一类带对硝基酚显色团的氨基酸、制备方法及应用

摘要

一类带对硝基酚显色团氨基酸、制备方法及应用，结构带对硝基酚显色团的氨基酸，含对硝基苯酚或4‑硝基‑1‑萘酚显色团、脂肪族伯胺、脂肪族羧基；所述氨基酸，通过饱和碳原子连接到显色团；当所述显色团为对硝基苯酚时，氨基酸连在酚羟基的邻位或间位；当所述显色团为4‑硝基‑1‑萘酚时，氨基酸连在另一个不含对硝基酚芳香环的α或β位；所述氨基酸，含有至少一个伯氨基和一个羧基，还含有另一个用于与显色团上饱和碳原子相连、来自硫醇的硫原子或脂肪族伯胺的N原子；所述氨基酸，具体包括半胱氨酸、赖氨酸、瓜氨酸类天然氨基酸，及不含芳香环、分子量不超过300 Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子的非天然氨基酸。所述氨基酸用于测定微纳米材料表面能与小分子显色探针共价反应活泼基团量、可逆结合活性分子量。

权利要求

1.一类带对硝基酚显色团的氨基酸，其结构如下：

2.如权利要求1所述一类带对硝基酚显色团的氨基酸的制备方法，特征如下：

(1)用4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物，与丁二酸酐或戊二酸酐通过傅氏酰基化反应获得对应的芳香酮酸；用NaBH4将与芳香环相连羰基选择性还原为饱和醇羟基，再将该羟基转变成溴代烃或对甲苯磺酸酯，然后与巯基乙胺、半胱氨酸反应，得到带对硝基酚显色团的氨基酸；

(2)用任一个位置含羟甲基的4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物，直接将羟甲基转变成对应的溴代烃或对甲苯磺酸酯，然后与半胱氨酸反应，得到所述带对硝基酚显色团的氨基酸。

3.如权利要求1所述一类带对硝基酚显色团的氨基酸的应用，特征如下：

所述带对硝基酚显色团的氨基酸作为小分子显色探针，用于测定微纳米材料表面能与小分子显色探针共价反应活泼基团量、可逆结合活性分子量；应用时，先以过量小分子显色探针与含有对应活泼基团、活性分子的微纳米材料反应，分离去微纳米材料及所结合小分子显色探针，将上清液调pH>8.0，测定剩余显色探针中对硝基苯酚显色团在390～420nm间某波长下吸收、4-硝基-1-萘酚显色团在430～490nm间某波长下吸收，推算结合显色探针量，按所用小分子显色探针与微纳米材料表面活泼基团、活性分子反应的摩尔比，换算成微纳米材料表面的活泼基团、活性分子量。

4.如权利要求3所述一类带对硝基酚显色团的氨基酸的应用，特征如下：

所述带对硝基酚显色团的氨基酸作为小分子显色探针，通过与其脂肪族伯胺反应，测定微纳米材料表面羧基活泼酯、对甲苯磺酸酯。

5.如权利要求3所述一类带对硝基酚显色团的氨基酸的应用，特征如下：

其中，将所述带对硝基酚显色团的氨基酸，与生物素活泼酯反应生成生物素酰胺，作为光度法测定固定化链亲和素量的小分子显色探针，用于测定链亲和素磁珠上固定化链亲和素含量。

6.如权利要求3所述一类带对硝基酚显色团的氨基酸的应用，特征如下：

所述带对硝基酚显色团的氨基酸，与巯基被乙酰基保护的巯基乙酸活泼酯反应，脱乙酰基保护得含脂肪族硫醇的显色探针，用于测定微纳米材料表面可与巯基反应的活泼基团的含量。

7.如权利要求6所述一类带对硝基酚显色团的氨基酸的应用，与巯基反应活泼基团，是卤代乙酰胺基、环氧基、卤代苄基、醛基。

说明书

一类带对硝基酚显色团的氨基酸、制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及定量测定微纳米材料表面高反应活泼基团、生物活性分子的含量所需显色探针、制备及其应用，是对应微纳米材料产品质量控制及指导制备工艺优化的关键技术。

