一株副干酪乳杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株副干酪乳杆菌及其应用，属于微生物以及微生物发酵技术领域。本发明从牦牛乳制品中分离筛选出了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，此副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)产2,3‑丁二酮能力强，发酵24h后，2,3‑丁二酮产量可高达为759μg/kg；将此副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)应用于酸奶油的制备，可显著增强酸奶油的奶香味，提高酸奶油的市场竞争力。

权利要求

1.一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)已于2017年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14023，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在制备食品方面的应用。

3.一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

4.如权利要求3所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述方法为将稀奶油经均质、巴氏杀菌后冷却，得到稀奶油原料；在稀奶油原料中接种权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液作为发酵剂进行发酵，得到酸奶油。

5.如权利要求3所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液的接种量为稀奶油原料体积的0.5％～3％。

6.如权利要求4所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液的接种量为稀奶油原料体积的0.5％～3％。

7.如权利要求3所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度20℃～30℃、时间16h～20h。

8.如权利要求4所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度20℃～30℃、时间16h～20h。

9.如权利要求5所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度20℃～30℃、时间16h～20h。

10.如权利要求6所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度

20℃～30℃、时间16h～20h。

11.如权利要求3所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

12.如权利要求4所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

13.如权利要求5所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

14.如权利要求6所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

15.如权利要求7所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

16.如权利要求8所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

17.如权利要求9所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

18.如权利要求10所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

19.如权利要求3-18任一所述的一种酸奶油的制备方法，其特征在于，所述方法还包含待酸奶油发生凝乳后，将酸奶油于3℃～5℃下放置24h～48h。

20.应用权利要求3-19任一所述的一种酸奶油的制备方法制备得到的酸奶油。

21.应用权利要求20所述的一种酸奶油制备得到的食品。

说明书

一株副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株副干酪乳杆菌及其应用，属于微生物以及微生物发酵技术领域。

背景技术

[0002] 酸奶油是指以稀奶油为原料，经纯乳酸菌发酵剂发酵后通过进一步加工制成的一种乳制品，其表面光亮，质地均匀，具有独特的酸香味，且营养丰富，即可直接食用，又是西餐的理想配料，在各年龄层次的消费者中均有广阔的市场。

[0003] 有研究表明，影响消费者购买酸奶油的主要因素依次为风味、价格、可用性和品牌，而Shepard等人(L.shepard,R.E.miracle,et al.Relating sensory and chemical properties of sour cream to consumer acceptance[J].Journal of dairy science,2013,96(9):5435-5454.)则通过研究发现，酸奶油中的奶香味受到消费者的偏爱。

[0004] 目前已知，影响酸奶油风味的主要物质是2,3-丁二酮、乙酸和丁酸等，其中，2,3-丁二酮是奶香味的主要贡献者；而用GC-MS检测32种市售酸奶油中的2,3-丁二酮的含量，测得的结果为，2,3-丁二酮普遍含量在0.45～130μg/kg之间，其中，只有3种市售酸奶油中含量较高，分别为164μg/kg、172μg/kg、261μg/kg，因此，现有的市售酸奶油中2,3-丁二酮含量普遍较低，高2,3-丁二酮含量的奶香风味酸牛奶在市场上仍然存在空缺。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明从牦牛发酵乳中分离筛选出了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，此副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)产2,3-丁二酮能力强，发酵24h后，2,3-丁二酮产量可高达为759μg/kg；将此副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)应用于酸奶油的制备，可显著增强酸奶油的奶香味，提高酸奶油的市场竞争力。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)已于2017年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14023，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0008] 所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)是从我国四川阿坝自治州的牦牛发酵乳中分离得到的，该菌株经MRS培养基分离、纯化，革兰氏染色，过氧化氢酶鉴定，PCR扩增，凝胶电泳和测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株与副干酪乳杆菌的同源性为100％，故判定菌株为副干酪乳杆，命名为鼠李糖乳杆菌副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

[0009] 所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)经培养，杆状，白色，表明光滑湿润，边缘整齐，突起的菌落；产2,3-丁二酮能力强，降低pH和产酸能力弱。

[0010] 本发明提供了上述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)在制备食品、药品方面的应用。

