一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase‑m及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为xylanase‑m，又称xylanase‑m蛋白，为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列1中第11‑235位氨基酸残基组成的蛋白质；(a2)序列表的序列1所示的蛋白质；(a3)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明还保护xylanase‑m蛋白作为木聚糖酶的应用。本发明还保护xylanase‑m蛋白在降解木聚糖中的应用。本发明还保护xylanase‑m蛋白在以木聚糖为底物生产还原糖中的应用。本发明可用于食品产业、动物饲料产业以及造纸漂白工业等，具有重大的应用价值。

权利要求

1.一种蛋白质，为如下（a1）、（a2）或（a3）：（a1）序列如序列表的序列1中第11-235位氨基酸残基所示的蛋白质；

（a2）序列如序列表的序列1所示的蛋白质；

（a3）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签为如下任一蛋白质标签：Poly-Arg标签、Poly-His标签、FLAG标签、Strep-tag II标签、c-myc标签。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（b1）或（b2）的DNA分子：（b1）编码区如序列表的序列2第31-705位核苷酸所示的DNA分子；

（b2）编码区如序列表的序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

5.权利要求1所述蛋白质作为木聚糖酶的应用。

6.权利要求1所述蛋白质在降解木聚糖中的应用。

7.权利要求1所述蛋白质在以木聚糖为底物生产还原糖中的应用。

8.一种试剂盒，包括权利要求1所述蛋白质；所述试剂盒的功能为如下（c1）或（c2）：（c1）降解木聚糖；（c2）以木聚糖为底物生产还原糖。

说明书

一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和

应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 半纤维素是植物细胞壁中含量第二高的成分，是自然界中含量第二多的多糖类物质。木聚糖是半纤维素中最重要的组成成分，占被子植物细胞干重的15-30％左右，然而半纤维素或木聚糖难于降解，完全降解木聚糖需要多步酶促反应和多种水解酶的协同作用，其中β-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase,E.C.3.2.1.8)和β-木糖苷酶是最关键的水解酶。木聚糖酶可以打开木聚糖的木糖苷键，有效地降解高聚木聚糖成为木糖单体或低聚木聚糖。

[0003] 在造纸上，纸浆经木聚糖酶处理可以有效释放木质素，从而使色素从纤维素中分离出来达到漂白效果。在饲料中含有的木聚糖是一种抗营养因子，其本身不会被动物消化吸收并且会使饲料粘度增加不利于动物消化，利用木聚糖酶降解饲料中的木聚糖可以加大饲料的吸收率。不论是造纸业还是畜牧业对木聚糖酶的使用中，都会有需要高温处理的过程，野生型木聚糖酶在高温处理后活性丧失较大，这加大了其工业使用的成本，所以工业产业中急需一种耐热的木聚糖酶。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种具有高热稳定性的木聚糖酶xylanase-m及其编码基因和应用。

[0005] 本发明提供的蛋白质，命名为xylanase-m，又称xylanase-m蛋白，为如下(a1)、(a2)或(a3)：

[0006] (a1)序列表的序列1中第11-235位氨基酸残基组成的蛋白质；

[0007] (a2)序列表的序列1所示的蛋白质；

[0008] (a3)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

[0009] 所述标签见表1。

[0010] 表1标签的序列

[0011]

[0012]

[0013] 编码xylanase-m蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

[0014] 所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：

[0015] (b1)编码区如序列表的序列2第31-705位核苷酸所示的DNA分子；

[0016] (b2)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

[0017] (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

[0018] (b4)与(b1)或(b2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

[0019] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

[0020] 含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为以载体pET-28a(+)为出发载体得到的重组质粒。所述重组载体具体可为在载体pET-28a(+)的NcoI和EcoRI酶切位点之间插入序列表的序列2第5-708位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述重组菌可为将重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌，具体可为将重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

[0021] 本发明还保护xylanase-m蛋白作为木聚糖酶的应用。所述应用中，反应的温度具体可为35-75℃，更具体可为65-75℃，更具体可为65℃。所述应用中，反应的pH可为3.5-7.5，更具体可为4-7，更具体可为5。

[0022] 本发明还保护xylanase-m蛋白在降解木聚糖中的应用。所述应用中，反应的温度具体可为35-75℃，更具体可为65-75℃，更具体可为65℃。所述应用中，反应的pH可为3.5-7.5，更具体可为4-7，更具体可为5。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。

[0023] 本发明还保护xylanase-m蛋白在以木聚糖为底物生产还原糖中的应用。所述应用中，反应的温度具体可为35-75℃，更具体可为65-75℃，更具体可为65℃。所述应用中，反应的pH可为3.5-7.5，更具体可为4-7，更具体可为5。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。

[0024] 本发明还保护一种试剂盒，包括xylanase-m蛋白；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)：(c1)降解木聚糖；(c2)以木聚糖为底物生产还原糖。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。

[0025] 本发明还保护一种试剂盒，包括所述基因；所述试剂盒的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)生产木聚糖酶；(d2)降解木聚糖；(d3)以木聚糖为底物生产还原糖。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。

