] 所述中性条件为pH 6.5-7.5。

[0018] 所述碱性条件为pH 7.5-8.5。

[0019] 更进一步地，所述含有花生蛋白酶解物的无血清培养基中不含谷氨酰胺。

[0020] 本发明利用花生蛋白酶解物代替谷氨酰胺，用于重组中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞的体外培养方法，以提高TNK-tPA的产量。在20天的培养周期内，TNK-tPA的表达、分泌水平可以达到400mg/L，将TNK-tPA的终产量提高了5倍以上，并且易于后续的规模放大和工业化生产。

附图说明

[0021] 图1：培养周期内活细胞的密度变化曲线。

[0022] 图2：培养周期内培养基中TNK-tPA的浓度变化曲线。

具体实施方式

[0023] 下面对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

[0024] 一种利用花生蛋白酶解物培养CHO细胞的方法，利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物的水解度大于50%，相对于无血清培养基的终浓度为1.0-4.0mg/ml。优选地，所述终浓度为2.0-4.0mg/ml,进一步优选地，所述终浓度为4.0mg/ml。按上述培养条件，持续培养18-20天，并逐日检测活细胞计数和TNK-tPA浓度测定。

[0025] 进一步地，所述流加培养前，将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖。优选地，将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖的具体方法是[0026] （1）快速解冻一支重组TNK-tPA的原代CHO种子细胞（CHO-D2），接种至含20ml无血清培养基（CD-CHO）的T75方瓶中，在温度37℃、湿度100%及5%CO2的条件下培养24小时。

[0027] （2）将上述CHO-D2细胞转至125ml摇瓶内，瓶内培养基为无血清培养基（CD-CHO）。在125rpm、37 ℃、100 %湿度及5 %CO2的条件下培养3天至对数生长期，此时细胞密度约为
2x106个/ml。

[0028] rpm离心收集细胞。以2×10 （3）取上述对数生长期的CHO-D2细胞，经8005L。培养条件为pH7.0±0.2、DO为50％空气饱和度、温度为37℃，搅拌转速为80rpm。培养过程中每隔24小时取样，进行活细胞计数和测定TNK-tPA浓度。 B)，培养体积为1.0 BIOSTAT 个/mL的活细胞密度接种至生物反应器(2L 

[0029] 本发明中，所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：

[0030] (1) 脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；所述中性条件为pH 6.5-7.5。

[0031] (2)将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物；所述碱性条件为pH 7.5-8.5。

[0032] 更进一步地，本发明中所述花生蛋白酶解物的制备方法如下：

[0033] 将鲜花生米在180℃烤箱内烘烤1小时，冷却后用粉碎机粉碎，以20目筛网筛选。在所得粉末中加入8倍体积的正己烷，搅拌90分钟，然后静置2小时，倒掉上层溶液，真空干燥，获得花生蛋白的脱脂粉末。

[0034] 取上述花生蛋白脱脂粉末500g,加入2000ml的双蒸水，用氢氧化钠调节pH至7.0，加入中性蛋白酶（Neutrase）25g ,酶终浓度至5%，在温度55℃下搅拌酶解6小时。

[0035] 将上述酶解物用用氢氧化钠调节pH至8.0，加入40g碱性蛋白酶（Alcalase）,酶终浓度至8%，温度升至60℃，搅拌酶解6小时。

[0036] 酶解结束后，升温至90℃，保持20分钟以灭活蛋白酶。最后经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。用纯净水配制上述花生蛋白酶解物溶液，其终浓度为100mg/ml。经0.2微米滤膜过滤后备用。

[0037] 本发明中采用pH-stat法测定反应过程中的水解度

[0038]

[0039] 其中，B为消耗碱量；N为碱的摩尔浓度；α为花生蛋白氨基的平均解离度；m为底物水解蛋白的质量（g）; h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数。

[0040] 本发明中，活细胞计数采用台盼蓝（trypan blue）染色法，将上述每日取样的部分样品与等量的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液混合，37℃温育10-15分钟，轻摇以分散细胞，用Cedex自动细胞计数仪检测细胞总数、活细胞数量及两者的比例。

[0041] TNK-tPA浓度测定采用定量ELISA方法，按R&D Systems公司的人tPA定量检测试剂盒试剂盒（Human t-Plasminogen Activator/tPAQuantikine ELISA Kit）的操作程序进行，其检测敏感性为16.1pg/mL。

[0042] 下面通过具体的对比例及实施例来进一步说明本发明的有益效果。

[0043] 对比例1

[0044] 在流加培养前，先将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖48小时后，利用含有L-谷氨酰胺的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述L-谷氨酰胺相对于无血清培养基的浓度为4.0mg/ml，持续培养20天，并逐日检测活细胞计数和TNK-tPA浓度测定。

[0045] 实施例1

[0046] 按照前述方法制备花生蛋白酶解物，在流加培养前，先将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖48小时后，利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物相对于无血清培养基的终浓度为0.5mg/ml，持续培养20天，并逐日检测活细胞计数和TNK-tPA浓度测定。