[0011] 本发明提供了一种酸奶油的制备方法，所述方法为使用上述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述方法为将稀奶油经均质、巴氏杀菌后冷却，得到稀奶油原料；在稀奶油原料中接种权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液作为发酵剂进行发酵，得到酸奶油。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述稀奶油的脂肪含量为18％～30％。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述稀奶油的脂肪含量为20％。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述均质的条件为压强12MPa～21MPa、温度40℃～85℃。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述均质的条件为压强18MPa、温度60℃。

[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述巴士杀菌的条件为温度74℃～82℃、时间30min或温度85℃～90℃、时间25～60s。

[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述巴士杀菌的条件为温度79℃、时间30min。

[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述冷却为冷却至21℃～30℃。

[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述冷却为冷却至26℃。

[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液的活菌数不低于109cfu/mL。

[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液的接种量为稀奶油原料体积的0.5％～3％。

[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌液的接种量为稀奶油原料体积的2％。

[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度20℃～30℃、时间16h～20h。

[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度21℃、时间24h。

[0026] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵终点为可滴定酸度0.7～0.9、pH 4.50～4.55。

[0027] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵终点为可滴定酸度0.8、pH 4.5。

[0028] 在本发明的一种实施方式中，所述方法还包含待酸奶油发生凝乳后，将酸奶油于3℃～5℃下放置24h～48h。

[0029] 在本发明的一种实施方式中，所述方法还包含待酸奶油发生凝乳后，将酸奶油于4℃下放置36h。

[0030] 本发明提供了应用上述一种酸奶油的制备方法制备得到的酸奶油。

[0031] 本发明提供了上述一种酸奶油的制备方法在制备食品方面的应用。

[0032] 有益效果：

[0033] (1)本发明从牦牛发酵乳中分离筛选出了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，此副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)产2,3-丁二酮能力强，发酵24h后，2,3-丁二酮产量可高达为759μg/kg；

[0034] (2)将本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)应用于酸奶油的制备，可显著增强酸奶油的奶香味，提高酸奶油的市场竞争力；

[0035] (3)本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)为可用于食品的安全菌株，用此菌株发酵生产酸奶油，安全健康。

[0036] 生物材料保藏

[0037] 一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，分类学命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，已于2017年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14023，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

[0038] 图1：副干酪乳杆菌CGMCC No.14023发酵过程中的pH变化；

[0039] 图2：副干酪乳杆菌CGMCC No.14023发酵过程中的可滴定酸度变化；

[0040] 图3：添加副干酪乳杆菌CGMCC No.14023的酸奶油的感官评定结果；

具体实施方式

[0041] 本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

[0042] 下述实施例中涉及的培养基如下：

[0043] MRS液体培养基：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，无水乙酸钠2g，MgSO4.7H2O 0.5g，MnSO4.H2O 0.25g，柠檬酸氢二铵2g，K2HPSO4.3H2O，吐温80 1mL溶于1L去离子水中，115℃灭菌20min。

[0044] 下述实施例中涉及的检测方法如下：

[0045] 2,3-丁二酮含量检测(GC-MS法)：

[0046] 气谱条件为：Rtx-WAX毛细管柱；柱子规格：30m×0.25mm×0.25mm，进口温度为250℃，分流比5，柱流速1mL/min，载气为氦气；程序升温：初始温度40℃，保持3min；10℃/min升温至90℃；5℃/min升温至200℃，保持5分钟。

[0047] 质谱条件为：离子化方式EI，发射能量为70eV，发射电流为200μA，检测器电压为1.4kV，离子源温度250℃，接口温度230℃，四级杆温度：150℃，质荷比30～500。化合物检索结果与NIST和Varian2个标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。

[0048] 以10μL的0.2mg/mL癸酸乙酯为内标，计算2,3-丁二酮含量。

[0049] 可滴定酸度检测方法：

[0050] 参照国标GB 5009.239-2016：称取10g(精确到0.01g)混匀的酸奶油，置于250mL的锥形瓶中，加30mL中性乙醇-乙醚混合液，混匀，加入2.0mL酚酞指示液，混匀后用0.1000mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，边滴边转动烧瓶，直到颜色与参比溶液的颜色相似，且5s内不消退，整个滴定过程在45s内完成；

