单一激发双发射的碳基生物质量子点及其制备方法和应用

摘要

本发明提供单一激发双发射碳基生物质量子点及其制备方法和应用。制备方法包括步骤：S1：称取适量干净的小白菜叶，于器皿中研磨碎；S2：加入按1:0.9至1:1.1的体积比例混合的无水乙醇和丙酮溶液后混合均匀进行浸泡；S3：浸泡28～32min后过滤得到叶绿素提取液；S4：按每25mL叶绿素提取液和0.1～0.11g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，控制温度在195～205℃下搅拌加热9‑11h；S5：冷却至室温后抽滤，滤液调节至pH≈7；S6：转移滤液至透析袋中避光透析11～13h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点。碳基生物质量子点能直接作为探针用于细胞中活性物质辅酶A的比率荧光成像，可消除生物组织的背景荧光干扰，提高辅酶A荧光成像的准确度和灵敏度。

权利要求

1.一种单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，包括如下步骤:S1：称取适量干净的小白菜叶，于器皿中研磨碎；

S2：按1:0.9至1:1.1的体积比例加入无水乙醇和丙酮液后混合均匀进行浸泡；

S3：浸泡28～32min后过滤得到叶绿素提取液；

S4：按每25mL的叶绿素提取液和0.1～0.11g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，于电加热套中控制温度在195～205℃下搅拌加热9-11h；

S5：冷却至室温后抽滤，将滤液调节至pH≈7；

S6：转移滤液至透析袋中避光透析11～13h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点。

2.如权利要求1所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤S1中的所述器皿为研钵，且小白菜叶在置于研钵中前剪碎。

3.如权利要求1所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤S2中加入的无水乙醇和丙酮液按1:1的比例。

4.如权利要求1所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤S3中采用纱布过滤。

5.如权利要求1所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，其特征在于所述步骤进一步具体化如下：S1：称取约10g干净的小白菜叶，剪碎后置于研钵中研磨碎；

S2：加入约15mL的无水乙醇和约15mL的丙酮液后混合均匀进行浸泡；

S3：浸泡提30min后过滤得到叶绿素提取液；

S4：取约25mL的叶绿素提取液和约0.104g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，于电加热套中控制温度在约200℃下搅拌加热约10h；

S5：冷却至室温后抽滤，将滤液调节至pH≈7；

S6：转移滤液至透析袋中避光透析12h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点。

6.一种单一激发双发射的碳基生物质量子点，其特征在于其是按权利要求1-5任一所述单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法获得的碳基生物质量子点。

7.单一激发双发射的碳基生物质量子点在检测辅酶A的应用，其特征在于包括如下过程：S10：将A体积量的浓度为390～410μg/mL的如权利要求6所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点、与A体积量的浓度为90～110μmol/L的Cu2+和终浓度为0～80μmol/L的不同体积浓度为90～110μmol/L的辅酶A溶液转移至离心管中；

S11:用pH为5.6～6的Tris-HCl缓冲溶液定容至总体积为9A～11A，振荡反应25～35min后，于荧光分光光度计上进行测量；

S12：以413nm为激发波长测定488nm和678nm波长处的荧光强度，并计算678nm与488nm处荧光强度的比值I678/I488。

8.如权利要求7所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点在检测辅酶A的应用，其特征在于所述过程进一步具体化如下：S10：将20μL浓度为400μg/mL的根据权利要求1-5任一所述单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法获得的碳基生物质量子点、20μL浓度为100μmol/L的Cu2+和终浓度为0～80μmol/L的不同体积浓度为100μmol/L的辅酶A溶液转移至500μL的离心管中；

