橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用

摘要

本发明涉及生物医学光学与分子影像学技术领域，特别涉及橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用。该橙色荧光蛋白为如下序列之一：a)如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列；b)如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得的蛋白序列。本发明橙色荧光蛋白高亮度、单体性强、斯托克斯位移较大，并且组织穿透性强，细胞膜定位效果好。

权利要求

1.一种橙色荧光蛋白，其特征在于，所述橙色荧光蛋白为如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列。

2.编码权利要求1所述橙色荧光蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4所述的载体。

6.权利要求1所述橙色荧光蛋白在蛋白定位或蛋白成像中的应用。

7.权利要求1所述橙色荧光蛋白在制备膜电位探针或双光子成像中的应用。

8.一种融合蛋白，其特征在于，其含有权利要求1所述橙色荧光蛋白。

9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，还含有目标蛋白。

10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，还含有视紫红质蛋白。

说明书

橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学光学与分子影像学技术领域，特别涉及橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用。

背景技术

[0002] 在生物医学光学与分子影像学领域中，荧光蛋白(fluorescent protein)在研究活体细胞内基因的表达水平、蛋白相互作用、蛋白质构象以及蛋白活性中有着重要的应用。但是，在使用荧光蛋白检测特殊生理活动，解决相关的生物学问题时，往往需要荧光蛋白具有很多特定的性能。

[0003] 人的大脑中含有约一千亿个神经元，相互间通过轴突和树突连接，构成一个庞大的信号传输和储存的神经网络体系。神经元之间存在着复杂的动力学相互作用。来自上游神经元的信号在轴突中通过动作电位，以膜电流的形式传递至轴突末端。引起突触内钙离子浓度的改变，钙离子信号调节突触小泡与突触前膜融合，将神经递质、谷氨酸等化学信号分子释放至突触间隙，使下游神经元突触后膜上的配体门离子通道打开，引发下游神经元产生神经信号。目前，检测这些神经活动的基因编码探针主要包括钙离子探针、膜电位探针、pH探针以及神经递质探针四种，而荧光蛋白已经在细胞以及亚细胞水平广泛应用于这些探针的构建。在以上这些神经活动的物理化学变化中，以膜电位快速变化为标志的动作电位在轴突中的快速传递，反映了神经活动的本质。因此，膜电位探针是最重要的一类神经信号检测探针。一个动作电位从去极化到复极化的整个过程大约为1-3毫秒，这就要求膜电位探针具有亚毫秒级的响应速度。目前，只有基于视紫红质蛋白和绿色荧光蛋白的eFRET类型膜电位探针Ace2N-mNeonGreen能真正达到对膜电位变化进行亚毫秒级的响应。

[0004] 然而这一2016年刚刚出现的技术还具有三个很大的局限：1.活体检测动态范围低；2.为绿色荧光探针，荧光的组织穿透性低，且不能与光遗传学结合进行神经信号的纯光学调控和检测；3.该探针中所用的绿色荧光蛋白mNeonGreen双光子性能很差，不适合用于双光子成像。若突破这些限制，提高eFRET膜电位探针的检测动态范围，同时提高其荧光的组织穿透性，将极大的提高膜电位探针的性能，推动神经科学尤其是脑科学的发展。eFRET类型膜电位探针，是利用视紫红质蛋白和荧光蛋白构建融合蛋白，组成一对分子内FRET(荧光共振能量转移)对，共同表达在神经元细胞膜上。当探针所在区域处于静息电位时，两个蛋白FRET较弱，荧光蛋白发出较强的荧光。而当有神经电流通过的瞬间，膜电位发生变化，视紫红质蛋白的吸收光谱发生改变，和荧光蛋白之间产生强FRET。此时视紫红质蛋白大量吸收荧光蛋白所发出光子的光能，荧光蛋白亮度变暗。这一技术以衡量探针亮度的改变来检测膜电位的变化，其动态范围取决于两个重要因素：1.两个蛋白的FRET效率。2.响应膜电位变化的视紫红质蛋白的数量。由于橙色荧光蛋白的发射光谱与视紫红质蛋白的吸收光谱有较大重叠，可以很好的提高FRET效率。同时，橙色荧光蛋白的激发光的波长的光还可以提高响应膜电位变化的视紫红质蛋白的数量。因此，用橙色荧光蛋白替换绿色荧光蛋白来构建eFRET膜电位探针能够提高探针动态范围。此外，橙色荧光在组织中的散射比绿色荧光少，组织穿透性更高。用橙色荧光蛋白替换绿色荧光蛋白可以很好的解决目前eFRET类型膜电位探针的两大缺陷。