[0051] 滴定过程中，向锥形瓶中吹入氮气，防止溶液吸收空气中的二氧化碳；

[0052] 记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数(V2)，带入公式(1)计算；

[0053] 试样中的酸度数值以(°T)表示，按下式计算：

[0054] X2＝(c2×V2×100)/(m2×0.1)……………………………(1)

[0055] 式中：

[0056] X2——试样的酸度，单位为度(°T)；

[0057] c2——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；

[0058] V2——滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为毫升(mL)；

[0059] m2——试样的质量，单位为克(g)；

[0060] 0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。

[0061] 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

[0062] 感官评定法：

[0063] 以500人为样本，称取实施例中制备得到的酸奶油10g，置于2个透明无味的带盖的30mL塑料品尝杯中，进行气味和滋味感官评定，用无味的一次性塑料勺取滋味感官评定时用的样品。不同的酸奶油样品以随机顺序摆放，感官评定员对酸奶油样品的气味和滋味感官属性进行评分，品尝2个样品的间隙，矿泉水清洗口腔，并用苏打饼干消除奶油的风味和口感，每批提供3～4个样品，每个样品重复两次，每个风味属性的强度用500个人的平均值表示。

[0064] 感官评定标准：

[0065] 气味感官评定包括酸味、甜味、蒸煮味、硫味、奶香味、腥味、刺激性味，臭味和果香味，滋味感官包括酸味、甜味、蒸煮味、硫味、奶香味、奶油味、腥味、刺激味、涩味和苦味，打分制为9分，0分代表没有，1-3分代表较弱，4-6分代表中等强度，7-9分代表强烈。

[0066] 实施例1：本发明菌株的筛选

[0067] (1)获得合适的稀释梯度并培养

[0068] 从四川阿坝自治州传统发酵曲拉样品中称取0.5mL，加入到装有4.5mL无菌水中，然后依次取0.5mL菌液稀释在4.5mL无菌水，使该样品浓度梯度稀释至10-4，取4个稀释度分别为10～104的菌悬液各50μL分别涂布于MRS固体培养基上，在温度37℃下培养46～48h。

[0069] (2)分离纯化

[0070] 用平板划线法，挑选典型单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株，此操作共获得三株菌株，分别为菌株CGMCC No.14023、菌株15M9以及菌株5G2。

[0071] (3)革兰氏染色及过氧化氢酶实验

[0072] 分别挑取上述菌株的单菌落，做革兰氏染色及过氧化氢酶实验，在光学显微镜下观察革兰氏染色结果并记录，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌平板纯化四代，接种于MRS培养三代后，4000rpm离心5min，于30％甘油管内贮藏。

[0073] 实施例2：本发明菌株的鉴定

[0074] (1)PCR扩增16S rDNA

[0075] 吸取1mL甘油管内震荡混匀后的液体培养基，离心后弃去上清液，并用1mL无菌水吹打清洗2次后，离心弃去上清液，用作菌落PCR的模板。

[0076] a)PCR体系50μL，其中Mix为25μL，27F为1μL，1492R为1μL，ddH2O为23μL。

[0077] 所用引物为序列如SEQ ID NO.2所示的27F：AGAGTTTGATCCTGGCCTCA和序列如SEQ ID NO.3所示的1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度1500bp。

[0078] b)PCR条件：

[0079] Lid：105℃mBY-16s V：20μL

[0080] DNA双链在94℃，10min的条件下变性，94℃，30s后冷却50℃，30s，快速升温至72℃时80s，并循环29次，最后72℃下保持7min。

[0081] (2)琼脂凝胶电泳(80mL)

[0082] 在三角瓶中加入0.8g琼脂糖和80mL 1×TAE，用微波加热，直至澄清后，待稍凉后添加EB染料8μL；加入电泳板冷却半小时，待其凝结成固体胶状；用移液枪将3～5μL的样品打入胶板的小孔内，并在每行末端加一个Marker；插上电极，调电压120V，运行半小时；取出胶板，在UV下曝光10s，保存电泳条带的图像；将得到清晰电泳条带的样品测序。

