一种以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法

摘要

本发明提供了一种以HBc‑VLP为载体的装载系统的制备方法，所述制备方法包括：将HBc‑VLP和负荷物加入到缓冲溶液中，经过热处理后得到所述装载系统；本发明提供的制备方法利用HBc‑VLP热稳定性以及可逆膨胀的特点，采用热处理的方式，对HBc‑VLP进行热敏膨胀，使得亚基与亚基之间的纳米孔道打开，为溶液中的药物提供进入颗粒内部的通道，从而实现对药物的装载，该方法既能保持载体HBc‑VLP接近100％的收率，保持其结构与生物活性，还能提高药物的装载比例，操作简单，可重复性高，生产成本低，适用于大规模工业生产，具有较大的实际应用价值和工业推广前景。

权利要求

1.一种以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将HBc-VLP和负荷物加入到缓冲溶液中，经过热处理后得到所述装载系统；

所述HBc-VLP和负荷物的质量比为1:0.5～2；

所述热处理的温度为75℃～85℃，所述热处理的时间为80min～100min；

所述缓冲溶液中还包括添加剂，所述添加剂为氯化钠、硫酸铵或磷酸钠中的任意一种或至少两种的组合；

所述添加剂在缓冲溶液中的浓度为0.01mol/L～2mol/L。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述HBc-VLP由表达系统经过表达和纯化制备得到。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、动植物表达系统、昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表达系统为大肠杆菌表达系统。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法包括超高速密度梯度离心法和/或色谱层析法。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为色谱层析法。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述负荷物包括多肽、蛋白质、核酸、糖、脂类、中药、光敏剂、造影剂或化学药物中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述热处理的方式包括水浴加热、油浴加热、沙浴加热、蒸汽浴加热、微波加热或电磁加热中的任意一种或至少两种的组合。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值为5.0～9.0。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述热处理后还包括分离纯化。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的方法包括透析、凝胶过滤层析或膜分离中的任意一种或至少两种的组合。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的方法为凝胶过滤层析。

14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：利用表达系统表达和纯化得到HBc-VLP，然后将质量比为1:0.5～2的HBc-VLP和负荷物加入到pH值为5.0～9.0、包含浓度为0.01～2mol/L添加剂的缓冲溶液中，经过温度为75℃～85℃热处理80min～100min后，分离纯化得到所述装载系统。

说明书

一种以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及一种以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法。

背景技术

[0002] 治疗人类疾病的大部分药物，包括单纯的抗原蛋白或小分子化学药物都存在体内半衰期短、注射后会被快速地降解代谢等问题，使得机体免疫系统难以被有效地激活或药物难以到达特定部位。加大剂量的策略虽然可以提高免疫应答或治疗效果，但同时存在安全隐患和副作用问题。开发合适的药物装载系统是解决上述问题的有效途径。药物装载系统具有多个优点：首先，利用装载系统可实现药物的靶向、提高药物的利用度，并降低药物不良副作用的风险和允许更高剂量；其次，通过药物的装载系统，可以实现药物的控释和缓释；对于小分子药物，例如多肽药物、核酸药物等在机体内半衰期短，容易被清除，通过药物装载系统，可以有效的提高药物的稳定性；对于预防性的药物，例如疫苗来讲，通过将抗原决定簇或者是免疫药物与载体形成装载系统后，可以提高其免疫原性，引起更好的免疫效果。

[0003] 在现有的药物装载系统中，乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis B virus core antigen，HBcAg)是最具有应用前景的载体之一。乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBc-VLP)是由180个或240个核心蛋白亚基自组装构成的正二十面体对称的颗粒结构，单个核心蛋白亚基由183-185个氨基酸残基组成，先组装成同源二聚体，二聚体再进一步多聚化最终形成HBc-VLP。HBc-VLP作为一种颗粒结构的蛋白，不仅自身具有很强的免疫原性，而且可以作为疫苗载体，在其C端、N端以及免疫原区(MIR)均可以插入外源片段而不影响其组装的正确性；另一方面，HBc-VLP由于缺少病毒的核酸不能进行自主复制，安全性能高，其中空结构
8600nm3，可以有效装载药物，形成药物的递送系统。HBc-VLP稳定性好；容易规模化制备；既可以提高预防性药物或疫苗的免疫保护效果，也可以提高治疗性药物的稳定性和生物利用度，实现靶向控释或缓释；另外，HBc-VLP作为一种蛋白类的载体，生物相容性好，通用性强。

