circCDYL2及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂

摘要

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及circCDYL2及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂。首次发现circCDYL2在鼻咽癌细胞系中高表达，且能促进鼻咽癌细胞的侵袭与转移，提示circCDYL2可能成为鼻咽癌诊断标记物，以及用于制备诊断鼻咽癌的试剂。具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

权利要求

1.检测环状RNA circCDYL2表达量的试剂在制备诊断鼻咽癌制剂中的应用，所述的环状RNA circCDYL2序列如SEQ ID NO .1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测环状RNA circCDYL2表达量的试剂包括PCR检测试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PCR检测试剂中的引物为：上游引物：5’-CCTGGCTTGGATTTGAATGA-3’ ；

下游引物：5’-CTCCCGTAGCCTTTCCATC-3’。

说明书

circCDYL2及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种环状RNA circCDYL2及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂。

背景技术

[0002] 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种高转移的恶性肿瘤，具有不同的发病机制和组织病理学表现。遗传易感性，表观遗传，种族衍生，地理分布，环境因素和EBV病毒感染导致NPC的恶性。鼻咽癌的发生有明显的区域特征，东南亚特别是华南和北非的病例占多数。NPC的治疗策略主要是放疗辅以化疗。虽然早期NPC患者的5年总生存率高达95％，但鼻咽和颈淋巴结复发率为8.6％～23.7％。这是由于NPC的发生和发展涉及复杂的基因调控和多阶段过程，其分子机制尚不清楚，加之肿瘤异质性和放疗抵抗引起的个体差异，传统放疗的治疗效果不是非常的理想。因此，研究治疗鼻咽癌的治疗靶标和诊断的分子标记物至关重要。

[0003] circRNA主要来源于蛋白质编码基因的外显子区，也可以由内含子区、UTR区、基因间区、非编码RNA位点及已知转录物的反义位点形成。CircRNA是由前体mRNA(precursor messenger RNA,pre-mRNA)反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴并以共价键形成环状套索结构的非编码RNA分子。

[0004] CircRNA形成过程可以分为两大类，即外显子环化(exon circularization)和内含子环化(intron circularization)两大机制。Jeck等提出外显子来源的circRNA(exonic circRNA,ecircRNA)可以分为套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种形成方式，套索驱动环化是外显子3’端作为剪接供体(splice donor)攻击5’端剪接受体(splice receptor),Alu区共价结合而形成套索结构，套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circRNA；内含子配对驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后，剪除内含子形成circRNA。其实内含子本身也可以环化，可以形成内含子来源circRNA(circular intronic RNA,ciRNA)。CircRNA是由前体mRNA反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴并以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码RNA分子。有着高度的稳定性、保守性、特异性，并且含量高的特点。

[0005] CircRNA最早在1976年于RNA病毒中首次发现，随后Hsu MT等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circRNA的存在。近年来越来越多的circRNA被发现，目前为止已知的circRNA数目已经达到三万多个。CircRNA也不再被认为是错误的RNA转录本，而是作为非编码RNA研究中的耀眼之星冉冉升起。发现更多的新型circRNA作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。

[0006] 我们检测到一个长度为592bp的circCDYL2。通过实验发现该环状RNA在鼻咽癌中高表达且能促进鼻咽癌的侵袭转移，有可能作为鼻咽癌诊断标记物，以及治疗的靶点。

发明内容

[0007] 本发明发现了一个大小592bp的circCDYL2，并发现了它与鼻咽癌之间存在的关系，有可能作为鼻咽癌诊断标记物和治疗的靶点。

[0008] 本发明的第一个目的是提供一种环状RNA circCDYL2，序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明的第二个目的是提供一种检测环状RNA circCDYL2表达量的试剂在制备诊断鼻咽癌制剂中的应用，所述的环状RNA circCDYL2序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 进一步的，所述的检测环状RNA circCDYL2表达量的试剂包括但不限于PCR检测试剂。

[0011] 进一步的，所述的PCR检测试剂中的引物优选为：

[0012] 上游引物：5’-CCTGGCTTGGATTTGAATGA-3’

