拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途转让专利
申请号 : CN201811613557.7
文献号 : CN109675014B
文献日 : 2020-09-01
发明人 : 王勇 , 王芙艳 , 蔡继峰 , 周亚春 , 陆小芳
申请人 : 中南大学
摘要 :
本发明提供一种拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途，所述拟肽化合物能够直接作用于沙眼衣原体HtrA蛋白，并能在10μM水平显著抑制沙眼衣原体在细胞内的发育，减小了沙眼衣原体包涵体的数量与面积，为沙眼衣原体感染治疗提供一种新的途径。
权利要求 :
1.一种拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途，其特征在于，所述拟肽化合物为如下结构式或其药学上可接受的盐：
2.根据权利要求1所述的拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途，其特征在于，所述拟肽化合物直接作用于沙眼衣原体HtrA蛋白，进而抑制沙眼衣原体在细胞内的发育。
3.根据权利要求1所述的拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途，其特征在于，所述拟肽化合物的浓度在10μM时仍能抑制沙眼衣原体在细胞内的发育。
说明书 :
拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药用途技术领域，具体涉及一种拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途。
背景技术
[0002] HtrA(High temperature requirement A)是高度保守的细菌丝氨酸蛋白酶，具有分子伴侣和蛋白酶功能，为蛋白质的质量控制装置。但是，与该家族其他蛋白酶不同，沙眼衣原体的HtrA可分泌进入宿主细胞。沙眼衣原体HtrA可识别多种底物序列，底物结合后，可诱导沙眼衣原体HtrA构象改变以及多聚化，从而激活酶的水解能力。目前尚无解析出的沙眼衣原体的HtrA蛋白结构。大肠杆菌的HtrA蛋白称为DegP，其蛋白质晶体结构已被解析，是由两个二聚体组成的六聚体。蛋白酶结构域形成“笼子”样的结构来固定HtrA蛋白多聚体。
[0003] 迄今，文献报道的沙眼衣原体HtrA抑制剂包括JO146(Front Cell Infect Microbiol.2013；3:100)，沙眼衣原体于42℃热激4小时后，JO146在50～100μM水平可抑制感染性原体的形成，但其在10μM水平对感染性原体的形成无抑制作用。
[0004] 文献报道用于可用于DPPIV/CD26的选择性转化，可用于高亲脂抗病毒药物家族[Journal of Medicinal Chemistry(2011),54(6),1927-1942]，但没有关于其抑制沙眼衣原体的相关报道。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途，其能够抑制沙眼衣原体的复制和包涵体数量。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种拟肽化合物在制备抑制沙眼衣原体细胞内生长药物中的用途，所述拟肽化合物为如下结构式或其药学上可接受的盐：
[0007]
[0008] 其中Q为O或NR10；
[0009] M为O或NR11；
[0010] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为氘、氢、烷基、羟基、环烷基、或芳基；所述烷基、环烷基或芳基可进一步任选地被氢、卤素、硝基、羟基、氨基单取代或相同或不同的多取代。
[0011] 进一步地，所述R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为氘、氢、C1-12烷基、羟基、C3-12环烷基、或C6-12芳基；所述烷基、环烷基或芳基可进一步任选地被氢、卤素、硝基、羟基、氨基单取代或相同或不同的多取代。
[0012] 进一步地，所述R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为氘、氢、C1-4烷基、羟基、C3-7环烷基、或苯基；所述烷基、环烷基或芳基可进一步任选地被氢、卤素、硝基、羟基、氨基单取代或相同或不同的多取代。
[0013] 进一步地，所述R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为氘、氢、甲基、乙基、正丙基、羟基、环丙烷基、环己烷基、或苯基；所述甲基、乙基、正丙基、羟基、环丙烷基、环己烷基和苯基可进一步任选地被氢、卤素、硝基、羟基或氨基单取代或相同或不同的多取代。
[0014] 进一步地，所述拟肽化合物的结构式如下：
[0015]
[0016] 进一步地，所述拟肽化合物直接作用于沙眼衣原体HtrA蛋白，进而抑制沙眼衣原体在细胞内的发育。
[0017] 进一步地，所述拟肽化合物的浓度在10μM时仍能抑制沙眼衣原体在细胞内的发育。
[0018] 本发明相对于现有技术，具有如下优点之处：
[0019] 本发明提供一种拟肽化合物能够直接作用于沙眼衣原体HtrA蛋白，并能在10μM水平显著抑制沙眼衣原体在细胞内的发育，减小了沙眼衣原体包涵体的数量与面积，为沙眼衣原体感染治疗提供一种新的途径。
附图说明
[0020] 图1为添加拟肽化合物A1后感染细胞内沙眼衣原体包涵体面积。
[0021] 图2添加化合物A1后感染细胞内沙眼衣原体包涵体数量。
[0022] 图3沙眼衣原体感染Hela229细胞化合物A1后的电镜图。图中的↑所指沙眼衣原体包涵体，放大倍数：5000×
具体实施方式