[0026] 本发明还保护一种试剂盒，包括含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述试剂盒的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)生产木聚糖酶；(d2)降解木聚糖；(d3)以木聚糖为底物生产还原糖。所述木聚糖具体可为桦木木聚糖。

[0027] 本发明在现有木聚糖酶的基础上构建了突变蛋白库，经过大量筛选验证，获得了一个突变体蛋白，其热稳定性大幅度提高，从而在工业生产中的实用性大大提高。本发明可用于食品产业、动物饲料产业以及造纸漂白工业等，具有重大的应用价值。

附图说明

[0028] 图1为实施例4的步骤一的结果。

[0029] 图2为实施例4的步骤二的结果。

[0030] 图3为实施例4的步骤三的结果。

[0031] 图4为实施例4的步骤四的结果。

[0032] 图5为实施例4的步骤五的结果。

具体实施方式

[0033] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0034] 载体pET-28a(+)：Invitrogen公司。大肠杆菌BL21(DE3)：大肠杆菌BL21(DE3)。桦木木聚糖：SIGMA，产品编号X0502，CAS号9014-63-5。荧光染料：Thermo Fisher，货号S6651。

[0035] 野生型木聚糖酶(xylanase-wt)由序列表的序列3第11-235位氨基酸残基组成，其编码基因如序列表的序列4第31-705位核苷酸所示。木聚糖酶突变体(xylanase-m)由序列表的序列1第11-235位氨基酸残基组成，其编码基因如序列表的序列2第31-705位核苷酸所示。

[0036] 实施例1、重组菌的构建

[0037] 将序列表的序列4第5-708位核苷酸所示的双链DNA分子插入载体pET-28a(+)的NcoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-xylanase-wt。经测序，对重组质粒pET28a-xylanase-wt进行结构描述如下：外源DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列4所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的蛋白质。序列表的序列3中，第5-10位氨基酸氨基组成his6标签，第11-235位氨基酸残基组成野生型木聚糖酶。将重组质粒pET28a-xylanase-wt导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌，将其命名为重组菌BL21/xylanase-wt。

[0038] 将序列表的序列2第5-708位核苷酸所示的双链DNA分子插入载体pET-28a(+)的NcoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-xylanase-m。经测序，对重组质粒pET28a-xylanase-m进行结构描述如下：外源DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列1所示的蛋白质。序列表的序列1中，第5-10位氨基酸氨基组成his6标签，第11-235位氨基酸残基组成木聚糖酶突变体。将重组质粒pET28a-xylanase-m导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌，将其命名为重组菌BL21/xylanase-m。

[0039] 实施例2、木聚糖酶的制备

[0040] 试验菌分别为：重组菌BL21/xylanase-wt或重组菌BL21/xylanase-m。

[0041] 1、将试验菌接种至液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm值为1。

[0042] 2、完成步骤1后，在体系中加入IPTG并使其浓度为0.1mM，30℃、200rpm振荡培养16h。

[0043] 3、完成步骤2后，离心收集菌体，用pH7.0、50mM的PBS缓冲液重悬后进行超声破碎(超声破碎参数：功率30％，总时间20min，每工作5s停5s)，然后12000rpm离心10min，收集上清液。

[0044] 4、取步骤3得到的上清液，进行镍柱亲和层析。

[0045] 镍柱(柱体积为2mL)：6FF Ni Sepharose(北京江晨源远生物技术有限公司；货号：HA-0710-02)。

[0046] 洗涤液：含有25mM咪唑的pH8.0、20mM Tris-HCl缓冲液。

[0047] 洗脱液：含有250mM咪唑的pH8.0、20mM Tris-HCl缓冲液。

[0048] 步骤：先用pH8.0、20mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子；然后上样15mL步骤3得到的上清液；然后用10mL洗涤液洗涤柱子；然后用10mL洗脱液洗脱柱子并收集过柱后溶液。

[0049] 5、取步骤4得到的过柱后溶液，用3KD孔径的柱式超滤膜进行脱盐。

[0050] 步骤：先用pH7.0、50mM的PBS缓冲液平衡超滤膜；然后上样步骤4得到的过柱后溶液；然后用pH7.0、50mM的PBS缓冲液反复洗涤除盐，得到以pH7.0、50mM的PBS缓冲液为溶剂体系的蛋白溶液。

[0051] 试验菌为重组菌BL21/xylanase-wt，得到的蛋白溶液命名为xylanase-wt溶液。

[0052] 试验菌为重组菌BL21/xylanase-m，得到的蛋白溶液命名为xylanase-m溶液。

[0053] 实施例3、木聚糖酶的活性分析(DNS法)