[0004] 目前已有多种以HBc-VLP为载体的药物装载系统的制备方法。其中最广泛的方法是化学偶联或基因融合表达将蛋白质负荷物装载在VLP上。CN106279379A公开了一种免疫原HM4-M2e的制备方法，即通过SMCC交联的方法将HBc-VLPs与流感病毒基质蛋白M2e进行化学偶联，制备流感疫苗的有效成分。或者可通过基因工程的方法，在其C端、N端以及免疫原区可以插入长达300个氨基酸的序列而不影响组装的正确性。有研究者利用HBc-VLP内部8600nm3的中空体积，在C端基因融合了240个金黄色葡萄球菌核酸酶，并包裹在颗粒的内部(G.Beterams,B.Bottcher,M.Nassal,Packaging of up to 240subunits of a 17kDa nuclease into the interior of recombinant hepatitis B virus capsids,Febs Letters,481(2000)169-176)。另外，还可以利用HBc-VLP自组装的特性，在体外利用尿素将HBc-VLP解聚，之后去除裂解条件，亚基在自组装的过程中将货物装载到颗粒的内部，货物既可以以游离的形式存在于颗粒内部，如绿色荧光蛋白(GFP)作为一种指示蛋白以游离的形式装载到颗粒的内部用以研究HBc-VLP自组装的特性(K.W.Lee,W.S.Tan,Recombinant hepatitis B virus core particles:Association,dissociation and encapsidation of green fluorescent protein,Journal of Virological Methods,151(2008)172-
180.)。也可以以静电作用力、亲和力、疏水相互作用等某种或多种相互作用与HBc-VLP连接。如寡核苷酸(S.Song,K.Zhang,H.You,J.Wang,Z.Wang,C.Yan,F.Liu,Significant anti-tumour activity of adoptively transferred  T cells elicited  by 
intratumoral dendritic cell vaccine injection through enhancing the ratio of CD8+T cell/regulatory T cells in tumour,Clinical and Experimental Immunology,
162(2010)75-83)、SiRNA(J.Kong,X.Liu,J.Jia,J.Wu,N.Wu,J.Chen,F.Fang,Pokemon siRNA Delivery Mediated by RGD-Modified HBV Core Protein Suppressed the Growth of Hepatocellular Carcinoma,Human Gene Therapy Methods,26(2015)175-
180)、DOX(R.Biabanikhankahdani,N.B.M.Alitheen,K.L.Ho,W.S.Tan,pH-responsive Virus-like Nanoparticles with Enhanced Tumour-targeting Ligands for Cancer Drug Delivery,Scientific Reports,6(2016))等依靠静电相互作用与蛋白结合，这样可以有效减少储存过程中小分子的泄露另外，还有研究者充分利用HBc-VLP易改造的特性，来提高其装载效率。通过基因改造在HBc-VLP的C端引入组氨酸序列，实现了对磁性颗粒Fe3O4高效率的装载(L.Shen,J.Zhou,Y.Wang,N.Kang,X.Ke,S.Bi,L.Ren,Efficient 
Encapsulation of Fe3O4Nanoparticles into Genetically Engineered Hepatitis B Core Virus-Like Particles Through a Specific Interaction for Potential Bioapplications,Small,11(2015)1190-1196)。近期，相同的研究组又在HBcAg的C端基因融合引入了亲脂性肽段NS5A，利用疏水性将DOX连接在C端，颗粒组装的过程中即可实现装载(W.Shan,D.Zhang,Y.Wu,X.Lv,B.Hu,X.Zhou,S.Ye,S.Bi,L.Ren,X.Zhang,Modularized peptides modified HBc virus-like particles for encapsulation and tumor-targeted delivery of doxorubicin,Nanomedicine Nanotechnology Biology and Medicine,14(2018)725-734)。

[0005] 以上的装载方法都存在一些缺点。依靠基因融合或化学偶联的方法对药物进行装载，一般情况下药物会呈现在颗粒的表面，而且对药物的要求高，比如融合装载的只能是蛋白或多肽类药物，长度也有一定的限制；而化学偶联则需要药物有合适的偶联位点，工艺也较复杂；关键的是，这两种方式装载效率低，工艺复杂，在实际应用中具有较多限制。通过HBc-VLP颗粒的解聚再重新组装的装载系统在装载过程中会对HBc-VLP亚基造成结构损伤，解聚后的亚基难以再重新自组装成VLP结构，从而造成回收率极低的问题。