S11:用pH＝5.8的Tris-HCl缓冲溶液定容至总体积200μL，振荡反应30min后，于荧光分光光度计上进行测量。

说明书

单一激发双发射的碳基生物质量子点及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及到辅酶A的检测技术，具体为单一激发双发射的碳基生物质量子点及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 辅酶A(coenzyme A，CoA)是生物体内重要的辅酶,是普遍存在的必不可少的辅助因子，因其在神经变性、蛋白乙酰化、细胞自噬和信号转导方面的作用受到广泛关注。CoA直接或间接参与促进细胞内100多种化学反应，对糖、脂肪、氨基酸的代谢起着重要的作用。已有研究发现体内缺乏CoA会影响脂肪酸的分解代谢，影响三酰甘油的清除，从而推测这可能是产生Ⅱb和Ⅳ型高脂血症的原因之一。因此，测定体内特别是细胞内CoA的含量，对于生命科学、生物医学研究和疾病诊断具有非常重要的意义。目前CoA的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)、比色分析法、荧光分析法和酶分析法等。这些方法作为技术平台，促进了CoA的生物医学功能研究，但是，要实现细胞内CoA的准确定量，仍然是一种挑战。因此，发展简单和可直接用于细胞内CoA准确定量的方法，是目前CoA研究中非常期待的技术平台。

[0003] 生物影像信息是生命科学研究中最重要、最直接的研究证据之一。它有助于科研人员更方便、更有效地认识生命的本质，探求疾病的发生和发展机理，从而实现对疾病的早期预警，提高治疗效果。传统的单发射荧光增强型成像方式，荧光信号为单一波长发射,易受到探针浓度、环境和仪器设备本身的稳定性等因素的影响[13]。最近,比率荧光成像技术已引起人们的高度关注，活细胞中Fe(II)、谷胱甘肽、过氧亚硝基阴离子(OONO-)、microRNA和次氯酸(HOCl)的比率型荧光成像方法,连续报道。比率荧光成像具有双波长发射特征,其两个波长荧光强度比值的变化与探测物的浓度存在定量关系,具有自我校正能力,可降低甚至消除非目标因素的影响，且受环境因素影响小、响应范围宽、准确度高。但是,应用于活体组织和细胞中生物活性物质的比率荧光成像时，采用的荧光探针必须具备双发射特征，且响应波长应位于近红外区域内，生物组织的背景荧光干扰大，影响辅酶A荧光成像的准确度和灵敏度。

[0004] 碳量子点(CDs)具有荧光性强、水溶性好、稳定性高、细胞毒性低、生物相容性好、激发依赖、易于修饰等特性，近年来受到了人们的广泛关注。许多新型CDs相继开发，并应用于生物传感、生物成像、光催化、光电转换、药物载送等领域。但是，至今已报道的CDs均为单一发射且发射波长小于600nm的CDs，这些CDs不能直接作为探针用于细胞中活性物质的比率荧光成像。

发明内容

[0005] 本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题，而提供一种发射波长大于600nm的单一激发双发射碳基生物质量子点的制备方法和应用，且所提供的碳基生物质量子点能直接作为探针用于细胞中活性物质辅酶A的比率荧光成像，可以减少甚至消除生物组织的背景荧光干扰，大大提高了辅酶A荧光成像的准确度和灵敏度。

[0006] 本发明第一方面提供的单一激发双发射碳基生物质量子点的制备方法，包括如下步骤：

[0007] S1：称取适量干净的小白菜叶，于器皿中研磨碎；

[0008] S2：按1:0.9至1:1.1的体积比例加入无水乙醇和丙酮液后混合均匀进行浸泡；

[0009] S3：浸泡28～32min后过滤得到叶绿素提取液；

[0010] S4：按每25mL的叶绿素提取液和0.1～0.108g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，于电加热套中控制温度在195～205℃下搅拌加热9-11h；

[0011] S5：冷却至室温后抽滤，将滤液调节至pH≈7；

[0012] S6：转移滤液至透析袋中避光透析11～13h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点。

[0013] 进一步的，所述步骤S1中的所述器皿为研钵，且小白菜叶在置于研钵中前剪碎。

[0014] 进一步的，所述步骤S2中加入的无水乙醇和丙酮液按1:1的比例。

[0015] 进一步的，所述步骤S3中采用纱布过滤。

[0016] 进一步的，单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，所述步骤进一步具体化如下：

[0017] S1：称取约10g干净的小白菜，剪碎后置于研钵中研磨碎；

[0018] S2：加入约15mL的无水乙醇和约15mL的丙酮液后混合均匀进行浸泡；

[0019] S3：浸泡提30min后过滤得到叶绿素提取液；

[0020] S4：取约25mL的叶绿素提取液和约0.104g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，于电加热套中控制温度在约200℃下搅拌加热约10h；

[0021] S5：冷却至室温后抽滤，将滤液调节至pH≈7；

[0022] S6：转移滤液至透析袋中避光透析12h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点。

