一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法

摘要

本发明公开了一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，以银杏叶为原料，醇提获得黑色浸膏，利用差异浓度的乙醇溶剂和石油醚溶剂进行正向、反向萃取，大大降低乳化分层的现象，获得的叶绿素铜酸钠中银杏酸含量小于1ppm，E405nm吸光度≥600。

权利要求

1.一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将银杏叶粉碎、醇溶液浸提，过滤，将滤液浓缩至无醇，获得黑色浸膏；

（2）将所述黑色浸膏加入石油醚的醇溶液中，搅拌，静置分层；分离出石油醚相并加入第一醇溶剂搅拌醇洗，静置分层，所述第一醇溶剂为60%-95% (V/V)的乙醇溶液；

（3）向上一步骤最终获得的石油醚溶液中加入第二醇溶剂和稀碱，分离出透明石油醚相；

（4）向透明石油醚相中加入强碱的醇溶液进行皂化反应，静置分层；分离出醇相后加入石油醚搅拌萃取；

（5）向上一步骤最终获得的醇相溶液中加入硫酸酸化，然后加入石油醚搅拌萃取；

（6）向上一步骤萃取获得的醇相中加入硫酸铜加温回流至颜色变绿，冷却，浓缩至无醇，水洗，再浓缩、干燥，获得叶绿素铜酸；

（7）复溶叶绿素酮酸，加等当量氢氧化钠中和，烘干，得水溶性叶绿素铜钠盐。

2.根据权利要求1所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中对粉碎后的银杏叶加入85% - 95% (V/V)乙醇溶液回流浸提，水浴温度为85-

90℃，浸提过滤后合并滤液。

3.根据权利要求1所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的醇洗共进行2-3次。

4.根据权利要求1所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述第二醇溶剂为45%-85% (V/V)的乙醇溶液，步骤（3）共进行1-3次。

5.根据权利要求4所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的稀碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述稀碱加入量为第二醇溶剂的0.05 – 5 % (m/V)。

7.根据权利要求1所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的强碱为NaOH、KOH的任意一种，加入强碱的醇溶液后皂化反应3-5小时。

8.根据权利要求7所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中强碱加入量为醇溶液的1.0-5.0% (m/V)，加入石油醚常温萃取1-3次。

9.根据权利要求1所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（5）加入硫酸后调节pH至1-4，然后加入石油醚常温萃取1-3次。

10.根据权利要求1所述的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中水洗选用乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯的任意一种进行萃取，加水弃去下层水相，再重复水洗1-2次。

说明书

一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物提取和化学领域，具体地说涉及一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法。

背景技术

[0002] 叶绿素铜钠盐是一种天然来源的色素产品，包括动物来源（如蚕砂）和植物来源（如苜蓿、竹子、银杏等植物的叶子），生产时通过皂化反应将叶绿素转化为叶绿酸盐，再酸化铜代得叶绿素铜酸，以氢氧化钠中和叶绿素铜酸得水溶性叶绿素铜酸钠。GB 26406-2011公开了利用有机溶剂提取蚕沙，经皂化、铜代获得的叶绿素铜钠盐作为食品添加剂的标准，要求在生产时严格控制游离铜的含量，吸光度E405nm≥568。随着人们对叶绿素铜钠盐认知的逐渐提高，越来越多的人选择植物提取的方式获得叶绿素铜钠盐，对制备工艺要求非常高。

[0003] 银杏叶提取物（Ginko Biloba Extract，GBE）是以银杏Ginkgo biloba L.的叶为原料，采用溶剂浸提，柱色谱富集纯化得到的一类产品，其活性成分的含量是银杏黄酮 ≥ 24 wt% 、银杏内酯 ≥ 26 wt%。由于银杏叶提取物具有扩张血管、改善微循环、溶解血栓等功效，以其为原料可以制成各种制剂，用于治疗各种心脑血管疾病，因而被广泛应用于药物、保健品、食品添加剂、功能性饮料、化妆品等领域。利用银杏叶制备获得叶绿素铜钠盐不仅要控制游离铜的含量，银杏叶提取物中银杏酸是产品中主要存在的有害杂质，不容易被分离，极大地影响到产品制备和纯化。

[0004] 中国专利CN 108451988A公开了一种利用酶水解银杏叶获得叶绿素铜钠盐的制备方法，该方法需要使用大量的蛋白酶和纤维素酶，且不能有效降低产物中的银杏酸含量，使得产品杂质过多，水溶后呈混浊状。

