Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法

摘要

本发明提供一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法。利用CRISPR‑Cas9基因敲除技术，敲除Ano5基因第11,12外显子。Ano5基因敲除后的小鼠均表现为胫骨侧弯、皮质骨增厚、下颌骨肥大和血液中碱性磷酸酶含量升高等多种人GDD患者临床表现。本发明构建的模拟人GDD疾病的小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类GDD疾病表现类似，可为进一步研究GDD发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

权利要求

1.Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基于CRISPR-Cas9系统设计靶向Ano5基因的sgRNA；

2)sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代与野生型小鼠交配获得F1代杂合子，F1代杂合子进行杂交，筛选Ano5基因敲除的纯合子代，作为Ano5基因敲除小鼠模型；

其中，sgRNA作用位点位于Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为

5′-GCAAGCCAGATAACATCCCAGG-3′和5′-GCCTAGTGTGCACACATCCCTGG-3′。

2.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，用于PCR鉴定的特异性引物包括：Ano5-F1：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R1：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’和Ano5-F2：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R2：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’。

说明书

Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病理学、遗传学和生物技术领域，具体地说，涉及一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

[0002] GDD(Gnathodiaphyseal dysplasia)是一种病变累及口腔和长骨的显性遗传性疾病，表现为下颌骨牙骨质/骨发育不良或呈颌骨骨髓炎病理改变，管状骨侧弯、骨脆性增加和骨皮质增厚。GDD患者常在青少年时期发生骨折或反复骨折，血中碱性磷酸酶水平增高。Anoctamin 5(ANO5)基因是GDD的致病基因。近年来，有关GDD患病家系和散发病例的相关报道不断出现。由于该病给患者造成极大的痛苦，严重影响其生活质量，因此探讨GDD病因，进而指导疾病诊断、预防和治疗成为学者们关注的重点领域。

[0003] GDD是一种常染色体显性遗传疾病。2003年，Tsutsumi在一个日本大家系中，首次将致病基因定位于人类染色体11p14.3-15.1区域。随后，2004年在这个日本家系和另一个非裔美籍家系中发现位于ANO5(Anoctamin 5)/TMEM16E基因上的两个错义突变(p.C356R和p.C356G)。2012年，Marconi等在一个意大利GDD家系中，发现了ANO5基因上第三个错义突变p.T513I。前期研究中，发现中国GDD家系中的第一个ANO5基因突变p.C360Y。但迄今为止，对ANO5基因表达产物的功能及基因突变导致GDD的分子机制仍未阐明。

[0004] ANO5基因位于人类染色体11p14.3-15.1，编码913个氨基酸，属于Anoctamin蛋白家族成员(早期命名为TMEM16family)。TMEM16基因家族有一个共同特征结构--8个跨膜区域，在第五和第六跨膜区域形成了一个离子通道。在人体组织中，Ano5基因的mRNA在脑、心脏、骨骼肌中检测到表达；在成年小鼠的颅盖骨，股骨和下颌骨中也有表达。根据Tsutsumi等人和Mizuta等人的研究，认为ANO5蛋白可能是一个完整的膜糖蛋白，主要驻留在细胞内的膜性囊泡内和质膜上，可能是内质网，但是具体机制还不清楚，突变是否会导致ANO5蛋白定位发生改变也不清楚。因此，利用动物模型研究GDD疾病可以为人类GDD疾病的诊断、治疗提供理论基础。

[0005] 目前，Ano5基因敲除的动物模型主要有Griffin通过敲除第8、9外显子和Xu通过替换第1外显子及其上游1.6kb序列建立的两种小鼠模型，然而这些模型只介绍了Ano5有关的肌肉相关疾病的表型改变，并未发现有任何骨组织的改变。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种Ano5基因敲除小鼠模型，特别是模拟人类GDD疾病的小鼠模型的构建方法。

[0007] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于敲除小鼠Ano5基因的CRISPR-Cas9系统，所述CRISPR-Cas9系统中sgRNA作用位点位于Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′。

[0008] 第二方面，本发明提供小鼠Ano5基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于小鼠Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′(SEQ ID NO:1-2)。

[0009] 第三方面，本发明提供所述CRISPR-Cas9系统或所述打靶载体在制备Ano5基因敲除的细胞系中的应用。

[0010] 本发明所述细胞系包括但不限于体细胞、生殖细胞。

[0011] 第四方面，本发明提供Ano5基因敲除的细胞系，用所述CRISPR-Cas9系统或所述打靶载体转染细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为Ano5基因敲除的细胞系。

