一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用

摘要

本发明涉及一种靶向BCMA嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域为抗BCMA单域抗体；其中，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自：(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者，(b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能的变体。本发明的嵌合抗原受体有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效缩小实体瘤灶，有效提高肿瘤的治疗效果。

权利要求

1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8α信号肽，结合BCMA抗原的胞外结构域，CD8α铰链区，CD8α跨膜结构域，4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成；

所述胞外结构域为抗BCMA单域抗体，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗BCMA单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的核酸。

4.一种病毒载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸。

5.根据权利要求4所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体。

6.根据权利要求5所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。

7.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞转染有编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的T细胞，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体和/或真核表达质粒转染到T细胞。

9.根据权利要求8所述的T细胞，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体转染到T细胞。

10.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求4-6任一项所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

11.根据权利要求10所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

12.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求10或11所述的重组慢病毒。

13.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体、如权利要求10或11所述的重组慢病毒或如权利要求12所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞、免疫细胞或在制备B细胞恶性肿瘤治疗药物中的应用。

说明书

一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用，具体为以特异靶点BCMA为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

[0002] 随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变区(Single chain fragment variable，scFv)或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。

[0003] 绝大多数具有B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的患者是癌症死亡的重要贡献者。B细胞恶性肿瘤对各种治疗形式的应答混合。治疗B细胞恶性肿瘤的传统方法都具有毒性和副作用，而采用抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD23、抗CD52等抗体进行免疫治疗，其效果一般。随着技术的发展，开始使用表达嵌合抗原受体(CAR)修饰的细胞进行治疗，但CAR中所使用的既定抗原结合结构域的治疗效果是不可预知的，造成治疗效果不稳定。

[0004] 采用BCMA抗原作为胞外域用于治疗B细胞相关疾病都有公开，但是抗原结合结构域结合得太强，那么CAR T细胞诱导大规模细胞因子释放，导致视为“细胞因子风暴”的可能致死的免疫反应；但如果抗原结合结构域结合太弱，那么CAR T细胞无法在清除癌细胞方面呈现充足治疗功效。而现有技术中，CN 106687483 A公开了人源化抗BCMA嵌合抗原受体治疗癌症，其通过施用表达CAR遗传修饰的T细胞的方法，从而实现治疗与B细胞成熟抗原蛋白(BCMA)的表达相关的疾病。CN 107207598 A公开了BCMA嵌合抗原受体，其用于B细胞相关病况的过继T细胞疗法的应用。

[0005] 因此，制备一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，除了具有抗体治疗的优点，选择一个与抗原结合结构域结合适中的抗体，必能提供B细胞相关疾病一个更有效的治疗选择。

发明内容

[0006] 针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过筛选得到靶向BCMA的嵌合抗原受体，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

[0007] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：

[0008] 一方面，本发明提供一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，所述包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述胞外结构域为抗BCMA单域抗体；

[0009] 其中，所述抗BCMA单域抗体的氨基酸序列选自：

[0010] (a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者，

[0011] (b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能的变体。

[0012] 本发明中，发明人通过对大量BCMA抗体进行筛选，通过亲和力、能否与人Fc段结合分析，找到了一个抗BCMA单域抗体，通过其结合在嵌合抗原受体的胞外结构域，能够显著提高嵌合抗原受体的治疗效果。

[0013] 在一个具体的实施例中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：qvqlvesggglvqaggslrlscaasgrtfsdhtlgwfrqapgkerefvgaiswsggstyyadsvsgrftisrdkakntgylqmnslkpedtavyycaaaddrysdyrywgqgtqvtvss.