[0005] 目前最常用的橙色荧光蛋白有mOrange和mKO两个系列。mOrange是2004年出现的一个橙色荧光蛋白，是通过蛋白工程改造红色荧光蛋白DsRed，得到的衍生物(Shaner et al.Improved monomeric red,orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.red fluorescent protein.Nature Biotechnology 2004.22(12):1567-1572.)。它的光稳定性较差，亮度低，成熟慢。2008年加利福尼亚大学的Shaner等人对其进行了优化，获得了它的一个光稳定性更强的衍生物，命名为mOrange2(Shaner et al.Improving  the photostability of bright monomeric orange and  red fluorescent proteins.Nature Methods 2008.5(6):545-551.)。mOrange2延续了mOrange亮度低(34.8)、成熟慢的缺点，但由于橙色荧光蛋白较为稀少，所以仍然得到了广泛应用。

[0006] mKOκ是目前光学性能最好的橙色荧光蛋白(Tsutsui et al.Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.Nature Methods 2008.5(8):683-685.)，它的EC值达到105000cm-1·mol-1，亮度达到64。然而单体性很差，且在哺乳动物细胞中表达时会在细胞内大量聚集。与mKOκ同属于mKO系列的mKO2，被用于细胞周期的时空动力学研究(Sakaue-Sawano et al.Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Multicellular Cell-Cycle Progression.Cell 2008.132(3):487-498.)。mKO2的光学性能较差，亮度很低(39.6)。

[0007] 这些常用的橙色荧光蛋白的激发峰都在550左右，而目前常用的双光子激光器激发光一般在1000nm以下，限制了它们在双光子成像技术中的广泛应用。且这些蛋白斯托克斯位移(荧光物质的最大发射波长和最大激发波长之差)较小，均为十几纳米。发射峰在560nm左右，组织穿透性不够好。

[0008] 可见，现有可用的橙色荧光蛋白非常少，且都不适合用于构建膜电位探针：1.常用的橙色荧光蛋白mOrange2，已被证明用于构建膜电位探针时细胞膜定位效果差，探针大量聚集在细胞质中，难以上膜，并且其自身亮度低，大大降低了探针亮度的初始值。2.高亮度的mKOκ不仅单体性很差，并且仅仅是单独在细胞中表达时就会发生大量聚集。因此，本发明要解决的技术问题是：开发出一个全新的单体性强且高亮度、细胞膜定位效果好的新型橙色荧光蛋白，有效的解决上述问题。

发明内容

[0009] 有鉴于此，本发明提供了橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用。该橙色荧光蛋白高亮度、单体性强、斯托克斯位移较大，并且组织穿透性强，细胞膜定位效果好。

[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0011] 本发明提供了一种橙色荧光蛋白，橙色荧光蛋白为如下序列之一：

[0012] a)如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列；

[0013] b)如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得的蛋白序列。

[0014] 本发明筛选出了一个全新的橙色荧光蛋白，命名为mGeOFP1(SEQ ID NO：1所示的蛋白序列)，它具有单体性强、高亮度以及细胞膜定位效果佳等特性。它的斯托克斯位移比普通橙色荧光蛋白大(40nm，mOrange2为16nm，mKOκ为12nm)。单光子激发峰为532nm，并且可以很好地被710nm和960-1000nm的双光子激发器激发，发射峰为578nm，提高了组织穿透性。以上特性可以有效提高活体成像的深度和灵敏度。mGeOFP1可以很好地和伞藻的视紫红质蛋白突变体Ace2N共同定位在神经元的细胞膜上并进行高保真度的神经电信号检测。

