一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用

摘要

本发明公开了一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用，所述人胸膜间皮细胞恶性转化株分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：MCN‑MeT‑5A，保藏号为：C2018124。本发明人胸膜间皮细胞恶性转化株由人胸膜间皮细胞(MeT‑5A)经MWCNT多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种人胸膜间皮细胞恶性转化株，其特征在于，分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：MCN-MeT-5A，保藏号为：CCTCC NO:C2018124。

2.如权利要求1所述人胸膜间皮细胞恶性转化株的子代细胞。

3.如权利要求1所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型中的应用，其中，所述应用为非疾病诊断或治疗为目的。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述致癌物为多壁碳纳米管，其中，所述应用为非疾病诊断或治疗为目的。

5.如权利要求1所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在作为恶性间皮瘤发生机理研究的细胞模型中的应用，其中，所述应用为非疾病诊断或治疗为目的。

6.如权利要求1所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在提取恶性间皮瘤特异性肿瘤标志物中的应用，其中，所述应用为非疾病诊断或治疗为目的。

7.如权利要求1所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在筛选或评估治疗恶性间皮瘤药物中的应用，其中，所述应用为非疾病诊断或治疗为目的。

说明书

一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学和肿瘤学技术领域，特别是涉及一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用。

背景技术

[0002] 多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNT)是目前最常用的纳米材料之一，在工业制造、纳米技术和生物医学等各个领域得到广泛应用。但是伴随着MWCNT在多个领域的推广使用，MWCNT越来越多的以各种不同方式进入环境和生物体内并蓄积起来，比如生产MWCNT及其制品时存在职业接触；环境中的理化因素变化如pH值、紫外线照射等改变原有产品中MWCNT 的性质，使得不易逸散的MWCNT脱落下来，增加了进入生物体的机会。MWCNT 具有生物持久性和亲脂性特点，很容易在动植物中存留下来，随着生物链传递，最终危害人群健康。MWCNT在医药领域用途广泛，如用于疾病治疗、药物转运等，MWCNT产品则通过消化道、静脉等途径蓄积于体内。MWCNT可穿越血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等其他材料难以穿越的屏障，与不同的器官组织产生特殊的毒性。

[0003] 很多研究已经发现MWCNT可以诱发实验动物损伤及细胞毒作用。MWCNT 的生物持久性和高纵横比的物理特征与石棉很相似，可以呈现出与石棉类似的毒性效应，甚至毒性更大，能诱发肺癌或者间皮瘤，而且这种致瘤性无阈值，在较低浓度时即可发生。MWCNT在短时间内以较低剂量即可引起肺组织持续性纤维化发生，其毒性甚至比结构相似的炭黑、石棉更大。而肺纤维化和肺癌之间有很多相似的生理和病理特性，如遗传性状的改变、不可控制的细胞生长和组织侵袭等。研究认为肺内肉芽肿及纤维化等形成的纤维化疤痕部位更容易发展为肺癌。MWCNT对体外细胞系也能造成癌性损伤，主要表现为细胞增殖能力增强、细胞侵袭和血管生成；细胞迁移侵袭能力加强；破坏细胞内环境稳定等。但是也有报道MWCNT染毒大鼠未发生肺部炎症及纤维化，对大鼠染毒 2年的致癌性研究中未见间皮瘤。

[0004] MWCNT毒性效应及其机制的研究是促进MWCNT大规模使用及相关纳米科技健康可持续发展的必要前提。MWCNT体内外生物毒性研究目前还不能得到一致结论且存在争议。MWCNT尺寸小、表面积大及吸附性强等独特结构特点使我们对该材料存在的潜在危害不容忽视，需要有更多的研究综合分析MWCNT的毒性效应及其机制。