背景技术

[0002] 不溶微纳米材料表面的活泼基团，包括羟基、氨基、羧基、醛基、对甲苯磺酸酯等活性基团，其可用含量决定对应微纳米材料的应用性能，其可用含量的测定目前在全世界都是一个难题。现有方法测定此类基团过程繁琐，精度低，尤其现在可用探针多数为荧光探针，其测量灵敏度高但探针稳定性低，用于对此类微纳米材料作为生物技术产品的质量控制显然不适合。例如，表面带羧基的微米磁珠是重要的生物技术产品，但其表面羧基含量的测定很难，尤其对其产品质控一直是技术难题。

[0003] 生物素-链亲和素是目前应用最广的工具试剂系统。微纳米材料和链亲和素的加合物，如链亲和素磁珠，是重要的生物材料和生物技术产品。此类生物技术产品表面所含活性链亲和素的含量，决定其应用性能及应用价值，但固定化链亲和素活性蛋白含量测定也一直是技术难题。已报道连接酶、荧光团、发光基团的生物素衍生物为固定化链亲和素的测定探针，但其用于测量过程耗时，尤其所用探针稳定性差，对固定化链亲和素作为生物技术产品的生产质量控制不适合。

[0004] 显色探针浓度易于据其消光系数和吸收进行标定并定量，尤其此类显色探针稳定性好，在避光条件下能长期保存；将显色基团衍生成对应的水溶性可反应探针、能与固定化蛋白等结合的可逆探针，适合用于链亲和素磁珠等生物技术产品的质量控制。设计所需小分子显色探针，并转变成生物素衍生物用于测定固定化链亲和素活性蛋白量，是本发明创新点的具体化和解决问题创造性所在。这类显色探针的测量灵敏度低于荧光探针及酶标记探针，但稳定性好，适合固定化链亲和素产品质量控制。

[0005] 微纳米材料应用时主要在水性缓冲液体系。所以，所用质控显色探针必须要求水溶性；本发明用羧基或磺酸增溶。为尽可能提高测量灵敏度，显色探针中的显色团的消光系数应尽量高；此类显色团要易于连接所需的反应活性基团、所需配体。综合考虑，本发明选用对硝基苯酚、4-硝基-1-萘酚为所需显色团，其稳定性好，并易于衍生化成水溶性较好的氨基酸，而此类氨基酸中的氨基具有高反应活性，适合连接生物素类配体或与微纳米材料表面的活泼酯反应。本发明所述对应显色探针的制备方法为基本思路，用其他类似方法也能获得相同的显色团及可反应基团；在应用中，对应的显色团也可衍生成带有其他配体、官能团的显色探针，基于显色测定重现性优势对微纳米材料进行质控。

[0006] 所以，本发明提出作为显色探针的带对硝基酚显色团的氨基酸结构特征、制备路线、应用特征。

发明内容

[0007] 作为制备所述显色探针所需的一类带对硝基酚显色团的氨基酸，其结构特征如下：

[0008] 带对硝基酚显色团的氨基酸，含对硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚显色团、脂肪族伯胺、脂肪族羧基；

[0009] 进一步，所述氨基酸通过饱和碳原子连接到显色团；显色团为对硝基苯酚时，氨基酸连在酚羟基的邻位或间位；显色团为4-硝基-1-萘酚时，氨基酸连在另一个不含对硝基酚芳香环的α或β位；

[0010] 进一步，所述氨基酸，含有至少一个伯氨基和一个羧基，还含有另一个用于与显色团上饱和碳原子相连、来自硫醇的硫原子或脂肪族伯胺的N原子；所述氨基酸，具体包括半胱氨酸、赖氨酸、瓜氨酸类天然氨基酸，及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子的非天然氨基酸；

[0011] 进一步，所述带对硝基酚显色团的氨基酸，代表结构如下；其中，1a到1f系列含4-硝基-1-萘酚显色团，2a到2f系列含4-硝基苯酚显色团。

[0012]

[0013] 一类带对硝基酚显色团的氨基酸，其制备特征如下：

[0014] 用4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物，与丁二酸酐、戊二酸酐通过傅氏酰基化反应获得对应的芳香酮酸；用NaBH4或类似物选择性将与芳香环相连羰基还原为饱和醇，再将醇羟基转变成溴代烃或生成对甲苯磺酸酯，然后与巯基乙胺、半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸类天然氨基酸，及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子酸的非天然氨基酸反应，得到所述带显色团的氨基酸；