[0023] 本发明第二方面还提供一种单一激发双发射的碳基生物质量子点，其是按以上所述单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法获得的碳基生物质量子点。

[0024] 本发明第三方面还提供一种单一激发双发射的碳基生物质量子点在检测辅酶A的应用，其应用包括如下过程：

[0025] S10：将A体积量的浓度为390～410μg/mL的如上所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点、与A体积量的浓度为90～110μmol/L的Cu2+和终浓度为0～80μmol/L的不同体积浓度为90～110μmol/L的辅酶A溶液转移至离心管中；

[0026] S11:用pH为5.6～6的Tris-HCl缓冲溶液定容至总体积为9A～11A，振荡反应25～35min后，于荧光分光光度计上进行测量；

[0027] S12：以413nm为激发波长测定488nm和678nm处的荧光强度，并计算678nm与488nm处荧光强度的比值I678/I488。

[0028] 进一步的，其应用过程进一步具体化如下：

[0029] S10：将20μL浓度为400μg/mL的根据以上所述单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法获得的碳基生物质量子点、20μL浓度为100μmol/L的Cu2+和终浓度为0～80μmol/L的不同体积浓度为100μmol/L的辅酶A溶液转移至500μL的离心管中；

[0030] S11:用pH＝5.8的Tris-HCl缓冲溶液定容至总体积200μL，振荡反应30min后，于荧光分光光度计上进行测量。

[0031] 通过本发明提供的方法获得的碳基生物质量子点源于天然生物质，细胞毒性小，可用于活细胞和活体中辅酶A的成像，表面含有丰富的亲水性基团，也即具有良好的生物相容性。同时碳基生物质量子点具有良好的抗光漂白性，有利于在细胞成像的应用。采用比率荧光成像方式，可有效消除外界环境变化和仪器本身不稳定等因素的影响。同时，以近红外的678nm发射峰作为识别信号，可有效避免生物体内的背景干扰，使成像信号更准确、更可靠。

[0032] 本发明的好处和应用效果将在以下实施例中进一步阐述。

附图说明

[0033] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0034] 图1为本发明的富含叶绿素的近红外天然生物质量子点的制备方法和生物质量子点-铜纳米复合物的制备过程整体流程示意图；