[0013] 下游引物：5’-CTCCCGTAGCCTTTCCATC-3’，

[0014] 但不限于上述具体的引物。

[0015] 本发明的第三个目的是提供一种诊断鼻咽癌的制剂，包括检测环状RNA circCDYL2表达量的试剂，所述的环状RNA circCDYL2序列如SEQ ID NO.1所示。

[0016] 进一步的，所述的检测环状RNA circCDYL2表达量的试剂包括但不限于PCR检测试剂。

[0017] 进一步的，所述的PCR检测试剂中的引物优选为：

[0018] 上游引物：5’-CCTGGCTTGGATTTGAATGA-3’

[0019] 下游引物：5’-CTCCCGTAGCCTTTCCATC-3’，

[0020] 但不限于上述具体的引物。

[0021] 进一步的，所述的PCR检测试剂还包括内参对照：

[0022] 上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’

[0023] 下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’；

[0024] 但不限于上述具体的阴性对照。

[0025] 本发明首次发现circCDYL2在鼻咽癌细胞系中高表达，且能促进鼻咽癌细胞的侵袭与转移，提示circCDYL2可能成为鼻咽癌诊断标记物，以及用于制备诊断鼻咽癌的试剂。具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

[0026] 图1为RNA测序中显示的circCDYL2的表达情况及qRT-RCR检测鼻咽癌细胞系中circCDYL2的表达水平；

[0027] 左图N为非肿瘤鼻咽上皮组织，样本数为3例；T为鼻咽癌组织，样本数为10例，n为样本数量，均采用t检验，P<0.05具有统计学意义；右图中检测circCDYL2在鼻咽癌细胞系中的表达，NP69是永生化的正常鼻咽上皮细胞，作为参照，其余均为鼻咽癌细胞系。

[0028] 图2为Sanger法测序；

[0029] a.circCDYL2由CDYL2的2号外显子首尾拼接形成，E表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circRNA形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接。

[0030] 图3为核质分离RNA实验检测circCDYL2在细胞中的定位；

[0031] 利用核质分离试剂盒抽提鼻咽癌细胞中的RNA，以GAPDH为胞质的内参，U6为细胞核的内参，结果显示circCDYL2约70％位于核内，30％位于胞质中。

[0032] 图4为qRT-PCR技术检测鼻咽癌细胞系中circCDYL2ASO的沉默效率；

[0033] a.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中circCDYL2ASO的沉默效率,circCDYL2表达水平分析以β-actin作为参照；b.在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中转染ASO后，检测线性RNA的表达，ns代表无意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0034] 图5为过表达载体的质粒图谱；

[0035] 图6为qRT-PCR检测circCDYL2过表达效率；

[0036] 在HONE1、HNE2和CNE2细胞系中用qRT-PCR实验检测circCDYL2过表达效率，circCDYL2表达水平分析以β-actin作为参照，将pcDNA3.1组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0037] 图7为体外沉默circCDYL2对鼻咽癌细胞增殖的影响；

[0038] 在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2用hiperfect瞬时转染NC、ASO circCDYL2，继续培养24小时后进行MTT实验检测细胞增殖能力，将NC组标准化为1，ns代表没有意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0039] 图8为体外过表达circCDYL2对鼻咽癌细胞增殖的影响；

[0040] 在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2用hiperfect瞬时转染pcDNA3.1、circCDYL2，继续培养24小时后进行MTT实验检测细胞增殖能力，将pcDNA3.1组标准化为1，ns代表没有意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0041] 图9为沉默circCDYL2对鼻咽癌细胞侵袭的影响；

[0042] 用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障，在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染NC、ASO 24小时后，用基质胶侵袭实验检测沉默circCDYL2对鼻咽癌细胞侵袭的影响，其中右图为细胞个数的统计图，将NC标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0043] 图10为过表达circCDYL2对鼻咽癌细胞侵袭的影响；

[0044] 用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障，在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染pcDNA3.1、circCDYL2 24小时后，用基质胶侵袭实验检测过表达circCDYL2对鼻咽癌细胞侵袭的影响，其中右图为细胞个数的统计图，将pcDNA3.1标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0045] 图11为体外沉默circCDYL2对鼻咽癌细胞划痕愈合能力的影响；

[0046] 在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染NC、ASO后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图，将NC标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0047] 图12为过表达circCDYL2对鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2划痕愈合能力的影响；