[0015] 进一步，用任一个位置含羟甲基的4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物，直接将羟甲基转变成对应的溴代烃、对甲苯磺酸酯，然后与半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸类天然氨基酸，及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子酸的非天然氨基酸反应，得到所述带显色团的氨基酸。

[0016] 一类带对硝基酚显色团的氨基酸，直接或间接作为显色探针，应用特征在于：

[0017] 所述带对硝基酚显色团的氨基酸或其衍生物作为小分子显色探针，用于测定微纳米材料表面能与小分子显色探针共价反应活泼基团量、可逆结合活性分子量；应用时，先以过量小分子显色探针与含有对应活泼基团、活性分子的微纳米材料在最适条件下反应，分离去微纳米材料及所结合小分子显色探针，将上清液调pH>8.0，测定剩余显色探针中对硝基苯酚显色团在390～420nm间某波长下吸收、4-硝基-1-萘酚显色团在430～490nm间某波长下吸收，推算结合显色探针量，按所用小分子显色探针与微纳米材料表面活泼基团、活性分子反应摩尔比，换算成微纳米材料表面的活泼基团、活性分子量；

[0018] 进一步，所述带对硝基酚显色团的氨基酸或其衍生物作为小分子显色探针，代表如下：

[0019] (a)直接作为显色探针，通过与其脂肪族伯胺反应，测定微纳米材料表面羧基活泼酯、对甲苯磺酸酯；

[0020] (b)所述带对硝基酚显色团的氨基酸，与生物素活泼酯反应生成生物素酰胺，作为光度法测定固定化链亲和素量的小分子显色探针，如用于测定链亲和素磁珠上固定化链亲和素的含量；

[0021] (c)所述带对硝基酚显色团的氨基酸，与巯基被乙酰基保护的巯基乙酸活泼酯反应，脱乙酰基保护得含脂肪族硫醇的显色探针，用于测定微纳米材料表面可与巯基反应的活泼基团的含量，包括与巯基反应的卤代乙酰胺、环氧基、卤代苄基、醛基[0022] (d)将权利要求1所述带对硝基酚显色团的氨基酸1a、1b、2c及2d中巯基乙胺基团换成巯基乙磺酸或巯基丙磺酸，得到对应的四种新显色团3a、3b、3c及3d，相当于在权利要求2所述制备方法特征(1)中使用巯基乙胺时换成巯基乙磺酸或巯基丙磺酸；将所得不含氨基的新显色探针的羧基活化成NHS的活泼酯，用于测定微纳米材料表面的脂肪族伯仲氨基的含量。

附图说明

[0023] 图1.所述带对硝基酚显色团的氨基酸直接为显色探针，测定磁珠表面活泼酯量的响应曲线

[0024] 图2.所述氨基酸用生物素修饰为探针，用于显色测定链亲和素磁珠MSP-SAV-F1量的响应曲线

具体实施方式

[0025] 实施例中所用试剂及溶液如下：

[0026] 小分子氨基化显色探针探针结合缓冲液和洗涤缓冲液：pH 6.0，25mM MES[0027] 小分子生物素化显色探针探针结合缓冲液和洗涤缓冲液：pH 7.4，20mM PBS[0028] 链亲和素磁珠MSP-SAV-F1：详见http://www.fbdbio.com/html/fwzx/wjxz/[0029] 实施例1

[0030] 将5g 2-羟基-5-硝基苄醇加入250ml三口烧瓶中，加入10010％硫酸及10g KBr，60度反应6小时；旋转蒸发仪真空抽干，收集得到2-羟基-5-硝基苄溴，过硅胶柱纯化。

[0031] 将得到的产物2g加入250ml三口烧瓶中，加100ml二甲基甲酰胺DMF，磁力搅拌溶解，再加入N-Boc半胱氨酸3g，三口烧瓶内回流反应6小时，薄层色谱监控至显色团反应完。旋转蒸发仪真空抽干的粗产物，硅胶柱层析纯化；用1.0M HCl及10％三氟乙酸去Boc脱保护，得候选的氨基化小分子探针粗品；用丙酮重结晶两次，得到小分子氨基化显色探针。