[0035] 图2为本发明方法过程中加热时温度的影响光谱特征对比图；

[0036] 图3为本发明方法过程中在15mL的无水乙醇和15mL的丙酮混合液体的情况下加热时间的影响光谱特征对比图；

[0037] 图4为本发明方法过程中在15mL的无水乙醇和15mL的丙酮混合液体的情况下加入不同聚氧乙烯二胺用量的影响光谱特征对比图；

[0038] 图5为本发明方法过程中在15mL的无水乙醇和15mL的丙酮混合液体的情况下使用不同小白菜用量的影响光谱特征对比图；

[0039] 图6为采用TEM成像考察合成BQDs的形貌、晶格图；

[0040] 图7为采用TEM成像考察合成BQDs的粒径分布图；

[0041] 图8为BQDs的XRD图；

[0042] 图9为用傅利叶转换红外光谱仪对BQDs表面的基团进行FTIR表征图；

[0043] 图10为BQDs的XPS图；

[0044] 图11为C1S高分辨XPS图；

[0045] 图12为N1s高分辨XPS图；

[0046] 图13为O1S高分辨XPS图；

[0047] 图14为BQDs的紫外吸收光谱图和荧光激发、发射光谱图；

[0048] 图15为不同激发波长下BQDs的荧光发射光谱图；

[0049] 图16为413nm激发波长下BQDs绝对量子产率图；

[0050] 图17为单一激发双发射BQDs的荧光寿命曲线图；

[0051] 图18为不同pH值对BQDs荧光强度的影响关系图；

[0052] 图19为365nm紫外灯照射时间下BQDs荧光强度变化图；

[0053] 图20为Cu2+猝灭BQDs荧光光谱图；

[0054] 图21为Cu2+浓度与BQDs I678/I488的线性关系图；

[0055] 图22为不同金属离子对BQDs荧光强度的影响(n＝3)对比图；

[0056] 图23为BQDs单独存在和加入10μmol/L、20μmol/L的Cu2+时的荧光光谱图；

[0057] 图24为BQDs、BQDs-Cu2+、BQDs-Cu2+-CoA体系的荧光光谱图；

[0058] 图25为比率荧光检测CoA的荧光光谱图；

[0059] 图26为CoA浓度与I678/I488的线性关系图；

[0060] 图27为pH 7.4时，生物分子、氨基酸、无机盐负离子对荧光强度的影响(1.CoA、2.抗坏血酸、3.尿酸、4.葡萄糖、5.蔗糖、6.赖氨酸、7.色氨酸、8.高半胱氨酸、9.半胱氨酸、10.谷胱甘肽、11.氯离子、12.硫酸根离子、13.碳酸根离子)；

[0061] 图28为pH 5.8时，生物分子、氨基酸、无机盐负离子对荧光强度的影响(1.CoA、2.抗坏血酸、3.尿酸、4.葡萄糖、5.蔗糖、6.赖氨酸、7.色氨酸、8.高半胱氨酸、9.半胱氨酸、10.谷胱甘肽、11.氯离子、12.硫酸根离子、13.碳酸根离子)；

[0062] 图29为不同浓度BQDs与T24细胞共同孵育24h后的相对细胞存活率比较图；

[0063] 图30为T24细胞与BQDs孵育10h后的CLSM成像图；

[0064] 图31为T24细胞与BQDs孵育10h，加入10μmol/L的Cu2+继续孵育4h后的CLSM成像图；

[0065] 图32为T24细胞与BQDs孵育10h，加入10μmol/L的Cu2+继续孵孵育4h后，再用含有30μmol/L CoA的pH 5.8的Tris-HCl缓冲溶液孵育4h后的CLSM成像图；

[0066] 图33为T24细胞与CDs孵育10h，加入10μmol/L Cu2+继续孵育4h后，再加入不同浓度的CoA，并用pH 5.8的Tris-HCl缓冲溶液孵育4h后的CLSM成像图。激发波长405nm，收集细胞在蓝色通道(450—550nm)和红色通道(640—740nm)的荧光成像图；

[0067] 图34为在不同CoA浓度条件下，蓝光和红光通道内细胞荧光强度的变化图；

[0068] 图35为红光和蓝光通道内细胞荧光强度的比值与加入细胞内CoA浓度的线性关系图。

具体实施方式

[0069] 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

[0070] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

[0071] 下面对本发明实施例作进一步的描述。

[0072] 一种单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，大致过程如图1所示，具体包括如下步骤：

[0073] S1：称取适量干净的小白菜叶，于器皿中研磨碎；

[0074] S2：按1:0.9至1:1.1的体积比例加入无水乙醇和丙酮液后混合均匀进行浸泡；

[0075] S3：浸泡28～32min后过滤得到叶绿素提取液；

[0076] S4：按每25mL的叶绿素提取液和0.1～0.108g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，于电加热套中控制温度在195～205℃下搅拌加热9-11h；

[0077] S5：冷却至室温后抽滤，将滤液调节至pH≈7；

[0078] S6：转移滤液至透析袋中避光透析11～13h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点BQDs。

[0079] 通过以上方法获得的单一激发双发射的碳基生物质量子点BQDs具有源自天然生物质，原料容易生产，细胞毒性小，可用于活细胞和活体中CoA的成像，表面含有丰富的亲水性基团，也即具有良好的生物相容性。同时BQDs具有良好的抗光漂白性，有利于在细胞成像的应用。采用比率荧光成像方式，可有效消除外界环境变化和仪器本身不稳定等因素的影响。同时，以近红外的678nm发射峰作为识别信号，可有效避免生物体内的背景干扰，使成像信号更准确、更可靠。

[0080] 在具体实施例中，所述步骤S1中的所述器皿为研钵，且小白菜叶在置于研钵中前剪碎。

[0081] 在具体实施例中，所述步骤S2中加入的无水乙醇和丙酮液按1:1的比例。

[0082] 在具体实施例中，所述步骤S3中采用纱布过滤。

[0083] 进一步的，作为一种更加优化的实施例，单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法，所述步骤进一步具体化如下：

