一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架及其制备方法。它是以丝素蛋白和三聚氰胺为主要原料合成三嗪化丝素蛋白，然后与聚己内酯一起溶于有机溶剂中，经高压静电纺丝后制备得到纳米纤维支架。通过调节三嗪化丝素蛋白与聚己内酯的质量比，可获得具有不同理化和生物学性能的纳米纤维支架。实验结果表明，这类纳米纤维支架具有与细胞外基质相似的3D网络结构以及良好的力学强度，亲疏水性和生物相容性，能够满足生物医用材料的性能需求。该制备方法成本较低，环境污染小，在实际生产过程中具有较大的应用潜力。

权利要求

1.一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 将丝素蛋白、三聚氰胺、4-二甲氨基吡啶和乙二醇二缩水甘油醚溶解于pH=8.0的磷酸盐缓冲液中，50-65℃条件下避光反应12-18h得到交联溶液；

(2) 将步骤（1）得到的交联溶液转移至透析袋中，采用去离子水透析除去未反应的小分子单体，透析产物经冷冻干燥后得到三嗪化丝素蛋白；

(3) 将聚己内酯和步骤（2）得到的三嗪化丝素蛋白分别溶解在有机溶剂中，然后按照一定的比例混合均匀，离心脱气泡后得到电纺溶液；

(4) 将步骤（3）得到的电纺溶液转移至静电纺丝机的推注泵中，经高压静电纺丝后得到纳米纤维支架。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）得到的交联溶液对应的丝素蛋白的含量为20-40 g/L，三聚氰胺的含量为15-45 g/L, 4-二甲氨基吡啶的含量为0.5-

1.5 g/L, 乙二醇二缩水甘油醚的含量为40-100 mL/L。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的透析袋的截留分子量为3500，透析时间为72h以上。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述有机溶剂为六氟异丙醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）得到的电纺溶液对应的聚己内酯含量为6-15（w/v）%，三嗪化丝素蛋白的含量为小于等于6（w/v）%。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的高压静电纺丝的参数设置为：针头内径0.2-2 mm，推注流速0.1-0.4 mm/min, 电压10-20 kV, 接收距离10-20 cm，空气相对湿度40-60%，电纺时间2-6 h。

7.权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架。

8.权利要求7所述的三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架在制备生物医用材料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的生物医用材料是伤口敷料。

说明书

一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架及其制备方

法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医用材料和高分子化学的交叉领域，更具体地，涉及一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 皮肤组织容易受到热力、锐器、药物和辐射等各种外界致伤因素的破坏，进而促使患者表现出水、蛋白质和电解质流失以及感染化脓等临床症状。伤口敷料如纱布有助于防止二次伤害，减轻伤口污染，促进组织再生，因而在临床上得到广泛的应用。随着现代生物医学工程技术的发展，大量先进材料如水凝胶、纳米纤维支架、多孔海绵和3D打印支架等被逐步开发并应用于皮肤再生领域。在上述的材料中，纳米纤维膜具有其优异的性能，如良好的力学强度、吸水保湿性和透气性。此外，纳米纤维膜还具有与细胞外基质相似的3D网络结构，能够促进细胞增殖、迁移和营养物质的转运。高压静电纺丝是制备纳米纤维支架最成熟的技术之一，其设备简易，适合加工多种合成高分子和天然高分子材料。

[0003] 聚己内酯(PCL)是最常用于制备电纺纳米纤维支架的合成高分子物质。聚己内酯拥有优良的力学性能和生物可降解性、低免疫原性，因而在伤口敷料、医用缝合线、药物释放载体和体内可移植物等领域得到广泛的应用。然而，聚己内酯是一种疏水性的生物惰性材料，其表面缺乏细胞识别和结合的位点，细胞黏附能力较差。丝素蛋白是一种从蚕茧中提取得到的天然蛋白质。丝素蛋白分子链上含有丰富的羟基和氨基，可用于合成多种丝素蛋白衍生物。目前尚未见到有关高压静电纺丝法制备三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架的报道。

发明内容

[0004] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架及其制备方法与应用，该方法是以丝素蛋白和三聚氰胺为原料合成三嗪化丝素蛋白，然后与聚己内酯一起溶于有机溶剂，经高压静电纺丝后制备得到纳米纤维支架。

[0005] 本发明选用丝素蛋白和三聚氰胺为主要原料合成三嗪化丝素蛋白，有效解决了丝素蛋白水溶性太强，甲醇溶液固化时环境污染严重等问题，所获得的三嗪化丝素蛋白易溶于有机溶剂，与聚己内酯具有良好的相容性。选用三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯，通过调节三嗪化丝素蛋白的含量，可获得一系列具有不同力学强度、亲疏水性和生物活性的纳米纤维支架，进而满足不同应用的需求。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 第一方面，提供一种三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