[0023] 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024] 此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0025] 1、根据大肠杆菌DegP蛋白质晶体结构同源模拟沙眼衣原体HtrA蛋白多聚体结构，该蛋白结构模型经NAMD软件进行能力最小化。
[0026] 2、通过电脑模拟多肽进入沙眼衣原体HtrA多聚体组成的分子伴侣后多肽与分子伴侣的相互作用情况，分析出沙眼衣原体HtrA的一组最适底物。根据最适底物的序列，设计一组沙眼衣原体HtrA抑制剂，并通过Autodock软件进行分子对接，分析新型抑制剂与沙眼衣原体HtrA的结合方式，筛选出最佳结构的HtrA抑制剂A1，即叔丁基((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-戊酰脯基-L-缬氨酸。
[0027] 实施例1
[0028] 拟肽化合物A1抑制沙眼衣原体繁殖的效果。将对数期生长状态良好的HeLa229于每孔1.5×105个细胞数种板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中常规培养24h后，用PBS洗两次后加入1mL含10％胎牛血清1640培养基，分别以沙眼衣原体菌液与完全培养基以1:200、1:400、1:600、1:800以及1:1000的比例加入沙眼衣原体的原体，24h后进行Hoechst染色。随机选取3个视野对细胞及包涵体计数，得到IFU(Inclusion-forming unit，包涵体形成单位)及MOI(multiplicity of infection，感染复制数，MOI＝IFU/细胞数)，用于优化沙眼衣原体最佳感染剂量。进而，以MOI＝0.2的L2血清型沙眼衣原体感染HeLa229细胞20h后，分别加入化合物A1浓度为10μM、100μM，并以添加二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)的沙眼衣原体感染细胞作为对照组。结果如图1～2所示。
[0029] 图1为添加拟肽化合物A1后感染细胞内沙眼衣原体包涵体面积。图从左至右依次为A1浓度为10μM时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体面积；A1浓度为100μM时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体面积；未添加化合物时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体面积；添加DMSO时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体面积(*表示P<0.05，**表示P<0.001)。
[0030] 图2为添加拟肽化合物A1后感染细胞内沙眼衣原体包涵体数量。图从左至右依次为A1浓度为10μM时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体数量；A1浓度为100μM时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体数量；未添加化合物时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体数量；添加DMSO时，沙眼衣原体感染的HeLa229细胞内的包涵体数量。包涵体数量单位为IFU(Inclusion-forming unit，包涵体形成单位)(**表示P<0.001)。
[0031] 实施例2
[0032] 拟肽化合物A1抑制沙眼衣原体形成正常的包涵体。
[0033] 图3为沙眼衣原体感染Hela229细胞化合物A1后的电镜图。图3可知，沙眼衣原体HtrA蛋白抑制剂导致小的包涵体不能成功融合成大的包涵体，沙眼衣原体感染Hela229细胞经10μM化合物A1作用后，有4个小的包涵体。
[0034] 拟肽化合物A1细胞毒实验。将生长对数期生长状态良好的Hela229细胞每孔5×3
10个Hella229细胞数，接种至96孔板，将细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中常规培养24h后，设置对照组(Hela229细胞+正常培养基)、A1浓度100μM+Hela229细胞、DMSO+Hela229细胞组。每组设置3个复孔，每孔总体积100μL，培养20h后向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养1h。再将96孔板置于酶标仪检测各孔在波长450nm的吸光度值。所测OD值与活细胞数量以及生长率呈正比。结果如表1所示。
10个Hella229细胞数，接种至96孔板，将细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中常规培养24h后，设置对照组(Hela229细胞+正常培养基)、A1浓度100μM+Hela229细胞、DMSO+Hela229细胞组。每组设置3个复孔，每孔总体积100μL，培养20h后向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养1h。再将96孔板置于酶标仪检测各孔在波长450nm的吸光度值。所测OD值与活细胞数量以及生长率呈正比。结果如表1所示。
[0035] 表1化合物A1细胞毒实验结果
[0036]
[0037] CCK-8细胞毒实验显示各组之间差异均无统计学意义，表明化合物A1对细胞没有毒性作用。
[0038] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。