[0006] 因此，在本领域中需要寻找一种简便高效，既能提高HBc-VLP收率，同时具有高药物装载比例的制备工艺。

发明内容

[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法，以解决目前的方法存在装载率低、工艺复杂、应用受限制的问题。

[0008] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0009] 本发明提供了一种以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法，所述制备方法包括：将HBc-VLP和负荷物加入到缓冲溶液中，经过热处理后得到所述装载系统。

[0010] 本发明提供的制备方法，从HBc-VLP(乙肝核心抗原病毒样颗粒)的稳定性与结构着手。首先通过对HBc-VLP的分子结构进行分析，发现亚基与亚基之间存在多对二硫键，稳定性好，可以耐受高温、高盐等极端条件。另外发现在一定温度下处理一定的时间，HBc-VLP会发生可逆性膨胀，亚基与亚基间的纳米孔道也随之开或关，因此可充分利用HBc-VLP的热敏特性和孔道的可控开关，保证HBc-VLP完整颗粒结构的前提下，将待装载的药物装载到颗粒的内部，达到高效运载的目的。相比于目前采用的基因融合或化学偶联的装载方法，操作简单，装载率高，可实现对多种不同种类药物的高效装载；相比目前的裂解-重组方法，耗时短，操作方便，装载效率高，HBc-VLP回收率高。

[0011] 本发明利用热处理得到以HBc-VLP为载体的药物运载体系，既能提高药物的装载比例，而且不会造成载体蛋白损失(普通的蛋白在热处理状态下会造成损失)，甚至能够回收游离的未被装载的药物，提升生产效率，降低生产成本，适用于大规模工业生产。时间短，效率高，工艺稳定，重复性好，易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值和推广前景。

[0012] 优选地，所述HBc-VLP由表达系统经过表达和纯化制备得到。

[0013] 本领域技术人员可利用常规的基因工程技术制备得到HBc-VLP，一般的步骤为构建质粒、基因的导入、扩增培养、蛋白的表达以及目标产物的收集纯化即可得到HBc-VLP。

[0014] 其中，质粒构建与转化时：采用全长的乙肝核心抗原的核苷酸序列，具体如SEQ ID NO.1所示：

[0015] ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGC GTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG.

[0016] 其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，长度为185aa：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.

[0017] 优选地，所述表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、动植物表达系统、昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的任意一种或至少两种的组合；优选大肠杆菌表达系统。

[0018] 优选地，所述纯化的方法包括超高速密度梯度离心法和/或色谱层析法；优选为色谱层析法。

[0019] 其中蛋白经过表达后，收集菌体破碎的上清液，HBc-VLP的纯化方法优选为色谱层析法，具体为将上清液加入到装有丁硫基(Butyl-S)疏水作用层析填料的层析柱中，按照色谱法的常规操作平衡、上样、淋洗、洗脱以及填料的再生等步骤，将产物洗脱收集。

[0020] 优选地，所述负荷物包括多肽、蛋白质、核酸、糖、脂类、中药、光敏剂、造影剂或化学药物中的任意一种或至少两种的组合。

[0021] 本发明所述多肽或蛋白质包括B细胞抗原表位肽、T细胞抗原表位肽、重组人胰岛素、重组人生长激素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白、肌红蛋白、超氧化物岐化酶、L-天门冬酰胺酶、阿糖苷酶、重组链激酶、葡激酶、红细胞生成素、重组人血管内皮抑制素、干扰素、白细胞介素11、白细胞介素-2、重组人粒细胞集落刺激因子、重组改构人肿瘤坏死因子、重组人表皮生长因子、重组人脑利钠肽中的任意一种或至少两种的组合。

[0022] 本发明所述核酸包括RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、miRNA antagomir、miRNA、核酶或siRNA中的任意一种或至少两种的组合。

