一种转铁蛋白为模板的金纳米团簇及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201811580659.3
文献号 : CN109705841B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 李英奇 , 赵鹤妙
申请人 : 山西大学
摘要 :
本发明提供一种转铁蛋白为模板的金纳米团簇及其制备方法和应用。所述纳米团簇的制备方法：分别配置HAuCl4和Tf的水溶液，按摩尔比20‑60:1将它们混合，然后在室温下搅拌2‑5分钟，用NaOH溶液将混合溶液的pH调节至12后，将溶液置于微波反应器中并密封，70‑90℃下反应至少50min得到强烈红色荧光发射的AuNCs@Tf。本发明纳米团簇可用来检测铜离子，并应用于铜离子检测试纸，将铜离子的检测可视化。本发明纳米团簇还可用于检测谷胱甘肽，并经过细胞实验表明其可以靶向溶酶体来识别癌细胞。本发明纳米团簇也可用于指纹信息的加密和解密。
权利要求 :
1.一种转铁蛋白为模板的红色荧光金纳米团簇在指纹信息的加密和解密中的应用，其特征在于，所述的金纳米团簇的制备方法，包括如下步骤：分别配置HAuCl4 和转铁蛋白Tf的水溶液，按摩尔比20‑60:1将它们混合，然后在室温下搅拌2‑5分钟，用NaOH溶液将混合溶液的pH调节至12后，将溶液置于微波反应器中并密封，70‑90℃下反应至少50min得到强烈红色荧光发射的AuNCs@Tf。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的HAuCl4 和Tf的摩尔比为40:1。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微波反应器中反应条件为80℃下
60min。
说明书 :
一种转铁蛋白为模板的金纳米团簇及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及荧光检测材料，具体是一种转铁蛋白为模板的红色荧光金纳米团簇及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 铜离子(Cu2+)是人类和其他哺乳动物中的微量元素之一，在我们的身体健康中发2+
挥着关键作用。Cu 的摄入异常会造成肠道紊乱和肝脏或肾脏损害以及几种神经退行性疾
病，如阿兹海默病，帕金森氏病和威尔逊氏病。此外，工业过度排放也会造成环境污染。因此
找到一种灵敏的检测铜离子的方法，对于食品和环境铜离子污染的检测具有重要的价值。
挥着关键作用。Cu 的摄入异常会造成肠道紊乱和肝脏或肾脏损害以及几种神经退行性疾
病，如阿兹海默病，帕金森氏病和威尔逊氏病。此外，工业过度排放也会造成环境污染。因此
找到一种灵敏的检测铜离子的方法，对于食品和环境铜离子污染的检测具有重要的价值。
[0003] 谷胱甘肽(GSH)是含有巯基和γ‑酰胺键的三肽，其在许多生理和病理过程中起关键作用。身体的每个细胞基本上都含有谷胱甘肽，谷胱甘肽主要由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨
酸组成。正常水平的GSH(细胞质(2‑10mM)和血浆(2‑20μM))具有维持正常的免疫系统，抗氧
化和综合解毒作用。然而，过量的GSH与包括包括癌症，白细胞损失，糖尿病和人类免疫缺陷
病毒在内的疾病有关。另一方面，据报道GSH缺乏会导致衰老，肝脏疾病和神经退行性疾病。
有趣的是，先前报道的肿瘤组织比正常组织具有更多的还原环境，并且它们的GSH浓度比正
常组织高几倍。因此，检测GSH水平至关重要。
酸组成。正常水平的GSH(细胞质(2‑10mM)和血浆(2‑20μM))具有维持正常的免疫系统，抗氧
化和综合解毒作用。然而，过量的GSH与包括包括癌症，白细胞损失，糖尿病和人类免疫缺陷
病毒在内的疾病有关。另一方面，据报道GSH缺乏会导致衰老，肝脏疾病和神经退行性疾病。
有趣的是，先前报道的肿瘤组织比正常组织具有更多的还原环境，并且它们的GSH浓度比正
常组织高几倍。因此，检测GSH水平至关重要。
[0004] 目前，有许多技术用于测定GSH，包括高效液相色谱，表面增强拉曼散射，荧光光谱，酶联免疫吸附测定，电化学伏安法，紫外可见法和毛细管电泳法。然而，这些技术通常昂
贵，复杂，耗时，且对于生物系统应用而言不实用。近来，人们越来越关注用于GSH检测的荧
光探针的开发，其具有操作简单，反应条件温和，灵敏度高，响应快的优点。令人失望的是，
哺乳动物细胞中半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的类似结构和性质
为每个单独的硫醇的选择性和判别性检测带来了若干挑战。目前为止，人们探索了许多荧