[0054] 1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

[0055] 一、制备待测溶液。

[0056] 取实施例2制备的xylanase-wt溶液或xylanase-m溶液，用pH7.0、50mM的PBS缓冲液稀释后作为待测溶液。

[0057] 二、检测待测溶液的蛋白浓度。

[0058] 检测步骤1制备的待测溶液中目的蛋白的浓度(以总蛋白浓度计)。

[0059] 三、检测待测溶液的酶活。

[0060] 1、制备初始反应体系。

[0061] 初始反应体系(100μL)由待测溶液、桦木木聚糖和pH7.0、50mM的PBS缓冲液组成。初始反应体系中，蛋白的浓度为0.005mg/mL，桦木木聚糖的浓度为1g/100mL。

[0062] 2、将步骤1制备的初始反应体系37℃/60℃静置反应10min，然后加入100μL DNS溶液终止反应，然后沸水煮10min。

[0063] DNS溶液的制备方法：称取3，5-二硝基水杨酸(10土0.1)g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤；贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

[0064] 3、完成步骤2后，反应体系冷却至室温，用超纯水稀释后于540nm测定OD值，将OD值通过标准曲线转换为μmol数。

[0065] 每次试验需要重新制作做标准曲线，某次标注曲线方程为：Y＝(X-0.39)×n1÷5.10。Y代表酶解释放的还原糖量，单位为μmol；X代表测得的OD值；n1代表稀释倍数。

[0066] 4、计算蛋白的比活力。

[0067] 比活力＝还原糖量÷(10×反应体系中的蛋白量)。

[0068] 比活力的单位为U/mg，还原糖量的单位为μmol，蛋白量的单位为mg。

[0069] 结果见表2。37℃下，xylanase-wt和xylanase-m的比活力在基本一致。60℃下，xylanase-m的比活力极其显著的高于xylanase-wt。

[0070] 表2

[0071]   37℃ 60℃xylanase-wt 5700U/mg 8300/mg
xylanase-m 5500U/mg 11200/mg

[0072] 实施例4、木聚糖酶的部分性质分析

[0073] 待测蛋白溶液为实施例2制备的xylanase-wt溶液或xylanase-m溶液。

[0074] 一、热稳定性测定(Tm值)

[0075] 蛋白质溶液在逐渐加热到临界温度以上时，蛋白质的构象从天然状态到变性状态有一个显著的转变，这个转变的中点温度称为熔化温度(Tm)。

[0076] 取待测蛋白溶液，加入荧光染料和pH7.0、50mM的PBS缓冲液，得到蛋白浓度为0.05mg/mL、荧光染料浓度为0.2％的待测溶液。取待测溶液，检测熔化温度。

[0077] 结果见图1。xylanase-m的Tm值为70.5℃，xylanase-wt的Tm值为55℃。

[0078] 二、热稳定性

[0079] 取待测蛋白溶液，用pH7.0、50mM的PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/mL，然后65℃静置孵育。分别于65℃静置孵育前、65℃静置孵育0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时或6小时后，取样10μL作为待测溶液。

[0080] 酶活检测方法同实施例3。

[0081] 将65℃静置孵育前的比活力作为100％，计算65℃静置孵育不同时间的待测酶液的相对酶活。

[0082] 结果见图2。xylanase-m在65℃的热稳定性非常高,65℃孵育6小时后相对酶活保持100％。xylanase-wt在65℃的热稳定性很低，65℃孵育0.5小时后，相对酶活仅为36％。结果表明,xylanase-m能够抵御高温处理，在工业生产中具有巨大的应用潜力。

[0083] 三、最适温度

[0084] 取待测蛋白溶液，用pH7.0、50mM的PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/mL，作为待测溶液。

[0085] 酶活检测方法参见实施例3。反应温度分别设置为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃，其他同实施例3。

[0086] 将最高比活力作为100％，计算其他反应温度下的相对酶活。

[0087] 结果见图3。xylanase-wt的最适温度为55℃。xylanase-m的最适温度为65℃,并且在75℃时的相对酶活仍然能够维持在50％左右。

[0088] 四、pH稳定性

[0089] 取待测蛋白溶液，用缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/mL，然后37℃静置孵育1h，得到待测溶液。

[0090] 缓冲液分别为：pH3.0-7.5的100mM柠檬酸钠缓冲液，pH8.0-9.0的100mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.5-10.0的100mM的Gly-NaOH缓冲液。

[0091] 酶活检测方法同实施例3。

[0092] 将最高比活力作为100％，计算其他pH条件下孵育1小时后的相对酶活。

[0093] 结果见图4。xylanase-wt和xylanase-m的pH稳定性曲线基本一致，在碱性条件下xylanase-m比xylanase-wt更加稳定。

[0094] 五、最适pH

[0095] 取待测蛋白溶液，用pH7.0、50mM的PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为0.005mg/mL，得到待测溶液。

[0096] 酶活检测方法参见实施例3。酶活检测中采用的缓冲液分别为：pH3.0-7.5的100mM柠檬酸钠缓冲液，pH8.0-9.0的100mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.5-10.0的100mM的Gly-NaOH缓冲液。其他同实施例3。

[0097] 将最高比活力作为100％，计算其他pH下的相对酶活。

[0098] 结果见图5。xylanase-wt和xylanase-m的最适pH曲线几乎一致，最适pH值都为5。