[0014] 根据本发明，所述如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为95％，更优选为98％同一性的变体。

[0015] 在一个具体的实施例中，所述变体与SEQ ID NO.1具有92％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0016] 在一个具体的实施例中，所述变体与SEQ ID NO.1具有94％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0017] 在一个具体的实施例中，所述变体与SEQ ID NO.1具有95％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0018] 在一个具体的实施例中，所述变体与SEQ ID NO.1具有96％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0019] 在一个具体的实施例中，所述变体与SEQ ID NO.1具有98％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0020] 在一个具体的实施例中，所述变体与SEQ ID NO.1具有99％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0021] 根据本发明，所述抗BCMA单域抗体的核苷酸序列包含具有如SEQ ID NO.2所示的序列，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具体如下：caggtgcagctggtagagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgtaccttcagtgaccataccctgggctggttccgccaggctcccgggaaggagcgtgagtttgtaggagctatttcctggagtggtggtagcacatactatgcagactccgtgagcggccgattcaccatctctcgagacaaggccaagaacacgggctatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcagcagccgacgatcgctatagtgactatcgctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca.

[0022] 根据本发明，所述抗BCMA单域抗体的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少85％，例如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，优选90％，更优选95％同一性的变体，其表达的蛋白具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合BCMA和诱导T细胞信号传导功能。

[0023] 根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域。

[0024] 根据本发明，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域。

[0025] 根据本发明，所述共刺激信号传导结构域为人4-1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人4-1BB胞内区。

[0026] 根据本发明，所述胞外结构域和跨膜结构域是通过铰链区连接的，所述铰链区包含IgG1铰链区和/或CD8α铰链区。

[0027] 根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽都是可行的，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，优选为CD8α信号肽或Secretory信号肽。

[0028] 本发明的嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子可以为EFα或任何一种高表达的启动子，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，启动子的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

[0029] 根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、结合BCMA抗原的胞外结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。

[0030] 根据本发明，所述嵌合抗原受体为CD8α信号肽，结合BCMA抗原的胞外结构域，CD8α铰链区，CD8α跨膜结构域，4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。

[0031] 根据本发明，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示的序列，所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具体如下：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSDHTLGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGSTYYADSVSGRFTISRDKAKNTGYLQMNSLKPEDTAVYYCAAADDRYSDYRYWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.

[0032] 根据本发明，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的序列具有至少90％同一性，例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，优选为95％，更优选为98％同一性的变体。

[0033] 第二方面，编码如第一方面所述的嵌合抗原受体的核酸。

[0034] 所述核酸具体如SEQ ID NO.4所示，具体如下：atggcactgccagtgacagccctgctgctgccactggccctgctgctgcacgcagcacgccctcaggtgcagctggtagagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgtaccttcagtgaccataccctgggctggttccgccaggctcccgggaaggagcgtgagtttgtaggagctatttcctggagtggtggtagcacatactatgcagactccgtgagcggccgattcaccatctctcgagacaaggccaagaacacgggctatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcagcagccgacgatcgctatagtgactatcgctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcagggtgaagttttctcggagcgccgatgcaccagcatatcagcagggacagaatcagctgtacaacgagctgaatctgggcaggcgcgaggagtacgacgtgctggataagcggagaggcagagatcccgagatgggaggcaagccaaggaggaagaaccctcaggagggcctgtataatgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactctgagatcggcatgaagggagagcggagaaggggcaagggacacgatggcctgtatcagggcctgagcacagccaccaaggacacctacgatgcactgcacatgcaggccctgccacctagg.

[0035] 第三方面，本发明提供一种病毒载体，包括第二方面所述的核酸。

[0036] 根据本发明，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

[0037] 第四方面，本发明提供一种T细胞，采用如第一方面所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

[0038] 根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体和/或真核表达质粒转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞。

[0039] 本发明中，所述T细胞具有良好的靶向杀伤作用，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤反应性质。

[0040] 第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第三方面所述的病毒载体与包装辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

[0041] 根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

[0042] 第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第五方面所述的重组慢病毒。

[0043] 第七方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的病毒载体、如第四方面所述的T细胞、如第五方面所述的重组慢病毒或如第六方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞、免疫细胞或在肿瘤治疗药物中的应用。

[0044] 根据本发明，所述肿瘤为与B细胞成熟抗原蛋白的表达相关的疾病，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病或胶质母细胞瘤。