[0008] (1)将丝素蛋白(SF)、三聚氰胺(MEL)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)溶解于磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)中，50-65℃条件下避光反应12-18h得到交联溶液；

[0009] (2)将步骤(1)得到的交联溶液转移至透析袋中，采用去离子水透析除去未反应的小分子单体，透析产物经冷冻干燥后得到三嗪化丝素蛋白(SF-MEL)；

[0010] (3)将聚己内酯(PCL)和步骤(2)得到的SF-MEL分别溶解在有机溶剂中，然后按照一定的比例混合均匀，离心脱气泡后得到电纺溶液；

[0011] (4)将步骤(3)得到的电纺溶液转移至静电纺丝机的推注泵中，经高压静电纺丝后得到纳米纤维支架。

[0012] 优选的，所述步骤(1)得到的交联溶液对应的SF的含量为20-40g/L，MEL 的含量为15-45g/L,DMAP的含量为0.5-1.5g/L,EGDE的含量为40-100mL/L。

[0013] 优选的，所述步骤(2)中，所述透析袋的截留分子量为3500，透析时间为 72h以上。

[0014] 优选的，所述步骤(3)中，所述有机溶剂为六氟异丙醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或多种。

[0015] 优选的，所述步骤(3)得到的电纺溶液对应的聚己内酯含量为6-15(w/v) ％，三嗪化丝素蛋白的含量为0-6(w/v)％。

[0016] 优选的，所述步骤(4)中，所述高压静电纺丝的参数设置为：针头内径 0.2-2mm，推注流速0.1-0.4mm/min,电压10-20kV,接收距离10-20cm，空气相对湿度40-60％，电纺时间2-6h。

[0017] 第二方面，本发明提供了利用上述制备方法制备得到的三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架。

[0018] 第三方面，本发明提供了上述三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架在制备生物医用材料中的应用，特别是伤口敷料领域。

[0019] 本发明所获得的三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架中，通过调节聚己内酯和三嗪化丝素蛋白的质量比可得到不同的力学强度和亲疏水性。

[0020] 体外细胞毒性实验和皮肤修复实验结果表明，本发明三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架具有良好的细胞相容性和促进伤口愈合的效果。因此，本发明在生物医用材料领域，特别是伤口敷料领域具有一定的应用潜力。

[0021] 本发明具有如下优点和有益效果：(1)在天然丝素蛋白的侧链基团如羟基 (-OH)和氨基(-NH2)上成功接枝三聚氰胺，人工合成了一种新型丝素蛋白衍生物；(2)首次采用三嗪化丝素蛋白对聚己内酯进行改性，使聚己内酯材料的亲水性、生物相容性和生物活性得到增强；(3)采用高压静电纺丝法制备纳米纤维支架，该支架材料具有与细胞外基质相似的3D网络结构，在生物医用材料领域具有广阔的应用前景；(4)通过优化高压静电纺丝机的参数设置，使得纺丝过程稳定性强，重复性好，适合工业化生产。

附图说明

[0022] 图1是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架扫描电子显微镜观察的结果，标尺为2微米。

[0023] 图2是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架拉伸测试的结果。

[0024] 图3是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架水接触角测试的结果。

[0025] 图4是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架体外细胞毒性实验的结果。

[0026] 图5是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架皮肤修复实验的结果。

具体实施方式

[0027] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

[0028] 对比例1

[0029] 将12g聚己内酯溶解于100mL六氟异丙醇中，3000rpm离心10min脱去气泡后转移至高压静电纺丝机的推注泵中。纺丝机参数设置为：推注流速0.2 mm/min,电压15kV,接收距离13cm，纺丝时间180min。电纺结束后将所获得的纳米纤维支架从接收板上揭除，置于真空干燥箱中干燥12h，即可得到纯的聚己内酯纳米纤维支架。

[0030] 实施例1

[0031] 将3g丝素蛋白、2g三聚氰胺、0.1g 4-二甲氨基吡啶和6mL乙二醇二缩水甘油醚加入到100mL磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)中，在60℃条件下避光反应12h得到交联溶液，然后转移至截留分子量为3500的透析袋中，采用去离子水透析72h 以上，透析产物经冷冻干燥后得到三嗪化丝素蛋白。