[0015] 本发明还提供了编码该橙色荧光蛋白的核酸分子。

[0016] 作为优选，核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。但该碱基序列并不是唯一序列，基于密码子的简并性，所有编码SEQ ID NO：1所示蛋白的碱基序列均在本发明的保护范围之内。

[0017] 本发明还提供了一种载体，包括本发明提供的核酸分子。

[0018] 本发明还提供了一种宿主细胞，包括上述载体。

[0019] 本发明还提供了该橙色荧光蛋白在蛋白定位或成像中的应用。

[0020] 本发明还提供了该橙色荧光蛋白在制备膜电位探针或双光子成像中的应用。

[0021] 本发明还提供了一种融合蛋白，其含有上述橙色荧光蛋白。

[0022] 在本发明提供的具体实施例中，该融合蛋白还含有目标蛋白。将橙色荧光蛋白与目标蛋白融合后可用于目标蛋白的定位，且该橙色荧光蛋白不会干扰目标蛋白在细胞内的定位。

[0023] 在本发明提供的另一具体实施例中，该融合蛋白还含有视紫红质蛋白。将橙色荧光蛋白与视紫红质蛋白融合后构建得到融合蛋白膜电位探针，该膜电位探针的细胞膜定位效果良好，对同一神经元细胞同时用膜片钳和膜电位探针进行电信号和光信号的检测，发现膜电位探针可以对神经信号产生高保真的快速同步响应。其响应速度达到亚毫秒级，和电信号的记录频率完全一致。

[0024] 作为优选，视紫红质蛋白为伞藻视紫红质蛋白Ace或其突变体。

[0025] 本发明提供了橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用。该橙色荧光蛋白为如下序列之一：a)如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列；b)如SEQ ID NO：1所示的蛋白序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得的蛋白序列。本发明具有的技术效果为：

[0026] 本发明的核心在于突变筛选出了一种全新的高亮、单体性强、斯托克斯位移较大的高性能橙色荧光蛋白mGeOFP1。单光子激发峰为532nm，它可以很好地被710nm和960-1000nm的双光子激发器激发，发射峰为578nm，并且组织穿透性强，可以有效提高活体成像的深度和灵敏度。可以与视紫红质蛋白构建FRET对，进行融合表达，共同定位在神经元的细胞膜上，并进行高保真度的神经电信号检测。

附图说明

[0027] 图1为通过蛋白工程改造mRuby3获得mGeOFP1的技术方法；A.mRuby3的3D模拟完整结构图(左)及结构剖面图(右)(PDB：5ltr)；β折叠构成桶状结构包围住中间的发光基团，其中主链用卡通格式表示，发光基团用棍状格式表示；α螺旋和β折叠上绿色、黄色、青色和紫红色标注出发光基团周围突变的氨基酸位点；B.荧光筛选系统示意图；图中的激发滤光轮、发射滤光轮和CCD可通过源软件μManager控制；C.蛋白工程设计思路示意图；

[0028] 图2为mGeOFP1的突变位点及其性能表征；A.mGeOFP1的激发光谱(橙色细线)和发射光谱(橙色粗线)图；B.mRuby3和mGeOFP1蛋白氨基酸序列比较，有色背景标示出突变的氨基酸；C.高效液相色谱层析分析mGeOFP1的单体性，黑色线条代表已知的二聚体荧光蛋白mKate2，红色线条代表已知的单体荧光蛋白FusionRed，橙色线条代表mGeOFP1，其中mGeOFP1出峰时间最晚；