[0083] (3)16S rRNA序列分析鉴定

[0084] 根据北京六合华大基因科技股份有限公司给出的测序报告，结合BLAST分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离的菌株CGMCC No.14023、菌株15M9以及菌株5G2的16S rRNA序列与GenBank数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，经分析鉴定三株菌株均为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

[0085] 其中，副干酪乳杆菌CGMCC No.14023形态特征呈杆状，白色，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起的菌落。

[0086] 实施例3：本发明菌株的应用

[0087] 将-80℃保存的副干酪乳杆菌15M9、副干酪乳杆菌5G2以及副干酪乳杆菌CGMCC No.14023分别接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，取菌液80μL接种于顶空气相瓶内(含2mL 20％脂肪的稀奶油)，置于20℃下培养24h进行发酵，其间，每隔6h取样，将发酵物样品进行2,3-丁二酮的含量、感官评定、pH以及可滴定酸度检测(2,3-丁二酮的含量检测结果如表1，pH检测结果如表2、图1，可滴定酸度检测结果如表3、图2，感官评定结果见图3)。

[0088] 由表1可知，副干酪乳杆菌CGMCC No.14023在各个发酵时间段内生产的2,3-丁二酮产量都高于15M9和5G2；24h时，15M9的2,3-丁二酮产量为212.65μg/kg，5G2为47.21μg/kg，副干酪乳杆菌CGMCC No.14023为759.13μg/kg，高于Shepard检测的2,3-丁二酮(261μg/kg)，且高于对照菌株15M9和5G2，故副干酪乳杆菌CGMCC No.14023产2,3-丁二酮的能力强。

[0089] 由表2、图1可知，15M9在24内pH降低到5.45，5G2降到4.45，副干酪乳杆菌CGMCC No.14023降到5.63，高于15M9和5G2，故副干酪乳杆菌CGMCC No.14023降低pH的能力弱，高产风味物质的同时对产品pH值影响较小。

[0090] 由表3、图2可知，15M9在24时可滴定酸度达到0.46，5G2达到0.70，副干酪乳杆菌CGMCC No.14023达到0.37％(以乳酸计)，低于15M9和5G2，故副干酪乳杆菌CGMCC No.14023产酸能力弱，高产风味物质的同时对产品可滴定酸度值影响较小。

[0091] 由图3可知，副干酪乳杆菌CGMCC No.14023显著提高了酸奶油的奶香味。

[0092] 表1不同发酵时间段2,3-丁二酮产量(μg/kg)

[0093] 菌株 6h 12h 18h 24h15M9 105.83±0.07b 106.68±0.05b 155.16±0.02b 212.65±0.05a
CGMCC No.14023 610.37±1.23c 636.82±0.45c 739.09±1.55c 759.13±0.26b
5G2 4.73±0.03a 8.86±0.05a 10.83±0.04a 47.21±0.05c

[0094] 注：不同字母表示同一列间的差异性(P﹤0.05)

[0095] 表2不同发酵时间段的pH变化(μg/kg)

[0096] 菌株 0h 6h 12h 18h 24h15M9 6.45±0.03a 6.20±0.03b 6.02±0.05b 5.76±0.05b 5.45±0.03b
CGMCC No.14023 6.45±0.02a 6.25±0.03c 6.15±0.04c 5.96±0.03c 5.63±0.03c
5G2 6.45±0.03a 6.12±0.03a 5.86±0.05a 4.90±0.04a 4.45±0.04a

[0097] 注：不同字母表示同一列间的差异性(P﹤0.05)

[0098] 表3不同发酵时间段的滴定酸度变化(μg/kg)

[0099] 菌株 0h 6h 12h 18h 24h15M9 0.25±0.01a 0.33±0.02ab 0.38±0.03ab 0.41±0.02b 0.46±0.02b
CGMCC No.14023 0.25±0.01a 0.32±0.02a 0.33±0.03a 0.34±0.02a 0.37±0.02a
5G2 0.25±0.01a 0.49±0.02c 0.65±0.03c 0.68±0.01c 0.70±0.02c

[0100] 注：不同字母表示同一列间的差异性(P﹤0.05)

[0101] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。