[0023] 本发明所述糖包括壳寡糖、荚膜多糖、香菇多糖、灵芝多糖、猪苓多糖、虫草多糖、木瓜多糖或几丁多糖中的任意一种或至少两种的组合。

[0024] 本发明所述脂类包括脂肪类，例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十炭五烯酸或DHA等；磷脂类，例如卵磷脂或脑磷脂等；糖苷脂类，例如神经节苷脂；萜式脂类，例如如鲨烯；固醇及类固醇类，例如胆固醇、谷固醇、胆酸或胆汁酸等；也包括其他类型的脂类，例如可以是胆红素、辅酶Q10或人工牛黄等等。

[0025] 本发明所述光敏剂包括血卟啉衍生物、二血卟啉醚、5-氨基酮戊酸、间-四羟基苯基二氢卟酚、初卟啉锡、亚甲基兰、亚甲苯兰、苯卟啉衍生物、苯并卟啉衍生物单酸、酞青类、得克萨卟啉、n-天门冬酰基二氢卟酚、金丝桃素、血啉甲醚或酞青类中的任意一种或至少两种的组合。

[0026] 本发明所述造影剂包括碘制剂、硫酸钡、碘苯六醇、碘普罗胺、碘必乐或碘苯酯中的任意一种或至少两种的组合。

[0027] 本发明所述化学药物包括DOX、盐酸多柔比星、紫杉醇、顺铂、盐酸米托蒽醌、硫酸长春新碱、5-氟尿嘧啶、博来霉素、盐酸阿糖胞苷或绿原酸中的任意一种或至少两种的组合。

[0028] 本发明所述中药可以是天然药物、中草药等物质，也可以是其特有的活性成本。

[0029] 所述负荷物不仅局限于上述所列列举的种类，任何可装载进此系统的物质，均可作为负荷物。

[0030] 优选地，所述热处理的方式包括水浴加热、油浴加热、沙浴加热、蒸汽浴加热、微波加热或电磁加热中的任意一种或至少两种的组合。

[0031] 本发明热处理的方式可选择性较多，任何可达到对混合物加热的效果均可以作为本发明热处理的方式。

[0032] 优选地，所述热处理的温度为40℃～95℃，例如可以是40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃等。优选为45℃～85℃。

[0033] 本发明中，温度低于30℃不会对HBc-VLP结构产生影响，但是无法扩增HBc-VLP亚基间的孔道；若温度过大则可能造成HBc-VLP颗粒结构完全被破坏，蛋白发生变性，无法继续装载药物。

[0034] 优选地，所述热处理的时间为10min～300min，例如可以是10min、50min、80min、100min、120min、150min、180min、200min、220min、250min、280min或300min等。

[0035] 优选地，所述HBc-VLP和负荷物的质量比为1:0.1～10，例如可以是1:0.1、1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1、1:1.5、1:2、1:2.8、1:3.2、1:4.1、1:5.3、1:6.7、1:7.9、1:8.9、1:9.6或1:
10等等；优选为1:0.5～2。

[0036] 优选地，所述缓冲溶液包括醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种。

[0037] 优选地，所述缓冲溶液的pH值为5.0～9.0，例如可以是5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0等。

[0038] 优选地，所述缓冲溶液为pH值5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液、pH值5.5的20mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液、pH值6.5的20mM磷酸盐缓冲液、pH值7.4的20mM磷酸盐缓冲液或pH值8.5的20mMTris-HCl缓冲溶液中的任意一种，优选为pH值7.4的20mM磷酸盐缓冲液。

[0039] 优选地，所述缓冲溶液中还包括添加剂。

[0040] 在反应过程中加入添加剂可以抑制HBc-VLP与药物混合时产生聚集沉淀，同时可以辅助温度用于HBc-VLP孔道的扩增，提升装载效率。

[0041] 优选地，所述添加剂包括硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化铵、磷酸钾、磷酸钠、蔗糖、甘油、聚乙二醇、精氨酸、甘氨酸、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为氯化钠。

[0042] 优选地，所述添加剂在缓冲溶液中的浓度为0.01～2mol/L，例如可以是0.01mol/L、0.05mol/L、0.08mol/L、0.15mol/L、0.22mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L或2mol/L等。

[0043] 优选地，所述热处理后还包括分离纯化。

[0044] 优选地，所述分离纯化的方法包括透析、凝胶过滤层析或膜分离中的任意一种或至少两种的组合；优选为凝胶过滤层析。

[0045] 作为优选，凝胶过滤层析利用Sephedax G25脱盐层析来实现，脱盐的方法为：将热处理后的产物直接上样，收集蛋白洗脱峰，采用280nm波长检测，得到装载负荷物的HBc-VLP和游离的药物。