[0005] 中国专利 CN 104725387A公开了利用乙醇、异丙醇和6号溶剂油混合提取银杏叶提取物中叶绿素铜钠盐的方法，该方法使用了大量的6号溶剂油，体系中含有多种醇相增加了后处理的步骤，该步骤皂化反应后会获得相当厚度的乳化层，产物中杂志含量较高，溶于水后形成沉淀。且该方法不能有效降低体系中的银杏酸（20-50ppm）。

发明内容

[0006] 发明目的：本发明的目的是提供一种通过优化提纯工艺、消除乳化层从而大幅减少银杏酸含量的植物源叶绿素铜钠盐制备方法，用于获得高收率、水溶液透明的叶绿素铜钠盐。

[0007] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种植物源叶绿素铜钠盐的抗乳化制备方法，包括如下步骤：

[0008] （1）将银杏叶粉碎、醇溶液浸提，过滤，将滤液浓缩至无醇，获得黑色浸膏；

[0009] （2）将所述黑色浸膏加入石油醚的醇溶液中，搅拌，静置分层；分离出石油醚相并加入第一醇溶剂搅拌醇洗，静置分层；

[0010] （3）向上一步骤最终获得的石油醚溶液中加入第二醇溶剂和稀碱，分离出透明石油醚相；

[0011] （4）向透明石油醚相中加入强碱的醇溶液进行皂化反应，静置分层；分离出醇相后加入石油醚搅拌萃取；

[0012] （5）向上一步骤最终获得的醇相溶液中加入硫酸酸化，然后加入石油醚搅拌萃取；

[0013] （6）向上一步骤萃取获得的醇相中加入硫酸铜加温回流至颜色变绿，冷却，浓缩至无醇，水洗，再浓缩、干燥，获得叶绿素铜酸；

[0014] （7）复溶叶绿素酮酸，加等当量氢氧化钠中和，烘干，得水溶性叶绿素铜钠盐。

[0015] 本发明的方法是：对浸提获得的银杏叶黑色浸膏利用醇和石油醚进行多次分离纯化，先利用醇溶剂萃取分离出石油醚相中的杂质，皂化反应后，活性成分从石油醚相转入醇相，再用石油醚萃取分离出醇相中的杂质，然后再进行酸化、石油醚萃取和铜代反应。由于皂化前的乳化现象会直接影响到皂化反应、产品纯度，因此如何选择合适的萃取试剂、如何进行分离，从而尽量减小乳化层是本发明解决的主要问题。由于乳化层问题得以有效解决，进而使得本发明叶绿素铜钠盐的纯度提高，产品色度和透明度优秀，且利于进一步降低体系中银杏酸的含量。

[0016] 该方法在生产银杏叶提取物的同时，利用提取过程中产生的黑色废弃黏性物作为原料来制备叶绿素铜钠盐，不仅实现了银杏叶的综合利用，降低了生产成本，同时减轻了环境污染。

[0017] 所述步骤（1）中对粉碎后的银杏叶加入85% - 95% (V/V)乙醇溶液回流浸提，水浴温度为85-90℃，浸提过滤后合并滤液。优选地，步骤（1）中对粉碎银杏叶的回流浸提、过滤步骤再重复1-2次。更优选地，所述步骤（1）中利用90% (V/V)乙醇溶液回流浸提，回流时间每次不超过3小时。

[0018] 所述步骤（2）中，第一醇溶剂为60%-95% (V/V)的乙醇溶液，醇洗共进行2-3次，合并石油醚相。优选用65%-80% (V/V)的乙醇溶液，更优选地，所述第一醇溶剂选用70% (V/V)的乙醇溶液。所述步骤（3）中，第二醇溶剂为45%-85% (V/V)的乙醇溶液，该步骤共进行1-3次。优选地，所述第二醇溶剂选用50%-65% (V/V)的乙醇溶液。

[0019] 值得注意的是，在化学领域，对乳化现象的常规破乳处理一般通过加入加热，加入甲醇、丙酮、无机盐、酸等等试剂促使分层。但在本发明中，由于采用两种有机相进行萃取，加入多种有机溶剂会影响萃取效果且不利于增大生产时溶剂的回收难度，加入无机盐和酸并不能起到完全破除乳化的效果。在步骤（2）和步骤（3）中，本发明将乙醇溶剂的浓度区分开来进行先后处理，在不添加额外溶剂或破乳剂的情况下显著减少乳化层的厚度，萃取时醇溶剂浓度须特别注意，如果浓度过高，分层不明显；浓度过低，乳化严重，除杂效果差。步骤（3）中通过添加稀碱，且由于控制乙醇的浓度，获得了意想不到的完全破乳效果。

[0020] 所述步骤（3）中的稀碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠溶液中的任意一种。优选为氢氧化钠溶液。