[0032] 将12g聚己内酯和6g三嗪化丝素蛋白分别溶解于100mL六氟异丙醇中,得到聚己内酯溶液和三嗪化丝素蛋白溶液。将上述两种溶液按照质量比(聚己内酯：三嗪化丝素蛋白)为9:1，8:2，7:3的比例混合均匀，3000rpm离心10min脱去气泡后转移至高压静电纺丝机的推注泵中。高压静电纺丝机(M01-PR)由四川致研科技有限公司提供，其参数设置为：针头内径1mm,推注流速0.2mm/min, 电压15kV,接收距离13cm，空气相对湿度50％，纺丝时间180min。电纺结束后将所获得的纳米纤维支架从接收板上揭除，置于真空干燥箱中干燥
12h，即可得到不同组分的三嗪化丝素蛋白改性聚己内酯纳米纤维支架。PSNF-0， PSNF-10,PSNF-20,PSNF-30分别代表纳米纤维支架中三嗪化丝素蛋白的最终质量分数分别为0％、
10％、20％和30％。PSNF-0即对应对比例1的产物。

[0033] 实施例2

[0034] 将对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架粘贴于样本台上，采用离子溅射机喷金后再用扫描电子显微镜观察其表面形貌。

[0035] 图1是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架扫描电子纤维镜观察的结果。如图所见，经高压静电纺丝后，各组支架的微观形貌均呈现出相互交织的3D 网络结构，与机体细胞外基质具有一定的相似性，有利于促进组织细胞的黏附和增殖。图中纤维支架未观察到明显的聚集或缠结，表明本发明所采用的制备参数较为可靠。

[0036] 实施例3

[0037] 将对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架裁剪成长为10cm,宽为1cm 的长条。采用万能材料试验机检测纳米纤维的拉伸强度，拉伸速率为6mm/min。

[0038] 图2是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架拉力测试的结果。如图所见，PSNF-0,PSNF-10,PSNF-20,PSNF-30的拉伸强度分别为0.61±0.04MPa, 2.32±0.39MPa，6.75±0.49MPa和0.52±0.07MPa，表明本发明纳米纤维支架具有良好的力学性能。随着三嗪化丝素蛋白含量的增加，纳米纤维支架的拉伸强度逐渐下降，断裂伸长率逐渐延长，其差异具有统计学意义(P<0.05)。

[0039] 实施例4

[0040] 将对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架置于真空干燥箱中干燥24h, 然后剪成1cm×1cm大小的样品粘贴于样品台上。采用水接触角测量仪检测纳米纤维支架表面的亲疏水性。

[0041] 图3是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架水接触角检测实验的结果。如图3 所示，PSNF-0,PSNF-10,PSNF-20,PSNF-30的水接触角分别为123.0±

[0042] 1.4°，52.7±1.3°，48.3±1.7°，41.3±1.2°。三嗪化丝素蛋白的加入大幅度提升了纳米纤维支架的亲水性。

[0043] 实施例5

[0044] 将对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架烘干后剪成粉末，经辐照灭菌后浸泡在RPMI1640完全培养基中。每0.05g粉末加1mL培养基，72h后过滤得到浸提液。采用体外细胞毒性实验检测纳米纤维支架的细胞相容性。将小鼠成纤维细胞(L929)接种于96孔板中，接种密度为1×103细胞/孔。常规培养24h后弃去培养基，加入200μL浸提液，继续培养24，48和72h.用RPMI1640完全培养基培养L929作为阴性对照，空白培养板作为空白对照。向每孔中加入20μL噻唑蓝试剂。继续培养4小时后，将培养板内的液体全部弃去，每孔加入150μL 二甲亚砜，采用多功能酶标仪检测其在490nm波长处的吸光度。

[0045] 图4是对比例1和实施例1所获得的纳米纤维支架体外细胞毒性实验的结果。如图所见,对照组的细胞增殖率设定为100％，与对照组相比，PSNF-0， PSNF-10,PSNF-20,PSNF-30的细胞增殖率在第1-3天均明显大于80％，符合医用材料生物相容性能的一般要求。

[0046] 实施例6

[0047] 将实施例1所获得的纳米纤维支架PSNF-20裁剪成直径为13.5mm的圆片，并应用于大鼠全层皮肤损伤的修复。成年雌性大鼠(180-200g)经腹腔麻醉后用手术器械在其背部切除直径为13.8mm的皮肤，创面应深至深筋膜。实验组将 PSNF-20用生理盐水润湿，立即敷贴于创面上，并用缝合线固定。阳性对照组采用医用纱布覆盖创面，阴性对照组不做任何处理。在不同的时间点拍摄大鼠创面的照片，经过统计分析后得到大鼠皮损修复的愈合曲线。

[0048] 图5是实施例1所获得的纳米纤维支架皮肤修复实验的结果。如图所见，大鼠损伤皮肤在12天内基本愈合。愈合过程中无明显血肿、坏死、感染等现象发生。经PSNF-20处理的伤口较空白组和纱布组的伤口愈合更快。在第6天， PSNF-20的愈合率为65.1±4.8％，而阴性对照组和阳性对照组的愈合率分别 53.2±7.9％和59.9±5.1％。PSNF-20具有较好的促进伤口愈合的作用。

[0049] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。