[0046] 其中，脱盐过程中使用的缓冲液为pH值7.4的20mM PB缓冲液。

[0047] 作为优选技术方案，所述制备方法包括以下步骤：利用表达系统表达和纯化得到HBc-VLP，然后将质量比为1:0.1～10的HBc-VLP和负荷物加入到pH值为5.0～9.0、包含浓度为0.01～2mol/L添加剂的缓冲溶液中，经过温度为40℃～95℃热处理10min～300min后，分离纯化得到所述装载系统。

[0048] 相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

[0049] (1)本发明提供的制备方法，充分利用HBc-VLP的热敏可逆膨胀性以及孔道可控开关性，采用加热的装载方法，能保持载体HBc-VLP接近100％的收率，在保证HBc-VLP完整颗粒结构的前提下，将药物装载到HBc-VLP颗粒的内部，能显著提高的装载系统的收率及药物装载量，以DOX为例，其装载量最高可达到5000mol/mol HBc-VLP以上；而且还能降低部分负载物的毒副作用。

[0050] (2)本发明提供的制备方法，操作步骤少，仅仅需要一步热处理即可实现装载；时间短，效率高，工艺稳定，重复性好，易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值和推广前景。

[0051] (3)本发明提供的制备方法，为相似类型的产品提供了一种新的装载策略，为相关产品的生产提供了一种具有通用性的生产平台，大大拓展了病毒样颗粒在纳米载体领域的应用，具有较高的经济价值和社会效益。

附图说明

[0052] 图1是本发明实施例1中通过SDS-PAGE表征制备的HBc-VLP的电泳图，其中M为marker，1为HBc-VLP细胞破碎后的上样液泳道，2为疏水层析后的HBc-VLP纯品泳道。

[0053] 图2A为本发明实施例2中HBc-VLP纯品与DOX的混合液加热之前在紫外280nm和482nm检测的图。

[0054] 图2B为本发明实施例2中HBc-VLP纯品与DOX的混合液反应后在紫外280nm和482nm检测的图。

[0055] 图3是本发明实施例2中制备的HBc-VLP装载DOX后的透射电镜图(标尺100nm)。

[0056] 图4是本发明通过高效液相法检测DOX的482nm处特征吸收对比传统法与本发明方法的装载效率曲线图。

[0057] 图5是本发明实施例4中制备的以HBc-VLP为载体的HBc+DOX在抑瘤实验中不同组小鼠肿瘤大小的检测图，1为PBS处理组，2为HBc-VLP处理组，3为游离DOX处理组，4为经过热装载法制备的HBc+DOX处理组。

[0058] 图6A为本发明实施例5中通过多角度激光散射表征制备的HBc-VLP纯品的分子量图。

[0059] 图6B为本发明实施例5中通过多角度激光散射表征制备的装载NP后的HBc-VLP分子量图。

具体实施方式

[0060] 下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

[0061] 实施例1

[0062] 本实施例通过以下制备HBc-VLP纯品

[0063] 质粒构建与转化：采用全长的乙肝核心抗原的核苷酸序列，SEQ ID NO.1:

[0064] ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGC GTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG.

[0065] 其氨基酸序列SEQ ID NO.2：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.

[0066] 通过PCR扩增，将扩增出的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBc并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。

[0067] 菌种活化：使用LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。灭菌后，冷却至低于50℃，加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL，将大约25mL培养基倒入无菌的培养皿中放置冷却。用涂布棒将少量的菌液(转入质粒后的菌液)在凝固后的平板表面涂布，然后在培养箱中37℃下培养直至长出单菌落(一般12h即可)。

[0068] 一级扩增培养：从平板上用无菌牙签挑选一株单菌落，加入到含50mL LB液体培养基的菌锥形瓶中，37℃下200rpm下培养12小时，获得活化扩增后的工程菌菌液。

[0069] 二级扩增培养：按1％的接种量加入到含500mL LB培养基的菌锥形瓶中，37℃下200rpm扩增培养培养至OD600达到0.5-1.0。

[0070] 目的蛋白诱导表达：用终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，37℃下200rpm继续培养3.5h。