[0045] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0046] (1)本发明通过对大量BCMA抗体进行筛选，找到了一个新的抗BCMA抗体能够与BCMA抗原适当结合，达到更好的治疗效果，为B细胞相关疾病提供一个更有效的治疗选择；

[0047] (2)本发明嵌合抗原受体中的羊驼的单域抗体(VHH)的特殊结构，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位(只有15KDa)，除了可以识别一些常规表位外，由于其分子量很小，CDR3区较长，成环向外延伸，还可以识别常规抗体无识别抗原表位，此外还有稳定性好，对人的免疫原性弱等优势；

[0048] (3)本发明的嵌合抗原受体表达阳性率为32％以上，对BCMA阳性细胞具有特异性杀伤作用，且对BCMA阴性细胞几乎没有杀伤，具有高的专一性和良好的治疗效果。

附图说明

[0049] 图1为本发明的嵌合抗原受体的序列示意图；

[0050] 图2为慢病毒表达载体pLVX-EF1α-G8 CAR-Km元件示意图；

[0051] 图3为慢病毒表达载体pLVX-EF1α-G8 CAR-Km质粒图谱；

[0052] 图4为流式检测CAR-T的表达情况结果图，其中，图4(a)为未转染的T细胞的G8 CAR表达比例，图4(b)为本发明嵌合抗原受体的G8 CAR表达比例，图4(c)为未转染的T细胞的FMC63 CAR表达比例，图4(d)为FMC63CAR-T的FMC63 CAR表达比例；

[0053] 图5为CART杀伤靶细胞情况；

[0054] 图6为CART与检测细胞共培养后上清中IFN-gama的分泌结果图。

具体实施方式

[0055] 为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

[0056] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

[0057] 实施例1：嵌合抗原受体的设计

[0058] 本实施例构建了抗BCMA的嵌合抗原受体(G8 CAR)，如序列示意图图1所示，该嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列(Leader)，与BCMA抗原特异性结合的单域抗体序列(Anti-BCMA VHH)，CD8α的铰链区(Hinge)和跨膜区序列(Transmembrane)，4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列，具体各部分序列如下：

[0059] CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：MALPVTALLLPLALLLHAARP；

[0060] CD8α信号肽(leader)的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCA CGCAGCACGCCCT；

[0061] CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；

[0062] CD8α铰链区(hinge)的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；

[0063] CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

[0064] CD8α跨膜区(TM)的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)：ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC；

[0065] 4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

[0066] 4-1BB胞内共刺激域(ICD)的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)：AAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTG；

[0067] CD3ζ信号传导域的氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

[0068] CD3ζ信号传导域的核苷酸序列(SEQ ID NO.14)：AGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGG.

[0069] 实施例2：构建抗BCMA的嵌合抗原受体表达载体

[0070] (1)全基因合成G8 CAR序列，用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的G8 CAR和空载体,于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；

[0071] (2)pCDH-EF1-MCS载体与G8 CAR基因片段的连接：

[0072] 连接体系如下：

[0073]组件 添加量(μl)
PCDH-EF1-MCS载体 2(50ng)
G8 CAR基因 10(150ng)
T4 DNA连接缓冲液 2
T4 DNA连接酶(NEB) 1
dd H2O 5
总共 20

[0074] 于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。

[0075] 抗BCMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-EF1α-G8 CAR-Km的元件见图2，载体图谱见图3。

[0076] 实施例3：慢病毒包装

[0077] 分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：

[0078] (1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，总质量为10μg；

[0079] (2)将上述质粒加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h；

[0080] (3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。

[0081] 实施例4：CAR-T细胞的扩增

[0082] 每位志愿者采30ml的全血，将外周血与生理盐水1:1进行稀释，在离心管内加入Ficoll，缓缓加入稀释后的外周血，1500rpm离心30min轻轻吸取PBMC层移入另一离心管内；

[0083] 用生理盐水洗涤PBMC多次，转入X-VIVO培养基(含50ng/mL的OKT3，300IU/mL的IL-2)中进行培养，PBMC分离后，需要用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，
2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养，而后每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持在0.5×106-1×106/mL，连续观察10天。