[0084] S1：称取约10g干净的小白菜叶，剪碎后置于研钵中研磨碎；

[0085] S2：加入约15mL的无水乙醇和约15mL的丙酮液后混合均匀进行浸泡；

[0086] S3：浸泡提30min后过滤得到叶绿素提取液；

[0087] S4：取约25mL的叶绿素提取液和约0.104g的聚氧乙烯二胺，加入聚四氟乙烯反应釜中，于电加热套中控制温度在约200℃下搅拌加热约10h；

[0088] S5：冷却至室温后抽滤，将滤液调节至pH≈7；

[0089] S6：转移滤液至透析袋中避光透析12h后得到单一激发双发射的碳基生物质量子点(BQDs)。

[0090] 通过以上优化工艺参数，使得制造出来的单一激发双发射的碳基生物质量子点BQDs各性能参数进一步得到改善。

[0091] 本发明第二方面还提供一种单一激发双发射的碳基生物质量子点，其是按以上所述单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法获得的BQDs。

[0092] 本发明第三方面还提供一种单一激发双发射的碳基生物质量子点在检测CoA的应用，其应用包括如下过程：

[0093] S10：将A体积量的浓度为390～410μg/mL的如权利要求6所述的单一激发双发射的碳基生物质量子点、与A体积量大约一样量的浓度为90～110μmol/L的Cu2+和终浓度为0～80μmol/L的不同体积浓度为90～110μmol/L的CoA溶液转移至离心管中；

[0094] S11:用pH为5.6～6的Tris-HCl缓冲溶液定容至总体积为9A～11A，振荡反应25～35min后，于荧光分光光度计上进行测量；

[0095] S12：以413nm为激发波长测定488nm和678nm处的荧光强度，并计算678nm与488nm处荧光强度的比值I678/I488。

[0096] 实施例中，其应用过程进一步具体化如下：

[0097] S10：将20μL浓度为400μg/mL的根据以上单一激发双发射的碳基生物质量子点的制备方法获得的BQDs、20μL浓度为100μmol/L的Cu2+和终浓度为0～80μmol/L的不同体积浓度为100μmol/L的CoA溶液转移至500μL的离心管中；

[0098] S11:用pH＝5.8的Tris-HCl缓冲溶液定容至总体积200μL，振荡反应30min后，于荧光分光光度计上进行测量。

[0099] 本发明的单一激发双发射的碳基生物质量子点BQDS表征效果通过以下实验检测和验证可以进一步表现出来，参照图2至图34进行详细说明。

[0100] 为完成实验验证本发明方法及获得的效果，首先进行主要仪器与试剂准备，具体如下：

[0101] 仪器部分：Cary 60型紫外可见-吸收光谱仪(Agilent Technologies，USA)用于紫外可见-吸收光谱的测定；Cary Eclipse型荧光发光光度计(Agilent Technologies，USA)用于荧光光谱的测定；傅利叶转换红外光谱仪(FTIR-Spectrum Two，Perkin-Elmer，USA)用于BQDs的表征；Philips Tecnai G2 F20 S-TWIN场发射透射电子显微镜(TEM，Philips，Netherlands)用于BQDs的形貌表征；ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱仪(XPS，Thermo Electron，USA)用于BQDs表面元素及形态表征；EL×800型酶标仪(Bio Tekinstruments，USA)用于细胞毒性测定；Zeiss LSM710共聚焦激光扫描显微镜系统(CLSM，Zeiss，Germany)用于细胞成像的测定。

[0102] 试剂部分：胎牛血清(FBS),phorbol-12,13-dibutyrate(PDBu),高糖培养基(DMEM),胰蛋白酶,100U/Penicilin-Streptomycin均购于美国Sigma公司；实验所用细胞株：T24(人膀胱癌细胞)细胞株,购于北京鼎国生物科技有限公司；透析袋(MWCO；1K Da，pore size:ca.1.0nm)购于上海生物工程(上海)股份有限公司；二甲基亚砜(DMSO),聚氧乙烯二胺(M.W：2000),3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),辅酶A钠盐水合物(CoA),谷胱甘肽,半胱氨酸,高半胱氨酸,抗坏血酸,尿酸、葡萄糖、蔗糖、D-色氨酸均购于Aladdin试剂公司；实验所用其它试剂均为国产分析纯，实验用水为18.2MΩcm的超纯水(Merck Millipore)。小白菜购自于本地蔬菜市场。