[0048] 在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染pcDNA3.1、circCDYL2后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图，将pcDNA3.1标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

[0049] 以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0050] 本发明所用HONE1、HNE2、CNE2等鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素、链霉素)的RPMI1640液体培养基，37℃、95％湿度、5％CO2浓度的恒温培养箱内贴壁生长。

[0051] 本发明环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，Primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，委托擎科生物公司长沙合成部合成。

[0052] (1)β-actin

[0053] 上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’，如SEQ ID NO.2所示，

[0054] 下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’，如SEQ ID NO.3所示，[0055] (2)环状RNA circCDYL2实时定量PCR引物

[0056] 上游引物：5’-CCTGGCTTGGATTTGAATGA-3’，如SEQ ID NO.4所示，

[0057] 下游引物：5’-CTCCCGTAGCCTTTCCATC-3’，如SEQ ID NO.5所示，

[0058] (3)扩增circCDYL2全长引物

[0059] 上游引物：5’-CGCATCGATGTTGAAAGGATTGTAGACAAGAGG-3’，如SEQ ID NO.6所示，[0060] 下游引物：5’-AATCCGCGGCGAGCCCGTTCTCCGC-3’，如SEQ ID NO.7所示，[0061] 本发明为了特定的敲低环状RNA而不影响它的线性基因表达，根据拼接位点设计ASO(反义寡核苷酸)，靶向沉默circCDYL2。

[0062] circCDYL2ASO序列：

[0063] 正义链(5'-3')GAGAACGGGCUCGGUUGAAAUU，如SEQ ID NO.8所示，

[0064] 反义链(5'-3')UUUCAACCGAGCCCGUUCUCUU，如SEQ ID NO.9所示。

[0065] 阴性对照：

[0066] 正义链(5'-3')GAGAACGGGAUAGCAUCGACUU，如SEQ ID NO.10所示，

[0067] 反义链(5'-3')GUCGAUGCUAUCCCGUUCUCUU，如SEQ ID NO.11所示。

[0068] 本发明试验结果均采用统计学分析：t检验用来评价两组之间的差异。卡方检验用来评估基因表达或不表达在性别、年龄、肿瘤阶段、临床分期和转移情况等临床参数方面的差异。p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用SPSS 13.0和Graphpad 5.0软件进行。

[0069] 实施例1：circCDYL2在鼻咽癌细胞中的表达

[0070] 1、细胞总RNA提取

[0071] 准备工作：灭菌后的无RNase水、75％乙醇(无RNase配制)、氯仿、异丙醇、1×PBS、无酶tip头和EP管，高速低温离心机预冷至4℃，实验开始前先将实验台面及移液枪用75％酒精擦拭。

[0072] (1)取待提取RNA的细胞，用1×PBS或D-hanks清洗两次；

[0073] (2)12孔板中每孔加500μl Trizol裂解液，室温裂解1-2分钟，用移液枪轻轻吹下细胞，上下轻柔颠倒10次，室温静置5分钟；

[0074] (3)加入100μl的氯仿(按1mlTrizol:0.2ml氯仿:0.5ml异丙醇)，用力震荡15-30s，冰上放置5分钟；

[0075] (4)4℃，12000rpm/20min；

[0076] (5)取上层水相于预冷的Tube管中，加入250μl异丙醇，用漩涡混合器或移液枪混匀(-20℃>1h)；

[0077] (6)4℃，12000rpm/30min，弃上清；

[0078] (7)加入75％乙醇(预冷)1ml，混匀；

[0079] (8)4℃，7600rpm/5min；弃上清，重复步骤8,9；

[0080] (9)闪离10s，尽量吸尽上清，倒置干燥10分钟；

[0081] (10)加入20-30μl DEPC，测RNA浓度和OD值。

[0082] 2、circRNA逆转录PCR反应

[0083] (依据abm公司5×All-In-OneRTMasterMix(withAccuRTGenomicDNARemovalKit)(#G492)的实验说明手册操作，)

[0084] 配置如下反应体系：

[0085]