[0021] 更进一步地，所述稀碱加入量为第二醇溶剂的0.05 – 5 % (m/V)，优选加入量为0.05 – 1 % (m/V)，更优选地，为0.1-0.2% (m/V)。

[0022] 所述步骤（4）中的强碱为NaOH、KOH的任意一种，优选为氢氧化钾。加入强碱的醇溶液后皂化反应3-5小时。强碱加入量为醇溶液的1.0-5.0% (m/V)，加入石油醚常温萃取1-3次。

[0023] 所述步骤（5）加入硫酸后调节pH至pH至1-4，优选地pH至1.5-2.5，然后加入石油醚常温萃取1-3次。

[0024] 所述步骤（6）中铜代反应是加入硫酸铜溶液后加温至40-60℃，回流10分钟至溶液逐渐变绿，1小时后，回流停止，冷却。步骤（6）中，水洗选用乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯的任意一种进行萃取，优选用乙酸乙酯萃取。萃取时加水弃去下层水相，再重复水洗1-2次。

[0025] 本发明利用乙醇和石油醚相互萃取时按照乙醇、石油醚体积比1:3 1:5进行混合，~优选体积比为1:4，例如，针对100g银杏叶浸提物，采用100ml乙醇和400ml石油醚进行萃取。

[0026] 有益效果：本发明只用乙醇和石油醚两种溶剂萃取纯化，避免了体系中存在多种有机溶剂影响到萃取分层；银杏叶粉碎浸提采用短时多次回流，合并浸提液的方式，提高了产品收率；先后在石油醚相和醇相中进行除杂，通过控制溶剂浓度显著降低皂化前后的乳化分层现象，保证了产品的收率和纯度，有效地脱除了90%以上的银杏酸，本方法获得的叶绿素铜酸钠E405nm吸光度≥600，吸光度比值3.1 3.58，络合铜≥6.2%，银杏酸<1.0ppm，产~品收率高达0.4%。

具体实施方式

[0027] 下面对本发明的具体实施例进行进一步说明，在没有额外说明的情况下，醇溶剂采用体积百分比（V/V）表示。

[0028] 实施例1

[0029] 1）银杏叶浸膏的制备

[0030] 取100克银杏叶粉碎，初次浸提利用90%乙醇回流浸提3小时，水浴温度为90℃，纱布过滤；然后再次浸提3小时，纱布过滤，合并滤液，加热搅匀，冷却至室温，过滤待用。减压浓缩至浸膏状，加水溶解，离心，得黑色粘性物。

[0031] 2）石油醚相萃取除杂

[0032] 前述浸膏加入95%乙醇100ml，石油醚400ml，搅拌0.5-1.5小时，减压过滤，转入分液漏斗，静置，可见明显分界层，弃置下层醇相。然后加入70%乙醇搅拌醇洗30分钟，静置分层，弃置下层醇相。醇洗共进行2次。

[0033] 然后向前述醇洗后的石油醚相中加入62%乙醇和0.15% (m/V)的氢氧化钠，搅拌30分钟，弃置下层醇相，醇相pH为9-10，然后再次加入62%乙醇和0.15% (m/V)的氢氧化钠，再次搅拌，静置分层，此时醇相pH为11-12。获得透明石油醚相。

[0034] 3）皂化

[0035] 向透明石油醚相中加入氢氧化钠浓度为4.0% (m/V)的95%醇溶液，常温水解4小时，静置分出下层醇相。

[0036] 4）醇相萃取除杂

[0037] 皂化反应后的醇相再加入石油醚萃取除杂，重复两次。萃取加入石油醚50ml，搅拌10分钟，静置分层。

[0038] 5）酸化

[0039] 向上一步骤最终获得的醇相溶液中加入9M硫酸酸化，pH调节至2-3，搅拌10分钟，滤液加入石油醚萃取三次，保留醇相。

[0040] 6）铜代反应

[0041] 向上一步骤萃取获得的醇相中加入20% (m/V)硫酸铜溶液，55℃回流60分钟，此时醇相逐渐变绿，反应完成后冷却，浓缩至无醇。

[0042] 7）成品制备

[0043] 浓缩后利用乙酸乙酯水洗三次，弃去下层水相。浓缩乙酸乙酯相，加入95%乙醇，水浴蒸发其中水分和酒精，烘干干燥后获得干品0.41g。

[0044] 该方法获得的叶绿素铜酸钠收率为0.41%，E405nm吸光度为600，E630nm吸光度为191，吸光度比值为3.14，银杏酸含量小于1ppm。

[0045] 实施例2

[0046] 1）银杏叶浸膏的制备

[0047] 取100克银杏叶粉碎，初次浸提利用90%乙醇回流浸提3小时，水浴温度为90℃，纱布过滤；然后再次浸提3小时，纱布过滤，合并滤液，加热搅匀，冷却至室温，过滤待用。减压浓缩至浸膏状，加水溶解，离心，得黑色粘性物。