[0071] 菌体的收集与破碎：发酵液经Hitachi高速离心机4℃，4000rpm离心30min后收集菌体。按照质量体积比1:10的比例(即1g湿菌体重悬于10mL破碎液)将菌体重悬于破碎缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9)中，冰浴超声破碎菌体。超声功率为300W，超声2s后停3s，超声时间为60min。10000rpm，4℃离心菌体破碎液30min后弃去细胞碎片等沉淀，得到HBc-VLP的上样液。

[0072] 纯化：将HBc-VLP的上样液调节电导至65mS/cm，pH为pH 7.4左右，进料到电导65mS/cm的含有硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)平衡的Butyl-S Sepharose 6FF的疏水层析柱(GE Healthcare，15cm×1.6cm I.D.)中，进料后经继续淋洗，然后使用电导为1mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.4)洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生。如图1所示，为经过疏水层析纯化之后的HBc-VLP的SDS-PAGE检测图，从灰度扫描可以判断HBc-VLP的纯度高达98％，可以作为载体使用。

[0073] 实施例2

[0074] 本实施例采用以下方法制备以HBc-VLP为载体装载盐酸阿霉素DOX

[0075] 配制DOX母液浓度为2mg/mL，将DOX母液2.5mL加入至10mL浓度为0.5mg/mL的HBc-VLP溶液(含有0.15M氯化钠的20mM磷酸缓冲液，pH 7.4)中混匀，使得HBc-VLP与DOX的质量比为1:1，70℃加热90min，后停止加热，自然冷却至室温，样品10000rpm离心10min，上清进一步利用Sephedax G25脱盐柱去除游离的DOX，通过检测280nm和482nm波长的吸收收集产品，得到以HBc-VLP为载体的装载DOX的装载系统。

[0076] 产品测定：

[0077] 收集的样品通过紫外/可见分光光度计检测280nm和482nm吸收值。图2A为HBc-VLP纯品与DOX的混合液在加热之前在280nm和482nm的紫外吸收，其中12.9min左右是HBc-VLP的蛋白峰，具有很强的280nm吸收，而没有482nm；当经过热装载DOX之后，如图2B所示，在目的峰处出现了较强的482nm吸收，说明通过加热的方式DOX成功进入HBc-VLP的内部实现了有效装载。

[0078] 另外，图3为透射电镜检测热装载DOX之后HBc-VLP颗粒的形态，发现其依然保持完整的颗粒结构，说明加热装载的方式不会对HBc-VLP造成结构上的影响。

[0079] 对比例1

[0080] 本对比例采用传统的解聚-重组装方法装载DOX制备HBc-VLP为载体的装载系统[0081] 将HBc-VLP纯品(10mL，0.5mg/mL)在解聚溶液(6M urea，150mM NaCl，50mM Tris-HCl)中室温孵育3小时，之后加入浓度为2mg/mL的DOX溶液2.5mL，使得DOX终浓度为0.4mg/mL，最终HBc-VLP与DOX的质量比为1:1，室温孵育1小时。将样品置于透析缓冲液中(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，10％甘油，1％甘氨酸，pH 8.0)在4℃过夜重组。样品10000rpm离心10min，上清进一步利用Sephedax G25脱盐柱去除游离的DOX，通过检测280nm和482nm波长的吸收收集HBc-DOX样品。

[0082] 回收率和装载效率测定：

[0083] 采用分光光度计检测法对比较实施例2的方法以及对比例1中传统的解聚-重组装方法装载法中HBc-VLP的回收率以及DOX装载效率。

[0084] 精密称取阿霉素5mg，用去离子水溶解后定容至1mL，即得5mg/mL阿霉素标准储备液。后将标准储备液用去离子水稀释至不同浓度，配制一定浓度梯度的阿霉素溶液。紫外分光光度计检测不同浓度梯度的阿霉素溶液在482nm的吸光度值，根据吸光度值与阿霉素的浓度绘制吸光度-浓度标准曲线：y1＝0.0173x1+0.0123，R2＝0.9992，其中y1为DOX在482nm的吸光度值，x1为DOX的浓度μg/mL。另外，同时测定相应浓度梯度的阿霉素溶液在280nm的2
吸光度值绘制吸光度-浓度标准曲线：y2＝0.0147x2+0.0224，R ＝0.9996，其中y2为DOX在
280nm的吸光度值，x2为DOX的浓度μg/mL。