[0029] 图3为mGeOFP1在HEK293T细胞中的表达及双光子光谱测定；A.mGeOFP1表达在整个HEK293T细胞中；B.mGeOFP1-CAAX融合蛋白表达在HEK293T细胞的细胞膜上；C.mGeOFP1-H2B融合蛋白表达在HEK293T细胞的细胞核里，该细胞正处于有丝分裂中期，可观察到同源染色体配对；D.mGeOFP1的双光子激发光谱(700-1000nm)；Error bar：10μm；

[0030] 图4为Ace2N-mGeOFP1膜电位探针构建及性能检测；A.探针构建、上膜及添加膜片钳示意图；B.Ace2N-mGeOFP1定位于神经元细胞膜上(灰度图片)；C.光电信号同步记录动作电位；电信号的变化范围为～100mV，探针的光信号随膜电位升高而下降。

具体实施方式

[0031] 本发明公开了橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0032] 本发明提供的橙色荧光蛋白、核酸分子、载体、融合蛋白和应用中所用试剂或仪器均可由市场购得。

[0033] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0034] 实施例1

[0035] 对红色荧光蛋白mRuby3进行晶体结构分析(附图1A)，并与同源序列比对，对影响荧光蛋白光谱的关键位点及与其相互作用的氨基酸进行合理设计和定点突变，然后在组成型表达载体pNCS上对突变体进行表达和筛选，所用表达菌株为XL-10Gold(购买自安捷伦科技公司)。为确保文库的完整性，每个突变体设置10个克隆，最后通过肉眼分辨以及蓝色LED激发光透过橙色丙烯酸滤波器检测突变体的荧光性质，筛选出表达光谱蓝移的荧光蛋白的单克隆(附图1B为荧光筛选装置示意图)。随后进一步对光谱蓝移的突变体荧光蛋白发光基团周围的非保守氨基酸残基进行定点突变，稳定发光基团，筛选出高量子产率(高亮度)的单克隆，命名为mGeOFP1，其氨基酸序列见SEQ ID NO：1：

[0036] MVSKGEELIKEEMPMKVVMTGTVNGHYFKCTGEGEGRPYEGVQTQRIKVIEGGPLPFAFDILSTSFMYGSRTFIKYPADIPDFFKQSFPEGFTWERVTRFEDGGVLTSTQDTSLQDGVLIYNVKVRGENFPSNGPVMQKKTKGWEPSTEMMYPADGGLRGYVDKALKVDGGGHLHCSFVTEYKSKKTVGNIKMPGVHAVDHRLERIEESDNETYVVQREVAVAKYSNLGGGMDELYK

[0037] 编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO：2：

[0038] ATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATCAAGGAAGAGATGCCCATGAAGGTGGTCATGACAGGTACCGTCAACGGCCACTACTTCAAGTGCACAGGCGAAGGAGAAGGCAGACCGTACGAGGGAGTGCAAACCCAGAGGATCAAAGTCATCGAGGGAGGACCCCTGCCATTTGCCTTTGACATTCTTAGCACGTCGTTCATGTATGGCAGCCGTACCTTTATCAAGTACCCGGCCGACATCCCTGATTTCTTTAAACAGTCCTTTCCTGAGGGTTTTACTTGGGAAAGAGTTACGAGATTCGAAGATGGTGGAGTCCTCACCAGCACGCAGGACACCAGCCTTCAGGATGGCGTGCTCATCTACAACGTCAAGGTCAGAGGGGAGAACTTTCCCTCCAATGGTCCCGTGATGCAGAAGAAGACCAAGGGTTGGGAGCCCTCCACAGAGATGATGTATCCAGCAGATGGTGGTCTGAGAGGATACGTCGACAAGGCACTGAAAGTTGATGGTGGTGGCCATCTGCACTGCAGCTTCGTGACAGAATACAAGTCAAAAAAGACCGTCGGGAACATCAAGATGCCCGGTGTCCATGCCGTTGATCACCGCCTGGAAAGGATCGAGGAGAGTGACAATGAAACCTACGTAGTGCAAAGAGAAGTGGCAGTTGCCAAATACAGCAACCTTGGTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAG

[0039] 总体蛋白工程设计思路示意图见附图1C。测序结果表明，mGeOFP1在mRuby3的基础上突变了21个位点(附图2B)。

[0040] 实施例2

[0041] 使用B-PER II(购买自皮尔斯公司)对表达mGeOFP1的细菌进行裂解，然后采用HisPur Cobalt Resin(购买自皮尔斯公司)纯化蛋白，紧接着通过Econo-Pac10DG重力流色谱柱(购买自美国Bio-Rad公司)去盐。完成以上蛋白纯化步骤后，使用Lambda35UV/VIS and LS-55荧光光谱仪(购买自Perkin Elmer公司)检测mGeOFP1的单光子激发光谱和发射光谱。如表1和附图2A所示，mGeOFP1的斯托克斯位移为40nm，比普通橙色荧光蛋白大。其激发峰为
532nm，比其他的橙色荧光蛋白蓝移，更容易被1000nm以下的双光子激发光激发。而其发射峰为578nm，较其他橙色荧光蛋白红移，组织穿透性更强。另外一个不同之处在于，mGeOFP1-1 -1
的消光系数达到91331cm ·mol ，比大多数橙色荧光蛋白都要高。

[0042] 表1 mGeOFP1的光学性能与其它橙色荧光蛋白对比不同突变位点对应的功能[0043]

[0044] 实施例3

[0045] 将纯化的mGeOFP1蛋白浓缩至10mg/mL的高浓度，并用高效液相色谱仪(岛津LC20A)进行层析分析，检测蛋白的单体性。如附图2C所示，mGeOFP1在过层析柱时的峰值时间为32.59分钟，而已知的单体荧光蛋白FusionRed为32.38分钟，出峰时间越晚表示单体性越强，说明mGeOFP1的单体性比FusionRed更好。

[0046] 实施例4

[0047] 将纯化的mGeOFP1蛋白浓缩至5mg/mL的高浓度，并使用Lambda35UV/VIS and LS-55荧光光谱仪(购买自Perkin Elmer公司)检测mGeOFP1在不同pH值的缓冲液中，被同一波长的激发光激发所发出的荧光读值，并据此计算该蛋白的pKa值。如表1所示，mGeOFP1的pKa值为3.7，与其它已知的橙色荧光蛋白相比都更低，说明mGeOFP1在偏酸性环境中比其它橙色荧光蛋白的光学性能都更好，对酸性环境更加耐受。

[0048] 实施例5

[0049] 检测mGeOFP1在1000nm以下的双光子激发谱，双光子的光激发是基于一台耦合了二级钛蓝宝石雷射激光(购买自coherent公司)的IX81商业显微镜(购买自奥林巴斯公司)。由附图3D可知，mGeOFP1在710nm处以及960-1000nm区间都能很好的被双光子激发。

[0050] 实施例6

[0051] 将含有mGeOFP1基因与CAG启动子的质粒通过Lipofectamine 2000试剂盒转染进入HEK293T细胞，并在表达载体pEGFP-C1的基础上构建pmGeOFP1-CAAX和pmGeOFP1-H2B，观察mGeOFP1在哺乳动物细胞内的表达以及细胞膜和细胞核定位情况。由附图3A、B和C可知，mGeOFP1在不同的亚细胞位置依然与其它蛋白有较好的融合性，说明mGeOFP1没有干扰被研究蛋白在细胞内的定位。

[0052] 实施例7

[0053] 将伞藻的视紫红质蛋白突变体Ace2N和mGeOFP1构建融合蛋白膜电位探针(附图4A)，通过慢病毒载体pLenti-CamkII转染进入原代培养的神经元细胞并进行表达，发现Ace2N-mGeOFP1的细胞膜定位效果良好(附图4B)。对同一神经元细胞同时用膜片钳和Ace2N-mGeOFP1探针进行电信号和光信号的检测，发现探针可以对神经信号产生高保真的快速同步响应。其响应速度达到亚毫秒级，和电信号的记录频率完全一致(附图4C)。

[0054] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。