[0103] 其次再配制实验过程中使用的溶液，具体为溶液配制包括有：

[0104] PBS溶液(0.01mol/L)：分别称取4.0g NaCl，1.80g Na2HPO4·12H2O，0.14g KH2PO4和0.10g KCl溶解于450mL超纯水中，用稀磷酸或氢氧化钠溶液调节至实验所需pH值，并定容至500mL。

[0105] 培养基的配制：在无菌操作台里，往500mL的DMEM高糖培养基中加入50mL的胎牛血清和5mL的青-链霉素合剂，混合均匀，备用。

[0106] 细胞用PBS溶液的配制：将购买的PBS磷酸盐缓冲盐试剂包，用超纯水溶解于1000mL的广口瓶中，在120℃高压湿热灭菌0.5h，并用封口膜封口，pH值约为7.4，在4℃下保存备用。

[0107] 细胞冻存液的配制：将二甲基亚砜和胎牛血清按体积比1:9混合，现配现用。

[0108] MTT溶液的配制：2.5g的MTT粉末溶解于10mL已经高压湿热灭菌的PBS磷酸盐缓冲溶液中，移至100mL容量瓶中并定容，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，并保存于-20℃备用。

[0109] 制备单一激发双发射的BQDs的过程中，通过实验测试了加热温度、加热时间、聚氧乙烯二胺用量和小白菜叶用量等制备条件对单一激发双发射荧光光谱的影响，如图2-5所示，可以知道在加热温度为200℃，加热时间为10h，聚氧乙烯二胺用量为0.1g，小白菜质量为10g时，能够得到最佳的单一激发双发射荧光光谱。

[0110] 实验中采用TEM成像考察了合成BQDs的形貌、晶格和粒径，结果如图6-7所示，表明BQDs的粒径在1-5nm范围内，分布均匀，大体也成正态分布，平均粒径约3nm，通过HRTEM成像得到BQDs的晶格为0.23nm，与石墨(101)晶面常数一致。为了进一步获得合成BQDs的晶面常数，我们使用XRD对其进行了表征，结果如图8所示，BQDs在22.5°有一个宽峰中心，表明该BQDs具有类石墨烯结构。用傅利叶转换红外光谱仪对BQDs表面的基团进行FTIR表征，结果如图9所示：BQDs在3434、2900、1634、1400、1081cm-1出现明显的特征吸收峰，分别为O-H/N-H、C-H、C＝O、C-N、C-O的振动吸收峰，说明该BQDs表面中含有较多的-OH、-NH2、-COOH等亲水性基团，同时也说明该BQDs的水溶性好。

[0111] 为进一步探讨该BQDs的成键情况和元素组成，采用XPS对其进行了表征，结果如图10所示，表明该BQDs主要由C、N、O三种元素组成，其含量分别为：C，81.5％；N，1.66％；O，
16.84％。图10-13分别为C1S、N1s、O1S的高分辨XPS图，从图中可以看出C1S在286.3eV、
288.6eV、284.5eV和285.0eV出现信号峰，其中286.3eV为碳元素sp3杂化C-O键；288.6eV为C＝O键；284.5eV峰为碳元素sp2杂化C＝C/C-C键；285.0eV为碳元素sp3杂化C-N键。N1S在
401.7eV和399.5eV出现信号峰，分别为-NH2或-NH的信号峰。O1S的高分辨XPS图可得出O的主要成键情况为C＝O(532.1eV)、C-O(533.0eV)。通过对XPS谱图进行分析，表明该BQDs表面含有丰富的亲水性基团，同时也说明合成的BQDs具有良好的水溶性。

[0112] BQDs的光学特性实验，BQDs的紫外(UV-Vis)吸收光谱和激发、发射的荧光光谱如图14，从图中可见，该BQDs在紫外区和可见光区有明显的紫外吸收，分别在314nm，415nm和675nm处有效的吸收峰；在314nm处的吸收是由于C＝O双键的n→π*电子跃迁；415nm处的有吸收峰是因为C＝C键的π→π*电子跃迁[42]；在675nm处有吸收峰是由于卟吩结构中C＝N键的n→π*。从BQDs的激发和发射荧光谱图可以看出，该BQDs的激发波长为413nm，发射波长为
488nm和678nm，即：合成的BOQs具有单一激发双发射的荧光光谱特性，可用于构建比率型荧光探针。不同激发波长下BQDs的发射光谱如图15所示，从图中可以看出，随着激发波长的增加488nm处的发射峰发生红移，具有激发依赖行为，而678nm处的发射峰位置不变、荧光强度逐渐降低。