[0085] 使用Bradford法确定HBc-VLP的浓度，初始浓度为0.5mg/mL，作为母液。将其用磷酸盐缓冲液稀释至不同的浓度梯度，利用紫外分光光度计检测各浓度HBc-VLP在280nm的吸2
光度值，绘制吸光度-浓度标准曲线：y3＝0.0062x3+0.0094，R ＝0.9999，其中y3为HBc-VLP在280nm的吸光度值，x3为HBc-VLP的浓度μg/mL。

[0086] 阿霉素在482nm具有特征吸收，且在280nm也存在一定的吸收；而蛋白质只在280nm具有吸收，在482nm没有吸收。因此，可以使用标准曲线法测定HBc-VLP中阿霉素载量。根据吸光度叠加原理，计算得到HBc-VLP的量，从而计算HBc-VLP中阿霉素的载药比例。具体公式计算如下，其中HBc-VLP以及DOX的分子量分别为5112kDa和579.9Da。

[0087] A280(总)＝A280(HBc)+A280(Dox)

[0088] A482(总)＝A482(Dox)

[0089] N＝CDox*MHBc/(CHBc*MDox)

[0090] 在HBc-VLP和DOX终浓度均为0.15mg/mL，即质量比1:1的情况下，70℃加热90min，HBc-VLP的收率为100％，每个HBc-VLP颗粒中能够装载5160个DOX分子。

[0091] 而相同的DOX和HBc-VLP浓度，利用尿素裂解再自组装形成的HBc-VLP仅为初始含量的52.13％，损失了接近一半的蛋白，而且在HBc-VLP正确组装体的吸收峰前面出现了聚集峰，说明再重组后的颗粒不仅回收率低，而且结构不均一。图4为两种方法装载后的DOX的482nm吸收值，两者出峰均为12.9min，与HBc-VLP纯品的280nm出峰位置一致，而蛋白在
482nm没有吸收，说明热装载法和传统尿素法都成功实现了对DOX的装载，但经计算，传统的尿素法装载DOX的含量较低，仅为热装载法的21.8％。

[0092] 上述结果表明本发明的装载方法相比现有的尿素裂解装载方法具有显著提高的VLP回收率及药物装载量。

[0093] 实施例3

[0094] 本实施例测定热处理条件对于装载系统的装载量的影响

[0095] 在利用热包载法的过程中，考察了HBc-VLP与DOX的比例，加热温度以及时间对装载率的影响。其中，加热的温度考察范围为40℃～95℃，热处理的时间为10min～300min，HBc-VLP载体与药物的质量比为1:0.1～10。

[0096] 首先对加热温度和加热时间进行了测定。具体地，固定HBc-VLP的浓度为0.4mg/mL，DOX浓度为300μg/mL，设置40℃、50℃、60℃、70℃、80℃以及95℃，六个温度，分别加热，间隔10min取样测定DOX的装载效率，表1所示为不同加热温度下的最大装载量以及所需时间。从表1可以发现，当温度大于60℃时，HBc-VLP装载DOX的量显著增加，同时，达到装载率所需时间也显著缩短，而温度继续提高，装载效率没有明显增加。最优的装载温度为70-80℃，加热时间为90min。

[0097] 表1

[0098]

[0099]

[0100] 进一步，确定70℃加热90min的装载条件，固定HBc-VLP的浓度为0.4mg/mL，考察了不同DOX的浓度对装载效率的影响，如表2所示，从表2中可以看出，DOX浓度在0.2～0.8mg/mL范围内，也就是HBc-VLP载体与DOX的质量比为1:0.5～2范围内装载量较高，其中两者质量比1:1时，可达到最大装载量。

[0101] 表2

[0102]

[0103] 实施例4

[0104] 本实施例采用尾静脉注射法检测本发明制备的装载DOX的装载系统的抑瘤效果。

[0105] 选取36只Balb/c裸鼠，随机分成4组，每组9只，前肢右腋皮下注射5×106个MCF7细胞。当肿瘤体积生长到100～200mm3时，开始给药。每隔两天给药一次，分别为对照PBS(200μL,pH 7.2)，游离DOX、HBc-DOX(DOX计量:2mg/kg的小鼠体重)以及HBc-VLP(用量与上述蛋白相同)。开始给药时记为0天，每次给药前3小时用电子游标卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(W)，计算肿瘤体积V＝L×W2/2。