[0086] 逆转录PCR上机反应程序如下：

[0087] 25℃        10min，

[0088] 42℃        15min，

[0089] 85℃        5min。

[0090] 待反应结束后，-20℃保存产物备用。

[0091] 3、实时荧光定量PCR

[0092] 先将逆转录反应产物稀释5倍，然后依据abm公司EvaGreen qPCR MasterMix(MasterMix-R)的实验说明手册操作，配置如下反应体系：

[0093]

[0094] 实时荧光定量PCR机上反应程序如下：(Cycle×39)

[0095]

[0096] Bio-RadIQ5实时荧光定量PCR仪进行上述反应完成后，与内参基因β-actin标化,以

[0097] 2-ΔΔCT值显示目标基因的相对表达量，判定基因的表达差异。采用unpaired t-test检验计算P值。

[0098] 结果：鼻咽癌细胞中circCDYL2的表达明显高于正常鼻咽上皮细胞NP69(结果见图1)。因此，circCDYL2在鼻咽癌细胞系中高表达，circCDYL2对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能可以据此进行鼻咽癌诊断。

[0099] 实施例2：sanger测序证明形成的是环状RNA

[0100] 为了证明circCDYL2形成的是环状RNA而非线性的，将图一中的qRT-PCR产物回收，送公司进行sanger测序(擎科公司)。将公司返回的序列用DNASTAR软件进行比对，chromas软件看峰图，判断测序的质量。结果显示，circCDYL2确实是由母基因ARHGAP12的2、3号外显子头尾相接环化形成。a.circCDYL2由ARHGAP12的2,3号外显子首尾拼接形成，E表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circRNA形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接(见图2)。

[0101] 实施例3：核质分离RNA检测circCDYL2在细胞内的定位

[0102] 由于ASO发挥作用主要是在细胞质中，因此检测circCDYL2的定位可判断能否很好地干扰circCDYL2的表达。利用核质分离试剂盒将细胞核和细胞质的RNA分离，然后用实时荧光定量PCR检测circCDYL2在核、质中表达所占的比重。以GAPDH为胞质的内参，U6为细胞核的内参，结果显示circCDYL2在核、质中的分布各占50％(见图3)。

[0103] 核、质RNA提取：

[0104] 1、收107个细胞，胰酶消化，10％FBS终止消化，PBS洗一遍，离心，置于冰上；

[0105] 2、加入100-500ul的Cell Fractionation Buffer，轻轻吹打，防止核破裂；

[0106] 3、冰上孵育5-10min；

[0107] 4、4℃离心，1-5min(上层为细胞质部分，下层为细胞核部分)；

[0108] 5、将上层吸出至一新的EP管，置于冰上(下一步为步骤8，细胞质部分)；

[0109] 6、在原EP管中加入与步骤2等体积的Cell Fractionation Buffer，温和的重悬，4℃离心，500g/分钟(可再重复一次)；

[0110] 7、加入与步骤2中等体积的预冷的Cell Disruption Buffer，剧烈震荡，吹打混匀至于冰上；

[0111] 8、加入等体积的2X Lysis/Binding Buffer(室温)，立即吹打混匀，若混合物过于黏稠。可匀浆；

[0112] 9、加入与步骤8中等体积的100％乙醇，立即吹打混匀；

[0113] 10、将混合物移至(过滤器-收集管中)，一次最大体积700ul，12000rpm离心30s，弃废液；

[0114] 11、700ul Wash Solution I洗一次，12000rpm离心30s，弃废液；

[0115] 12、500ul Wash Solution 2/3洗一次，12000rpm离心30s，弃废液；

[0116] 13、重复步骤12；

[0117] 14、空离30秒

[0118] 15、将过滤柱移至一个新的EP管，加入40ul预热的Elution Solution，12000rpm离心30s，再加入20ul Elution Solution 12000rpm离心30s，测浓度备用。

[0119] 实施例4：在鼻咽癌细胞系中沉默circCDYL2表达的效果检测

[0120] 反义寡核苷酸(ASO)是一类通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制该基因表达的分子。ASO针对拼接位点设计和靶序列互补的序列，从而避免干扰线性RNA的表达。目前，ASO已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circCDYL2在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circCDYL2的拼接位点设计了ASO，利用Hiperfect试剂将ASO和NC(空白对照)瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circCDYL2的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circCDYL2的表达水平以检测ASO的转染效率，确认circCDYL2敲低效果达到0.5以下(见图4a)。然而以circCDYL2的序列设计线性引物时，实时荧光定量PCR检测发现ASO并未敲低线性RNA的表达，说明ASO是特异性沉默circCDYL2的(见图4b)。