[0113] 除此之外，使用413nm激发，测定了BQDs的绝对量子产率，图16所示，表明BQDs具有较高的量子产率，绝对量子产率为10.28％，说明该单一激发双发射的BQDs在生物领域具有很大的应用前景。同时，本实验还对BQDs的荧光寿命进行了测定，结果如图17所示，平均荧光寿命按照下列公式进行计算：

[0114] 式中，B1 B3为不同荧光物质的含量，为衰变寿命。通过计算，该单一激发双发射的BQDs在488nm发射峰的荧光寿命为6.82ns，在678nm发射峰的荧光寿命为4.32ns。

[0115] 下面通过实验考察BQDs的稳定性影响因素。

[0116] pH值对BQDs荧光强度比值的影响。BQDs的荧光强度在一定程度上受溶液酸碱度的影响，图18展示了不同pH值对其荧光强度比值(I678/I488)的影响，表明在pH4-11范围内，荧光强度的比值基本保持不变，说明pH对BQDs荧光强度比值的影响可忽略。

[0117] BQDs的光稳定性。使用365nm紫外灯照射BQDs溶液，在不同的照射时间下，测得BQDs的荧光强度如图19所示，从图中可以看出，在365nm紫外灯照射30min以内，BQDs在488nm、678nm发射峰的荧光强度基本不发生变化，表明该BQDs具有良好的抗光漂白性，有利于在细胞成像的应用。

[0118] 铜离子介导的比率荧光检测辅酶A。为了考察铜离子介导比率检测辅酶A的可行性，首先考察了铜离子对该BQDs的荧光猝灭情况，结果如图20所示，图中反映出，当加入不同浓度(单位为μmol/L)的Cu2+时，随着Cu2+浓度的增加，488nm发射峰的荧光强度基本不变，而678nm发射峰的荧光强度逐渐降低，表明该BQDs可用于比率荧光检测Cu2+。图21展示了当Cu2+浓度在0-2.0μmol/L时，BQDs和Cu2+浓度之间存在良好的线性关系，线性回归方程为Y＝-0.320X+1.436式中R2＝0.9971，X代表加入Cu2+的浓度；线性范围为0-2.0μmol/L。图22呈现了不同金属离子对该BQDs荧光强度的影响，从图中可见，除Cu2+和Hg2+之外，其它的金属离子对BQDs的荧光强度的影响基本可忽略不计。图23表明当加入Cu2+浓度超过10μmol/L，BQDs的荧光强度被猝灭到最低值，并且不随Cu2+浓度的进一步增加而降低。图24展示了铜离子介导比率检测辅酶A的可行性，从图中可见，在Cu-BQDs体系中加入CoA后，488nm发射峰的荧光强度基本不变，而678nm发射峰的荧光强度升高，表明Cu-BQDs体系可用于比率荧光检测CoA。

[0119] 为了考察铜离子介导比率荧光检测辅酶A方法的线性范围和检测限，实验在Cu-BQDs体系中分别加入不同浓度的CoA后，测量体系在488nm发射峰和678nm发射峰的荧光强度，并计算488nm发射峰和678nm发射峰的荧光强度比值(I678/I488)。图25表明:随着加入CoA浓度的增加，488nm发射峰的荧光强度基本不变，而在678nm处发射峰的荧光强度逐渐增加。图26表明，当CoA的浓度在0-75μmol/L时，CoA浓度与和体系的荧光强度比值(I678/I488)存在良好的线性关系，线性回归方程为Y＝0.0157C+0.232，式中R2＝0.9990，C代表CoA的浓度；误差棒来源于平行3次测定；检测限约为40nmol/L。

[0120] 了考察Cu-BQDs的传感体系比率检测CoA的特异性，实验选择了几种生物基体中常见的巯基氨基酸(谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸)和生物分子，包括抗坏血酸、葡萄糖、尿酸等共存物质，去研究它们的干扰情况，结果如图27,28所示。图27表明在pH＝7.4时，谷胱甘肽、半胱氨酸和高半胱氨酸具有较大干扰；但是，图28表明在pH＝5.8时，巯基氨基酸和其它生物分子对该比率荧光传感体系基本无影响，由此可见，该传感体系对CoA具有优良的选择性。