[0012] 第五方面，本发明提供所述细胞系在制备Ano5基因敲除小鼠模型中的应用。

[0013] 第六方面，本发明提供一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

[0014] 1)基于CRISPR-Cas9系统设计靶向动物Ano5基因的sgRNA；

[0015] 2)sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代与野生型小鼠交配获得F1代杂合子，F1代杂合子进行杂交，筛选Ano5基因敲除的纯合子代，作为Ano5基因敲除小鼠模型。

[0016] 其中，用于PCR鉴定的特异性引物包括(SEQ ID NO:3-6)：

[0017] Ano5-F1：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’

[0018] Ano5-R1：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’和

[0019] Ano5-F2：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’

[0020] Ano5-R2：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’

[0021] 其中，Ano5-F1和Ano5-R1对应的扩增产物大小为759bp，Ano5-F2和Ano5-R2对应的扩增产物大小为660bp。

[0022] 第七方面，本发明提供按照上述方法构建的Ano5基因敲除小鼠模型，模拟人类GDD疾病。

[0023] 第八方面，本发明提供上述小鼠模型在GDD疾病研究及其药物开发中的应用。

[0024] 本发明的目的可以采用以下的技术措施来进一步实现。

[0025] 1、建立Ano5基因敲除小鼠模型；

[0026] 2、鉴定小鼠Ano5基因敲除效率；

[0027] 3、通过影像学检查检测小鼠骨组织改变；

[0028] 4、用ELISA方法检测小鼠碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶浓度；

[0029] 5、通过组织学方法验证骨组织改变；

[0030] 6、小鼠原代成骨细胞培养通过茜素红、ALP试验检测小鼠成骨能力；

[0031] 7、小鼠原代成骨细胞培养通过qPCR检测成骨细胞成骨相关因子的指标。

[0032] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0033] 本发明提供了一种通过Ano5基因敲除小鼠动物模型模拟人GDD疾病的方法。利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，敲除Ano5基因第11,12外显子。Ano5基因敲除后的小鼠均表现为胫骨皮质骨增厚，下颌骨肥大，血液中碱性磷酸酶含量升高等多种人GDD患者临床表现。本发明构建的模拟人GDD疾病的小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类GDD疾病表现类似，可为进一步研究GDD发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

附图说明

[0034] 图1为本发明实施例1中构建的Ano5基因敲除小鼠模型模式图(A)，Ano5敲除和对照组小鼠基因型鉴定电泳图(B)以及验证Ano5基因敲除效率的qPCR图(C)。

[0035] 图2为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠X线及microCT结果。其中，A表示Ano5基因敲除小鼠和对照组小鼠下颌骨、胫骨和股骨X线比较；B为microCT检测Ano5基因敲除小鼠和对照组小鼠下颌骨影像。

[0036] 图3为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠血清成骨(A)、破骨(B)指标水平。

[0037] 图4为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠下颌骨矢状面(A)、胫骨及股骨(B)HE染色行组织学检测。C-D图为高倍镜下Ano5基因敲除和对照组小鼠牙周膜改变，其中B为牙槽骨；D为牙本质；PDL为牙周膜；E：Ano5基因敲除和对照组小鼠牙周膜行白介素Ⅵ(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)免疫组化染色结果。

[0038] 图5为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠成骨细胞培养茜素红染色大2+
体观察(A)和显微镜下观察(B)及Ca 浓度(C)测定，Ano5基因敲除和对照组小鼠成骨细胞培养碱性磷酸酶水平检测结果(D)。

[0039] 图6为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠成骨细胞相关成骨指标qPCR检测。其中，A-I分别表示骨一型胶原(Col1α1)；骨钙素(Ocn)；骨桥蛋白(Opn)；成骨相关转录因子(Runx2)；锌指结构转录因子(SP7)；骨保护素(Opg)；骨保护素/核因子κB受体活化因子配体(Opg/Rankl)；Ano6基因。

具体实施方式

[0040] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0041] 实施例1 Ano5基因敲除小鼠模型的构建

[0042] 1、根据小鼠Ano5基因(GenBank：NC_000073.6)第11,12外显子序列，基于CRISPR-Cas9系统设计sgRNA；所述Ano5的sgRNA序列如下(图1-A)：

[0043] 第11外显子上的识别位点：5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′

[0044] 第12外显子上的识别位点：5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′

[0045] 2、PMSG处理C57/BL6雌性小鼠(3周龄，平均体重15g)，46小时后注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤1的sgRNA(100ng/ml)与Cas9核酸酶(50ng/ml)的mRNA经体外转录后，一起注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即F0代小鼠。

[0046] 3、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体。

[0047] 4、待F0代雄性Founder小鼠7周龄，雌性小鼠4周龄，分别与野生型异性小鼠交配获得杂合子小鼠F1代，小鼠出生后20天进行PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。