[0032] 实施例2

[0033] 将1g生物素加入50ml烧瓶中，加入10ml DMF，磁力搅拌80度加热溶解。冷却至室温，再加入1.1倍质量NHS和2.0倍质量DCC，搅拌溶解，室温反应过夜；过滤，上清液加5倍量的乙醚沉淀，得到生物素活泼酯粗品；用80ml的异丙醇重结晶两次，得到生物素活泼酯。

[0034] 将实施例1所得小分子氨基化探针1.0g加入250ml三口烧瓶中，加100ml DMF，50度磁力搅拌溶解。再加入0.5g生物素活泼酯DMF溶液5ml，磁力搅拌室温反应1小时。旋转蒸发仪浓缩到最小体积，加5倍体积乙醚沉淀；用DMF溶解、乙醚沉淀洗涤三个循环，得小分子生物素化显色探针。

[0035] 实施例3小分子显色探针测定羧基磁珠MSP-COOH-F1中活化羧基量[0036] (1)小分子氨基化显色探针，按照实施例1制备；

[0037] (2)pH～8.0时，此显色探针在405nm消光系数约16.8(mM)-1·cm-1；

[0038] (3)用pH 6.025mM MES溶液溶解EDC和NHS，浓度为25mg/ml，27度恒温条件下活化羧基磁珠MSP-COOH-F1共30min，并用冰pH 6.025mM MES缓冲液洗涤活化磁珠2遍，最后悬浮在此pH 6.025mM MES缓冲液；在4度保存并在20min内测定；

[0039] (4)溶解并稀释小分子氨基化显色探针到pH 6.025mM MES缓冲液中，终浓度20.0μM，其初始吸收0.350；每批次稀释制备15ml显色探针溶液备用；

[0040] (5)试管编号0到5号；分别加入洗涤后稀释活化羧基磁珠为0到1.0mg，间隔0.2mg；

[0041] (6)磁力架保留磁珠在EP管壁，尽量去上清液；迅速加入0.80ml显色探针溶液；温和混匀；

[0042] (7)27度反应30min；磁力保留磁珠到EP试管壁，加10μL 1.0M新制NaOH溶液，快速混匀，3.0min后，小心取上清液0.70ml测定405nm吸收；

[0043] (8)以0号管吸收减去上清液吸收为吸附探针前后吸收之差△A，其对磁珠量响应曲线见图1；

[0044] (9)据设定消光吸收，换算被吸附显色探针量推算出羧基含量，约25μmol/g磁珠；

[0045] (10)对0.60mg羧基磁珠MSP-COOH-F1，按照前述重复测定的CV～8％。

[0046] 实施例4生物素化小分子显色探针测定链亲和素磁珠MSP-SAV-F1中的活性蛋白量[0047] (1)小分子生物素化显色探针，按实施例2制备；显色探针消光系数16.8(mM)-1·cm-1；

[0048] (2)用pH 7.420mM磷酸钠溶解稀释生物素化小分子显色探针，终浓度20.0μM，其初始吸收0.350；每批次稀释制备15ml显色探针溶液备用；

[0049] (3)链亲和素磁珠MSP-SAV-F1用pH 7.420mM磷酸钠洗涤，稀释到5.0g/L备用；

[0050] (4)试管编号0到5号；分别加入洗涤后稀释链亲和素磁珠0到10.0mg，间隔2.0mg；

[0051] (6)磁力架保留磁珠在EP管壁，尽量去上清液；迅速加入0.80ml显色探针溶液；温和混匀；

[0052] (7)27度反应30min；磁力保留磁珠到EP试管壁，小心取上清液0.70ml，加10μL新制1.0MNaOH溶液，混匀，3.0min后测定405nm吸收；

[0053] (8)以0号管吸收减去上清液吸收为吸附探针前后吸收之差△A，其对磁珠量响应曲线见图2；

[0054] (9)据设定消光吸收，换算被吸附显色探针量推算出链亲和素亚基量，按保留活性亚基量为实际固定化链亲和素量的四分之三计算，得固定化链亲和素蛋白约15mg/g磁珠；

[0055] (10)对8.0mg链亲和素磁珠MSP-SAV-F1，按照前述重复测定的CV～8％。