[0121] 为了探讨通过本发明方法制备的BQDs是否能够应用于活细胞中CoA的成像，实验使用T24细胞株，采用MTT方法测定了BQDs的细胞毒性。实验结果如图29所示，当加入BQDs的浓度高达250μg/mL时，细胞存活率仍高于90％，证明了该BQDs的细胞毒性低，可用于活细胞和活体中CoA的成像。

[0122] 为了考察使用BQDs作为纳米荧光探针，借助于Cu2+介导，是否能够实现活细胞内CoA的比率荧光成像，实验采用激光共聚焦显微成像技术，对其进行了研究。将T24细胞与BQDs孵育10h后，加入10μmol/L的Cu2+并继续孵育4h，然后用含有30μmol/L CoA的pH 5.8的Tris-HCl缓冲溶液孵育4h。在CLSM系统上对各种条件下孵育的细胞进行成像分析，激发波长设定为405nm，分别采集蓝色通道(450-550nm)和红色通道(640-740nm)的细胞成像。结果如图29-31所示，T24细胞与BQDs孵育10h后，在蓝光通道和红光通道中均可观察到细胞的蓝色和红色荧光成像，参见图30；当加入10μmol/L的Cu2+并继续孵育4h后，蓝光通道中细胞的荧光强度不变，而红光通道中细胞的荧光强度明显降低，参见图31；而用含有30μmol/L CoA的pH 5.8的Tris-HCl缓冲溶液继续孵育4h后，蓝光通道中细胞的荧光强度仍然保持不变，而红光通道中细胞的荧光强度得以恢复，参见图32。这些结果表明，使用BQDs作为纳米荧光探针，借助于Cu2+介导，能够实现活细胞内CoA的比率荧光成像。

[0123] 近红外比率荧光成像检测活细胞内的CoA。将T24细胞与BQDs孵育10h，弃去培养基，用PBS清洗3次，再用含有Cu2+(10μmol/L)的培养基孵育4h，弃去培养基，并用pH 5.8的Tris-HCl缓冲溶液清洗3遍，最后用含有不同浓度CoA的pH 5.8的Tris-HCl缓冲溶液孵育4h。在CLSM系统上对细胞进行成像分析。激发波长设定为405nm，分别采集蓝色通道(450-
550nm)和红色通道(640-740nm)的细胞成像和荧光强度，并计算红色通道与蓝色通道的荧光强度比值(I640-740/I450-550)。结果如图33、34所示，在405nm波长激发下，蓝光通道(450—550nm)的荧光强度随CoA浓度的增加不发生改变，红光通道(640—740nm)的荧光强度随CoA浓度的增加而增强；以红色通道荧光强度值与蓝色通道荧光强度的比值(I640-
740/I450-550)对CoA浓度作图，得到工作曲线如图35所示，该工作曲线数据的线性回归方程为Y＝0.01646X+0.1209(R2＝0.9835；式中Y代表I640-740/I450-550，X代表CoA的浓度)，相关系数大于0.9，可用于活细胞内CoA的定量。基于此工作曲线，采用外推作图法，定量测定得到细胞中辅酶A的浓度为5.0μmol/L。

[0124] 以上实施例中，通过以小白菜为原料，将溶剂提取叶绿素和溶剂热法相结合，合成制备得到了具有单一激发双发射及近红外识别的BQDs，并基于得到的BQDs构建了铜离子介导的比率荧光纳米探针(Cu-BQDs)，应用于活细胞内辅酶A的近红外比率荧光成像分析。该纳米探针来源于天然生物质，细胞毒性小，具有优良的生物相容性。以488nm发射峰作为参比信号，678nm发射峰作为识别信号，采用比率荧光成像方式，可有效消除外界环境变化和仪器本身不稳定等因素的影响。同时，以近红外的678nm发射峰作为识别信号，可有效避免生物体内的背景干扰，使成像信号更准确、更可靠。该探针的开发为CoA的生物医学功能研究，提供了新的技术平台。

[0125] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的创造性精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。