[0047] 实施例2

[0048] 按照前述方法制备花生蛋白酶解物，在流加培养前，先将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖48小时后，利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物相对于无血清培养基的终浓度为1mg/ml，持续培养20天，并逐日检测活细胞计数和TNK-tPA浓度测定。

[0049] 实施例3

[0050] 按前述方法制备花生蛋白酶解物，在流加培养前，先将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖48小时后，利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物相对于无血清培养基的终浓度为2mg/ml，持续培养20天，并逐日检测活细胞计数和TNK-tPA浓度测定。

[0051] 实施例4

[0052] 按前述方法制备花生蛋白酶解物，在流加培养前，先将TNK-tPA表达CHO细胞株在谷氨酰胺培养基中的繁殖48小时后，利用含有花生蛋白酶解物的无血清培养基对TNK-tPA表达CHO细胞株进行流加培养，所述花生蛋白酶解物相对于无血清培养基的终浓度为4mg/ml，持续培养20天，并逐日检测活细胞计数和TNK-tPA浓度测定。

[0053] 各对比例及实施例的活细胞计数和TNK-tPA浓度测定结果见表1：

[0054] 表1：花生蛋白酶解物对CHO细胞生长及TPA产量的影响

[0055]

[0056] 在20天的培养周期内，各对比例及实施例活细胞的密度变化及TNK-tPA浓度变化见附图1、图2。

[0057] 参见图1-2，在培养周期内，至培养的第10-12天，活细胞密度达到峰值。其后，活细胞密度逐步下降。活细胞密度以添加4.0mM 花生蛋白酶解物培养基为最高，高峰时活细胞密度超过1x107个/ml。其后，活细胞密度逐步下降，至培养的第20天，活细胞密度降至峰值的50%以下。

[0058] 在细胞接种的第二天起，即可测出明显的TNK-tPA含量，其后培养基上清内TNK-tPA含量逐步升高，至培养的第19-20天，培养基上清内TNK-tPA浓度达到峰值。在添加4.0mM的花生蛋白酶解物中，TNK-tPA浓度超过400mg/L，是添加谷氨酰胺的近5倍。

[0059] 本发明利用花生蛋白酶解物代替谷氨酰胺，用于重组中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞的体外培养方法，以提高TNK-tPA的表达水平。在20天的培养周期内，TNK-tPA的表达、分泌水平可以达到400mg/L，将TNK-tPA的终产量提高了近5倍，并且易于后续的规模放大和工业化生产。

[0060] 更进一步地，所述含有花生蛋白酶解物的无血清培养基中不含谷氨酰胺。

[0061] 中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary, CHO）广泛应用于重组蛋白的大规模生产。考虑到下游的处理难易度及生物安全性，在大规模生产中，CHO细胞的培养大多采用无血清培养基。但目前尚未有一个通用的无血清培养基配方。不同重组蛋白的生产都需要根据细胞株的性质、生产规模、培养工艺等设计独特的无血清培养基配方及添加剂。

[0062] 利用植物蛋白水解物代替谷氨酰胺，可以有效降低铵盐的生成，从而降低其毒副作用。另一方面，植物蛋白水解物本身的性质和生物学活性也能够促进细胞的生长及增强重组蛋白的合成，从而提高重组蛋白的产能。植物蛋白水解物的短肽、氨基酸等成分既可以作为营养素的替代物促进细胞的繁殖，也可以通过其抗细胞凋亡（anti-apoptosis）功能而延长细胞的存活时间。在蛋白质组(proteome)和基因组（Genome）水平上，植物蛋白水解物发挥功能的机制主要体现在三个方面： 上调代谢相关蛋白及增殖相关蛋白的表达水平，这些蛋白包括磷酸甘油酸酯激酶（Phosphoglycerate kinase, PGK）、醇化酶1（Enolase 1, ENO）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）、磷酸丝胺酸氨基转移酶（Phosphoserine aminotransferase, PSAT）、 核基质蛋白（Nuclear matrix ptotein, SNEV）、 细胞核酸结合蛋白（Cellular nucleic acid binding protein, CNBP）和ErbB3受体结合蛋白（ErbB3 receptor-binding protein, Ebp1）；   下调抗增殖蛋白（anti-proliferative proteins）及凋亡促进蛋白（pro-apoptotic proteins）的表达水平,这些蛋白包括N-Myc下调基因1（N-Myc downstream regulated gene 1, NDRG1）、 转化控制肿瘤蛋白1（Tumor protein, translationally-controlled 1,TCTP）和p53凋亡刺激蛋白2（Apoptosis-stimulating of p53 protein 2, ASPP2）；   改变伴侣蛋白（chaperone proteins）的表达水平,这些蛋白包括钙网织蛋白（Calreticulin, CRP55）、 蛋白质二硫异构酶（Protein disulfide isomerase, PDI）和ERP57蛋白（ERP57 protein, ERp57）。

[0063] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。