[0048] 2）石油醚相萃取除杂

[0049] 前述浸膏加入95%乙醇100ml，石油醚400ml，搅拌0.5-1.5小时，减压过滤，转入分液漏斗，静置，可见明显分界层，弃置下层醇相。然后加入60%乙醇搅拌醇洗30分钟，静置分层，弃置下层醇相。醇洗共进行2次。

[0050] 然后向前述醇洗后的石油醚相中加入60%乙醇和0.10% (m/V)的氢氧化钠，搅拌30分钟，弃置下层醇相，石油醚相pH为12-13，然后再次加入60%乙醇和0.10% (m/V)的氢氧化钠，再次搅拌，静置分层。获得透明石油醚相。

[0051] 3）皂化

[0052] 向透明石油醚相中加入氢氧化钠浓度为3.0% (m/V)的95%醇溶液，常温水解5小时，静置分出下层醇相。

[0053] 4）醇相萃取除杂

[0054] 皂化反应后的醇相再加入石油醚萃取除杂，萃取加入石油醚50ml，搅拌10分钟，静置分层。

[0055] 5）酸化

[0056] 向上一步骤最终获得的醇相溶液中加入9M硫酸酸化，pH调节至2-3，搅拌10分钟，抽滤，滤液加入石油醚萃取三次，保留醇相。

[0057] 6）铜代反应

[0058] 向上一步骤萃取获得的醇相中加入20% (m/V)硫酸铜溶液，55℃回流60分钟，此时醇相逐渐变绿，反应完成后冷却，浓缩至无醇。

[0059] 7）成品制备

[0060] 浓缩后利用乙酸乙酯水洗三次，弃去下层水相。浓缩乙酸乙酯相，加入乙醇，水浴蒸发其中水分和酒精，烘干干燥后获得干品0.39g。

[0061] 该方法获得的叶绿素铜酸钠收率为0.39%，E405nm吸光度为630，E630nm吸光度为190；吸光度比值为3.31，银杏酸含量小于1ppm。

[0062] 实施例3

[0063] 1）银杏叶浸膏的制备

[0064] 取100克银杏叶粉碎，初次浸提利用90%乙醇回流浸提3小时，水浴温度为90℃，纱布过滤；然后再次浸提3小时，纱布过滤，合并滤液，加热搅匀，冷却至室温，过滤待用。减压浓缩至浸膏状，加水溶解，离心，得黑色粘性物。

[0065] 2）石油醚相萃取除杂

[0066] 前述浸膏加入95%乙醇100ml，石油醚300ml，搅拌0.5-1.5小时，减压过滤，转入分液漏斗，静置，可见明显分界层，弃置下层醇相。然后加入95%乙醇搅拌醇洗30分钟，静置分层，弃置下层醇相。醇洗共进行2次。

[0067] 3）皂化

[0068] 向透明石油醚相中加入氢氧化钠浓度为4.0% (m/V)的95%醇溶液，常温水解4小时，静置分出下层醇相。

[0069] 4）醇相萃取除杂

[0070] 皂化反应后的醇相再加入石油醚萃取除杂，重复两次。萃取加入石油醚50ml，搅拌10分钟，静置分层。

[0071] 5）酸化

[0072] 向上一步骤最终获得的醇相溶液中加入9M硫酸酸化，pH调节至2-3，搅拌10分钟，抽滤，滤液加入石油醚萃取三次，保留醇相。

[0073] 6）铜代反应

[0074] 向上一步骤萃取获得的醇相中加入20% (m/V)硫酸铜溶液，55℃回流60分钟，此时醇相逐渐变绿，反应完成后冷却，浓缩至无醇。

[0075] 7）成品制备

[0076] 浓缩后利用乙酸乙酯水洗三次，弃去下层水相。浓缩乙酸乙酯相，加入乙醇，水浴蒸发其中水分和酒精，烘干干燥后获得干品2.0g。

[0077] 该方法获得的叶绿素铜酸钠收率为2.0%，E405nm吸光度为150，E630nm吸光度为89，吸光度比值为1.68，银杏酸含量大于10000ppm。该方法获得的产物虽然收率高，然产品中杂质多，产品无法干燥，为粘稠状，加入水中有大量沉淀。

[0078] 从上面实施例可以看出，利用常规浓度的酒精和萃取方法进行纯化，是无法达到本发明如实施例1的技术效果的。