[0106] 注射PBS或单纯的HBc-VLP的实验组，肿瘤体积迅速增大，初次静注21天后，肿瘤体积分别为1936mm3和1896mm3，而用游离DOX可以明显抑制小鼠体内肿瘤的生长，小鼠肿瘤平均体积为1502mm3。与此相比，当DOX药物被HBc-VLP装载之后，21天较对照组，抑瘤率能够达到69％。图5直观的说明了不同处理组小鼠肿瘤的大小。更重要的是，PBS、HBc-VLP以及HBc-DOX组小鼠的平均体重都比较平稳，有略微增加的趋势，而游离的DOX组，体重呈现明显下降的趋势，体重下降了大约12.3％，说明游离DOX具有一定的毒副作用。

[0107] 本实施例表明采用本发明的方法制备的HBc-VLP装载DOX系统不仅能降低DOX的毒副作用，还具有增强的抑瘤效果。

[0108] 实施例5

[0109] 本实施例采用实施例2的方法制备以HBc-VLP为载体的流感疫苗。

[0110] 配制3mg/mL的NP多肽抗原溶液，取500mL加入10mL的HBc-VLP(0.2mg/mL)溶液中混合均匀，缓冲液为pH为7.0的20mM磷酸钠缓冲溶液，添加剂为150mM NaCl，将混合溶液在60℃温度下进行高温处理50min，后取出冷却至室温。利用Sephedax G25脱盐，所用缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0。将冷却后的产物直接上样，收集洗脱峰，采用280nm和214nm双波长检测，收集HBc-VLP洗脱峰即热装载法制备的流感疫苗，并且将未被装载的NP多肽分离收集。

[0111] 制备的流感疫苗装载NP的数量由多角度激光散射测定分子量计算得到。具体地，采用TSK G5000PWXL色谱柱(300×7.8mm，I.D.，孔径100nm)，流动相为50mM磷酸缓冲液(pH 6.8)。进样体积为100μL，流速设定0.5mL/min，UV检测器的设置检测波长为260nm和280nm。
高效液相色谱分析连接多角度激光散射仪(MALLS，DAWN EOS，λ＝690nm，Wyatt Technology Corp.，USA)及示差检测器(RI,OPTILAB DSP，Wyatt Technology Corp.，USA)，样品依次经过UV、MALLS和RI检测器采集信号。样品相对分子量通过 6.1软件(Wyatt 
Technology，USA)计算获得。如图6A和图6B所示，图6A为测得的HBc-VLP的分子量，5112kDa，图6B图为装载NP后形成的HBc+NP的分子量，为7049kDa，而一个NP多肽的分子量为
1.888kDa，所以计算可得每个HBc-VLP分子装载(7049-5112)/1.888＝1026个NP分子。

[0112] 实施例6

[0113] 本实施例采用以下方法制备以HBc-VLP为载体装载壳寡糖

[0114] 配制壳寡糖母液浓度为0.2mg/mL，将壳寡糖母液2.5mL加入至10mL浓度为0.5mg/mL的HBc-VLP溶液(含有0.15M硫酸铵、pH值5.5的20mM醋酸-醋酸钠缓冲溶液)中混匀，使得HBc-VLP与壳寡糖的质量比为1:0.1，40℃加热300min，后停止加热，自然冷却至室温，样品10000rpm离心10min，上清进一步利用Sephedax G25脱盐柱去除游离的壳寡糖，通过检测
280nm和214nm波长的吸收收集产品，得到以HBc-VLP为载体的装载壳寡糖的装载系统。

[0115] 实施例7

[0116] 本实施例采用以下方法制备以HBc-VLP为载体装载光敏剂吲哚箐绿ICG

[0117] 配制吲哚箐绿ICG母液浓度为1mg/mL，将吲哚箐绿ICG母液2.5mL加入至10mL浓度为0.5mg/mL的HBc-VLP溶液(含有0.15M磷酸钠、pH值8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液)中混匀，使得HBc-VLP与ICG的质量比为1:0.5，95℃加热10min，后停止加热，自然冷却至室温，样品10000rpm离心10min，上清进一步利用Sephedax G25脱盐柱去除游离的光敏剂，通过检测280nm和214nm波长的吸收收集产品，得到以HBc-VLP为载体的装载ICG的装载系统。

[0118] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的以HBc-VLP为载体的装载系统的制备方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。