[0005] 细胞恶性转化模型不仅是极好的研究致癌物致癌机制的材料，还可以用于恶性间皮瘤诊断与治疗的基础研究。但由于人体细胞的基因组比较稳定且具有高效的修复机制，对外来损伤有较强的抵抗力，尤其对致癌物的损伤不如一些动物细胞敏感，故其相对于动物细胞来说较难转化。因此，既往对细胞致癌活性的研究一般选用动物成纤维细胞进行，如小鼠NIH/3T3细胞。我们采用人胸膜间皮细胞进行恶性转化，所得细胞模型能直接反映MWCNT对人体靶细胞的作用情况。细胞恶性转化是细胞发生遗传性改变的一种变化，涉及DNA或基因的改变，是一个多因素、多阶段、多途径的过程。因而，无论用化学、物理、病毒和癌基因等处理正常人体细胞，经一次处理是难以发生恶性转化的，需要反复持久的刺激。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用。

[0007] 一种人胸膜间皮细胞恶性转化株，分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为： MCN-MeT-5A，于2018年12月6日保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO:C2018124。本发明人胸膜间皮细胞 MCN-MeT-5A由人胸膜间皮细胞(MeT-5A)经MWCNT多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化，收获了一株细胞，命名为人胸膜间皮细胞MCN-MeT-5A细胞，该细胞较原始MeT-5A细胞生长速度加快，并获得叠层生长特性。

[0008] 本发明又提供了所述人胸膜间皮细胞恶性转化株的子代细胞。

[0009] 本发明又提供了所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型中的应用。其中，所述致癌物为多壁碳纳米管。

[0010] 本发明又提供了所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在作为恶性间皮瘤发生机理研究的细胞模型中的应用。

[0011] 本发明又提供了所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在提取恶性间皮瘤特异性肿瘤标志物中的应用。

[0012] 本发明又提供了所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在筛选或评估治疗恶性间皮瘤药物中的应用。

[0013] 本发明还提供了所述人胸膜间皮细胞恶性转化株在开发恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用。

[0014] 本发明人胸膜间皮细胞恶性转化株由人胸膜间皮细胞(MeT-5A)经MWCNT 多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。

附图说明

[0015] 图1为细胞生长速度检测结果图。

[0016] 图2为细胞叠层生长形态图，其中A为MeT-5A细胞，B为MCN-MeT-5A 细胞。

[0017] 图3为细胞锚着不依赖性生长情况检测结果图，其中A为MeT-5A细胞，B 为MCN-MeT-5A细胞。

[0018] 图4为细胞扫描电镜观察结果图，其中A为MeT-5A细胞，B为 MCN-MeT-5A细胞，每个图从左到右为局部放大图。

[0019] 图5为细胞恶性转化过程中凋亡状态的改变结果图。

[0020] 图6为MeT-5A(简称M)和MCN-MeT-5A(简称MM)细胞间差异表达基因的热图分析结果图。

具体实施方式

[0021] 人胸膜间皮细胞(MeT-5A)购买自美国模式培养物集存库(ATCC，The Global Bioresource Center)。

[0022] 实施例1

[0023] 纤维制备：MWCNT购自sigma公司，编号为Aldrich 659258。使用时称取5mg MWCNT粉末溶于1ml M199培养液中，配成5mg/ml的母液，在冰水中超声处理成为均匀的悬浮液。超声条件：180W，10s开，5s关，共30个循环。超声后高压灭菌。

[0024] 细胞培养：人胸膜间皮细胞(MeT-5A)用含10％胎牛血清的M199培养液，在37℃、5％CO2饱和湿度的环境中培养，细胞每4-5天传代1次，按1:4接种。细胞分为染毒处理组/转化组和空白对照组，每组各设3孔做平行对照。

[0025] 转化实验：将对数生长期的细胞用0.25％胰酶进行消化、吹打分散后计数，用全培5
养液稀释成1-2×10 个细胞/孔的密度接种于6孔培养板上，放入37℃培养箱中。细胞接种后24h，弃去旧培养液，转化组加入10μg/cm2MWCNT混悬液，对照组加入同等体积的PBS，每组设3个平行样。48h后，吸弃培养液及 MWCNT，用PBS冲洗3次后换常规培养基。以MWCNT间断染毒处理人胸膜间皮细胞48h/次，共72次，总计12个月，12个月后不再用MWCNT染毒，以含20％胎牛血清的M199继续培养2个月。实验过程中使用显微镜观察并记录细胞生长及形态变化。