[0121] 实施例5：在鼻咽癌细胞系中circCDYL2过表达效果检测

[0122] 首先我们选择酶切位点，将circCDYL2全长序列放入NEB cutter 2.0在线网站分析，显示ClaI和SacII酶切位点为circCDYL2全长序列中不存在的位点，同时在pcDNA3.1质粒载体(购于生工生物工程公司)中单一存在的DNA限制性内切酶。将circCDYL2全长序列克隆进pcDNA3.1质粒空载，图5为绘制的过表达载体图谱。

[0123] 为了检测circCDYL2的成环效率，首先我们将构建的pcDNA3.1/circCDYL2真核过表达载体在鼻咽癌细胞中进行过表达。把生长状况良好的第三、四代鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2种到12孔板中，待细胞融合度达到60％-80％时，用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1/circCDYL2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养至36h收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circCDYL2的表达水平及成环效率。qPCR结果显示，与pcDNA3.1空质粒组细胞相比，转pcDNA3.1/circCDYL2过表达质粒组的细胞中circCDYL2的表达水平显著升高，结果具有统计学意义(见图6)。

[0124] 实施例6：MTT实验检测细胞增殖

[0125] 我们首先用hiperfect转染NC、ASO  circCDYL2，或相应的用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/circCDYL2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养24h后，进行MTT实验，验证其对细胞增殖的影响。结果发现ASO circCDYL2能显著抑制三株细胞系的增殖，而过表达circCDYL2显著促进三株细胞系的增殖(结果见图7，8)

[0126] (1)准备：Tip头、高温高压灭菌的D-hanks；移液枪、marker笔、15ml离心管等酒精消毒后再放置在生物安全柜内紫外照射30min，通风10min。

[0127] (2)种板和转染：前一天将25cm2细胞瓶中的状态良好的细胞消化下来种入6孔板，待细胞密度长至70％左右转染NC、ASO circCDYL2，或者待细胞长至80～90％左右转染过表达载体。

[0128] (3)转染12小时后，吸弃细胞上清，D-hanks洗3遍，6孔板每孔加入100μl胰酶，消化细胞呈圆形后，将细胞吹打下来转移至15ml离心管，1000rpm离心5min，弃上清，加入1～2ml培基，混匀，取10μl加入细胞计数板进行细胞计数。根据细胞计数结果，将细胞稀释至5000个细胞/ml。

[0129] (4)将稀释好的细胞悬液加入96孔板，每孔加入细胞悬液200μl，96孔板最外一圈孔中加200μl Dank’s缓冲液，放入培养箱继续培养。

[0130] (5)待6～8h左右细胞贴壁后，每孔加入20μl MTT，继续培养4小时，小心吸弃孔内的培养上清液，每孔加入200μl DMSO，置于摇床上摇晃10min，在酶联免疫检测仪上选择490nm波长检测DMSO加样孔的吸光值，记录结果。之后每天在相同的时间点加MTT和DMSO进行吸光值检测，连续检测6天后进行统计学分析。

[0131] 实施例7：细胞transwell侵袭实验：

[0132] (1)基质胶准备：提前一天把冻存于-20℃的BD Matrigel胶置于4℃冰箱融化成液态，把稀释胶用的tip头、EP管置于-20℃过夜，这样第二天操作时Matrigel胶在铺胶时不会过快凝固；

[0133] (2)基质胶稀释：BD Matrigel胶：无血清培基＝1:8，即20μl基质胶加160μl 1640培基轻吹混匀；

[0134] (3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100μl，再沿边吸出80μl，依次铺好放入37℃培养箱里孵育2-3小时，当看到铺胶层为白色时，表明液体Matrigel胶已呈固态；

[0135] (4)消化转染24h后的细胞，用无血清培基洗2遍，然后使用无血清的培基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为每200μl中2万个细胞；

[0136] (5)向下层小室添加800μl含有20％FBS的1640培养基，放入小室时将24孔板倾斜45°角，以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡；