[0048] 5、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠Ano5-/-，即为小鼠动物模型。

[0049] 本发明选用F3代及以后获得稳定遗传性状的小鼠模型进行后续实验。

[0050] ①小鼠基因型鉴定

[0051] PCR鉴定结果出现660bp和759bp两种带型(图1-B)，660bp为突变等位基因条带，759bp为野生型等位基因条带，两条条带同时出现表明小鼠同时携带野生型和突变型基因，即小鼠为杂合子Ano5+/-小鼠。

[0052] 其中，用于PCR鉴定的特异性引物包括：

[0053] Ano5-F1：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’

[0054] Ano5-R1：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’

[0055] Ano5-F2：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’

[0056] Ano5-R2：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’

[0057] 其中，Ano5-F1和Ano5-R1对应的扩增产物大小为759bp，Ano5-F2和Ano5-R2对应的扩增产物大小为660bp。

[0058] qPCR鉴定小鼠Ano5基因敲除效率，即基因敲除后小鼠Ano5基因qPCR表达量平均值与野生型小鼠Ano5基因qPCR表达量平均值之比，引物序列为：

[0059] Ano5-F：5’-AATGCTGTTGTTTGCGGCTC-3’

[0060] Ano5-R：5’-TCAAACAGATGGGAGAACTTTG-3’

[0061] 结果如图1-C所示，该结果表明，在肌肉和骨骼中，Ano5基因敲除效率均>98％,即Ano5基因几乎完全被敲除。

[0062] ②小鼠X-ray及microCT检测

[0063] 取12周龄的小鼠下颌骨、胫骨及股骨，进行X-ray和microCT检测。X-ray曝光时间为0.125s，microCT分辨率参数为14μm，可见Ano5敲除组小鼠下颌骨骨量增加，骨小梁排列稀疏，胫骨弯曲，胫骨和股骨的皮质骨增厚(图2)。

[0064] ③小鼠血清碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶检测

[0065] 利用眼球取血的方法采12周龄的小鼠全血，4℃静置1h后3000rpm离心5分钟提取血清。根据试剂盒说明书进行碱性磷酸酶及ELISA检测，可见Ano5敲除组小鼠碱性磷酸酶水平较对照组明显升高，但两者抗酒石酸酸性磷酸酶水平并无明显差别(图3)。

[0066] ④小鼠骨组织形态学检测

[0067] 取12周龄的小鼠下颌骨、胫骨及股骨，固定48h后脱钙，脱水，包埋，制备5μm的石蜡切片行HE染色，进一步证实影像学检查结果(图4A-B)。另外，在高倍显微镜下观察，Ano5基因敲除小鼠牙周膜可见血管数目增加(图4-C)，并出现类牙骨质样物质沉积(图4-D)及表现为牙周炎症(图4-E)。

[0068] ⑤Ano5敲除和对照组小鼠成骨细胞培养茜素红染色及Ca2+浓度测定及碱性磷酸酶检测

[0069] 取新生24h小鼠头盖骨放入装有1％浓度的青霉素(10000IU)链霉素(10000μg/ml)的PBS缓冲液中，0.3％I型胶原蛋白与0.05％胰蛋白酶按体积比1:1混合37℃消化4个循环，5
每循环35分钟，取第2-4循环细胞培养原代成骨细胞。待细胞传到2代，以2×10密度接种于六孔板内，铺板贴壁第2天更换成骨诱导培养基分别培养3、7、14、21天；取诱导0、3、5、7天的细胞行碱性磷酸酶水平检测；取7、14、21天细胞进行茜素红染色，可见Ano5敲除组小鼠碱性磷酸酶水平较对照组明显升高，矿化结节明显增多，成骨能力增强(图5A-D)。

[0070] ⑥Ano5敲除和对照组小鼠成骨细胞相关成骨指标qPCR检测

[0071] 小鼠原代成骨细胞培养0、3、7、14、21天，步骤同上，提取RNA进行实时荧光定量PCR检测成骨相关指标，表现出Ano5敲除组小鼠成骨能力明显增强(图6A-I)。

[0072] Ano5敲除和对照组小鼠骨组织骨矿物质含量、骨矿物质密度比较见表1，Ano5敲除和对照组小鼠骨小梁情况比较见表2。

[0073] 表1microCT检测12周龄Ano5基因敲除小鼠及野生型小鼠骨矿物情况

[0074]

[0075] 注：*P<0.05，**P<0.01。下同。

[0076] 表2Ano5敲除和对照组小鼠骨小梁情况

[0077]

[0078] 通过以上①～⑥的分析，结果表明Ano5基因敲除的小鼠血清中碱性磷酸酶含量升高，发皮质骨增厚，胫骨弯曲，骨质疏松且成骨能力相对野生型小鼠增强。成功模拟了人GDD疾病。

[0079] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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