[0026] 经多阶段多次染毒的实验方法对MeT-5A细胞进行恶性转化后，收获了一株细胞，分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：MCN-MeT-5A，于2018年12 月6日保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：C2018124，该细胞较原始MeT-5A细胞生长速度加快(图1)，并获得叠层生长特性(图2)。

[0027] 锚着不依赖性生长实验：细胞经处理72次及持续培养2个月后，取6孔板每孔加入3ml 0.7％底层琼脂-全培养基，待凝固后加入顶层3ml含1000个待测细胞的0.35％琼脂-全培养基，每组细胞设3个平行样，培养3周，计数每组细胞的集落形成率，50个细胞以上的计为1个集落。同步培养的空白对照组细胞按上述方法同样进行软琼脂内培养并观察集落形成情况。多次染毒处理后细胞呈现出叠层生长及锚着不依赖性生长特性(图3)，成功获得恶性转化细胞模型。

[0028] 并用扫描电镜观察恶性转化细胞MCN-MeT-5A细胞内部发生的变化，相较于MeT-5A细胞，MCN-MeT-5A细胞的细胞核多为不规则型，细胞器结构崩解破坏，胞浆内出现断裂不规则的内质网、核糖体及高尔基体结构和空泡。胞浆内出现大量线粒体，部分线粒体肿胀，线粒体嵴断裂。(图4)。

[0029] 实施例2

[0030] 流式细胞仪检测细胞凋亡改变。

[0031] 将MeT-5A和MCN-MeT-5A细胞经传代培养至单层铺满，胰酶消化后收集于离心管中，1000g离心5min，弃去培养液；再用PBS悬浮洗涤细胞，1000g、 5min离心细胞后用500μl结合缓冲液重悬浮细胞，加入Annexin V-FITC/PI 15 μl，室温放置5min；最后进行流式细胞仪分析。结果显示，与MeT-5A细胞相比，MWCNT染毒处理12月后，MCN-MeT-5A细胞出现耐凋亡特性。而MWCNT 染毒处理6月时，细胞早期凋亡和总凋亡率均显著增加(图5)。

[0032] 实施例3

[0033] 流式细胞仪检测细胞周期变化。

[0034] MeT-5A和MCN-MeT-5A细胞经传代培养至单层铺满，胰酶消化后收集于离心管中，1 000g离心5min；PBS悬浮洗涤细胞2次，1 000g、5min离心后收集；再用0.3ml PBS重新充分悬浮细胞，避免细胞有结团现象；以终浓度 70-75％比例加入预冷的纯乙醇，固定至少2h；1 
000g离心5min，弃去乙醇；1ml PBS悬浮清洗细胞沉淀，放置1min，1 000g离心5min；用500μl PI/Triton X-100染液悬浮细胞沉淀，37℃放置15min后使用流式细胞仪进行检测。

[0035] 表1 MCN-MeT-5A细胞周期的变化

[0036]细胞名称 G1/G0 S G2/M
MeT-5A 41.9 46.5 11.7
MCN-MeT-5A 58.4 30.8 10.9

[0037] 结果如表1所示，与MeT-5A细胞相比，MCN-MeT-5A细胞G1期增加，S 期减少。

[0038] 实施例4

[0039] 基因芯片对比分析两种细胞基因表达谱差异。

[0040] MeT-5A细胞和经MWCNT恶性转化得到的MCN-MeT-5A细胞经 Affymetrix clariom D芯片表达谱对比分析，以p<0.05为标准，筛选到差异倍数在两倍以上、平均信号值大于7的差异基因共2878个，其中上调基因986个，下调基因为1892个。图6展示了两株细胞间差异基因的分布情况。表达变化的基因主要参与mTOR信号通路、NOD受体样信号通路、Jak-STAT信号通路、细胞因子受体交互作用等途径，与细胞骨架调节、上皮细胞形态改变、细胞因子介导的信号途径及免疫应答等功能相关。