[0137] (6)每室加200μl计好数的细胞悬液到transwell上室内，将24孔板放回37℃培养箱中，根据细胞状态和细胞侵袭速度，孵育约24～48h。

[0138] (7)取出24孔板，用PBS或者D-hanks洗两遍，4％多聚甲醛浸洗10min，用清水洗3遍。

[0139] (8)染色：用0.1％的结晶紫滴加到transwell小室的底部，室温静置5-10min，用PBS清洗2-3遍，用棉签小心擦掉小室上面的基质胶；

[0140] (9)在24孔板中加入蒸馏水800μl，transwell上室中加入蒸馏水约200μl，然后在倒置显微镜下，任选5个不同的视野拍照，用image J软件进行计数和统计学分析差异的显著性。

[0141] 体外沉默circCDYL2的表达影响鼻咽癌的侵袭

[0142] 为了探究沉默circCDYL2后是否能够影响鼻咽癌的侵袭,我们又在三株细胞系中进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，利用Hiperfect试剂将circCDYL2ASO和NC(空白对照)瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circCDYL2的表达。在沉默了circCDYL2的鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中进行Transwell小室基质胶侵袭实验，结果显示，ASO组可在Transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少于NC组，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄5张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，沉默鼻咽癌细胞系中circCDYL2的表达,能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的侵袭能力(结果见图9)。

[0143] 体外过表达circCDYL2促进鼻咽癌细胞的侵袭

[0144] 我们在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，已观察过表达circCDYL2对细胞侵袭能力的影响。我们同样利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/circCDYL2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circCDYL2的表达水平及成环效率。在确定了circCDYL2过表达质粒的过表达良好效果后，我们将细胞接种到铺基质胶的Transwell小室中，发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的数目明显比空载组多，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄3张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，过表达鼻咽癌细胞系中circCDYL2的表达,能够促进鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的侵袭能力。通过正反两个方向证明，环状RNAcircCDYL2能够促进鼻咽癌细胞的侵袭(结果见图
10)。

[0145] 实施例8：细胞划痕愈合迁移实验：

[0146] (1)照细胞台：1000μl/10μl Tip头、高温高压灭菌的D-Hank’s，直尺、1000μl/10μl移液枪、marker笔等，用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟；

[0147] (2)待细胞长至50％～70％左右分别转染ASO和NC组或者转染质粒；

[0148] (3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕：将10μl枪头比着直尺垂直于6孔板底部干脆快速进行十字或井字划痕，不要倾斜，力度大小一致，以确保划痕宽度尽可能一致；

[0149] (4)吸弃培养液，用D-hanks轻轻洗涤3次，尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细胞；

[0150] (5)加入1％双抗2％胎牛血清的1640培养基；

[0151] (6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度，记为0h；

[0152] (7)将6孔板放回培养箱培养，间隔12h拍摄同一位置，记为12h；

[0153] (8)间隔24h时再拍相同位置，直到划痕愈合，整理所有的图片，并进行统计分析。

[0154] 体外沉默circCDYL2抑制鼻咽癌细胞的迁移

[0155] 利用Hiperfect试剂将ASO和NC瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circCDYL2的表达。在沉默了circCDYL2的鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中进行划痕实验，验证其对细胞迁移的影响。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于NC组，ASO组细胞的迁移能力明显减弱。划痕宽度差异明显,且具有统计学意义。以上结果显示,沉默鼻咽癌细胞系中circCDYL2的表达,能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的迁移能力(结果见图11)。

[0156] 体外过表达circCDYL2促进鼻咽癌细胞的迁移

[0157] 利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/has_circCDYL2过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2。在确定了circCDYL2过表达质粒的过表达良好效果后，我们在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2进行了细胞划痕愈合实验。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于空载pcDNA3.1(+)质粒组，pcDNA3.1/circCDYL2过表达质粒组细胞的迁移能力明显增强。划痕宽度差异较大,且具有统计学意义。以上结果显示,过表达鼻咽癌细胞系中circCDYL2的表达,能够促进鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的迁移能力。通过正反两个方向验证证明，circCDYL2可以促进鼻咽癌细胞的迁移(结果见图12)。