[0084] 实施例5：慢病毒感染T细胞

[0085] 利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000g，离心2h；弃上清，加入1×106的T细胞(CD3阳性>90％)，1000g，离心10min，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养，第二日重复上述过程。

[0086] 感染5天后测定G8 CAR的表达，利用FITC-Labeled Human BCMA(货号BCA-HF2H1，Acrobiosystems)与G8 VHH的结合，通过流式细胞仪检测G8 CAR的表达，结果如图4(a)-图4(b)所示；从图4(a)-图4(b)的结果显示，G8 CAR的表达阳性率为32.95％。

[0087] 同样利用FITC-Labeled Human CD19(20-291)Protein,Fc Tag(货号CD9-HF251，Acrobiosystems)与FMC63scFv的结合，通过流式细胞仪检测FMC63 CAR的表达，结果如图4(c)-图4(d)所示；从图4(c)-图4(d)的结果显示，FMC63 CAR的表达阳性率为55.55％。

[0088] 实施例6：细胞毒性检测

[0089] 采用G8 CAR进行细胞毒性检测实验，并用抗CD19 scFv(来自FMC63克隆)构建的CAR和空白对照NC(未转染的T细胞)作为对照，具体步骤如下：

[0090] 利用LDH检测CAR-T细胞对K562、K562-CD19(稳定表达CD19的K562细胞)，K562-BCMA(稳定表达BCMA的K562细胞)和RPMI 8226细胞的毒性；

[0091] 将各种细胞离心后，用无血清无酚红的，RPMI1640培养基多次洗涤后计数，取1×106的K562，K562-CD19，K562-BCMA和RPMI 8226细胞各50μL，铺板于96孔板内，作为靶细胞，按靶细胞：效应细胞＝1:1分别加入未转染的T细胞和各CAR-T细胞，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养12h；加入裂解液作为阳性对照，而后250g离心5min，每孔取100μL培养上清，加入新的96孔板内，加入20μL反应液，放于暗室中反应20-30min。

[0092] 酶标仪590nm测定，根据公式计算溶解百分率：

[0093] 细胞毒性(％)＝[(实验孔－培养基背景孔)－(效应细胞自发LDH释放孔－培养基背景孔)－(靶细胞自发LDH释放孔－培养基背景孔)]/[(靶细胞最大LDH释放孔－体积校正孔)－(靶细胞自发LDH释放孔－培养基背景孔)]×100％。

[0094] 具体的步骤参照申请号为201510362935.5的专利《CD33特异性嵌合抗原受体及其应用》。

[0095] 结果如图5显示，G8 CAR-T细胞能特异性的杀伤BCMA阳性的细胞(K562-BCMA和RPMI 8226)，而对BCMA阴性细胞(K562和K562-CD19)几乎没有杀伤能力；此外，FMC63 CAR-T细胞能特异性的杀伤CD19阳性的K562-CD19细胞，而对CD19阴性细胞(K562和RPMI 8226)几乎没有杀伤能力。

[0096] 实施例7：ELISA检测细胞系与CAR-T细胞共培养上清中IFN-γ的水平[0097] 分别将K562、K562-CD19(稳定表达CD19的K562细胞)，K562-BCMA(稳定表达BCMA的K562细胞)和RPMI 8226细胞按照5×105细胞/孔接种24孔板。按每孔5×105细胞分别加入CAR-T、未转染的T细胞(T mock)细胞，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12小时后；采用人IL-2、IFN-γELISA检测试剂盒(欣博盛生物)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)，结果如图6所示。

[0098] 从图6可以看出，G8 CAR-T细胞与BCMA阳性的细胞(K562-BCMA和RPMI 8226)共培养上清中IFN-γ细胞因子水平均较BCMA阴性细胞(K562和K562-CD19)组有显著性升高。

[0099] 综上所述，本发明的CART相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，本发明找到了一个新的抗BCMA抗体能够与BCMA抗原适当结合，达到更好的治疗效果，为B细胞相关疾病提供一个更有效的治疗选择。

[0100] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。