光探针，尤其是荧光染料。然而，大多数有机染料具有窄的激发光谱，并且光稳定性差，细胞
毒性和环境风险，这限制了它们的使用。此外，还开发了碳量子点荧光探针(MnO2‑CDs) 用
于鉴定GSH。不幸的是，含重金属的量子点反应条件很苛刻并且具有潜在的细胞毒性。与这
些材料相比，金纳米团簇具有大的斯托克斯位移，良好的生物相容性，并且在体外和体内成
像方面显示出巨大的潜力。
贵，复杂，耗时，且对于生物系统应用而言不实用。近来，人们越来越关注用于GSH检测的荧
光探针的开发，其具有操作简单，反应条件温和，灵敏度高，响应快的优点。令人失望的是，
哺乳动物细胞中半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的类似结构和性质
为每个单独的硫醇的选择性和判别性检测带来了若干挑战。目前为止，人们探索了许多荧
光探针，尤其是荧光染料。然而，大多数有机染料具有窄的激发光谱，并且光稳定性差，细胞
毒性和环境风险，这限制了它们的使用。此外，还开发了碳量子点荧光探针(MnO2‑CDs) 用
于鉴定GSH。不幸的是，含重金属的量子点反应条件很苛刻并且具有潜在的细胞毒性。与这
些材料相比，金纳米团簇具有大的斯托克斯位移，良好的生物相容性，并且在体外和体内成
像方面显示出巨大的潜力。
[0005] 基于此，本发明在微波条件下用转铁蛋白还原并包被四氯金酸得到发强烈红色荧光的金纳米团簇，并利用荧光性质应用于检测铜离子，检测GSH，靶向溶酶体识别癌细胞以
及指纹信息的加密和解密。
及指纹信息的加密和解密。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种转铁蛋白为模板的红色荧光金纳米团簇的制备方法，所述制备方法简单、快速；制得的纳米团簇可检测铜离子，检测GSH，靶向溶酶体识别癌细胞
以及指纹信息的加密和解密。
以及指纹信息的加密和解密。
[0007] 本发明提供的一种转铁蛋白为模板的红色荧光金纳米团簇的制备方法，包括如下步骤：
[0008] 分别配置HAuCl4和Tf的水溶液，按摩尔比20‑60:1将它们混合，然后在室温下搅拌2‑5 分钟，用NaOH溶液将混合溶液的pH调节至12后，将溶液置于微波反应器中并密封，70‑
90℃下反应至少50min得到强烈红色荧光发射的AuNCs@Tf。之后放入4℃冰箱备用。
90℃下反应至少50min得到强烈红色荧光发射的AuNCs@Tf。之后放入4℃冰箱备用。
[0009] 所述的HAuCl4和Tf的摩尔比优选为40:1。
[0010] 所述的微波反应器中反应条件优选为80℃下60min。
[0011] 上述制备的红色荧光金纳米团簇可在检测铜离子以及谷胱甘肽中应用，也可在靶向溶酶体识别癌细胞以及指纹信息的加密和解密中应用。
[0012] 与现有技术相比本发明的有益效果：本发明的荧光金纳米团簇生物相容性好，荧光强，反应条件绿色无污染；与前期的研究比较，本发明所用的转铁蛋白比例低，反应时间
2+
短，并且通过制作铜离子试纸，将铜离子的检测可视化；由于不发光的AuNCs@Tf‑Cu 在GSH
的作用下AuNCs@Tf释放从而使荧光恢复，而GSH在肿瘤细胞中的含量远高于正常细胞。利用
2+
这一性质，将淬灭的AuNCs@Tf‑Cu 分别加入正常细胞和癌细胞，只有癌细胞的荧光恢复，而
正常细胞没有变化，以此来区分正常细胞和癌细胞。此外，混合培养正常细胞和癌细胞，只
有癌细胞中有荧光也证明本发明的金纳米团簇对癌细胞具有识别性，为癌症的早期诊断提
供了一种简单易行的方法。
2+
短，并且通过制作铜离子试纸，将铜离子的检测可视化；由于不发光的AuNCs@Tf‑Cu 在GSH
的作用下AuNCs@Tf释放从而使荧光恢复，而GSH在肿瘤细胞中的含量远高于正常细胞。利用
2+
这一性质，将淬灭的AuNCs@Tf‑Cu 分别加入正常细胞和癌细胞，只有癌细胞的荧光恢复，而
正常细胞没有变化，以此来区分正常细胞和癌细胞。此外，混合培养正常细胞和癌细胞，只
有癌细胞中有荧光也证明本发明的金纳米团簇对癌细胞具有识别性，为癌症的早期诊断提
供了一种简单易行的方法。
附图说明
[0013] 图1为不同制备条件对AuNCs@Tf的影响；其中：A、反应摩尔比对AuNCs@Tf的影响， B、反应时间对AuNCs@Tf的影响，C、反应温度对AuNCs@Tf的影响，D、反应pH对AuNCs@Tf 的影
响。
响。
[0014] 图2为AuNCs@Tf的表征；其中：A、AuNCs@Tf的紫外和荧光谱图，B、AuNCs@Tf 的红外分析谱图，C、AuNCs@Tf的透射电镜分析图(插图AuNCs@Tf的粒径分析图)，D、 AuNCs@Tf的X
射线衍射分析谱图，E、X射线光电子能谱分析谱图，F、Au 4f的X射线光电子能谱分析谱图。
射线衍射分析谱图，E、X射线光电子能谱分析谱图，F、Au 4f的X射线光电子能谱分析谱图。
[0015] 图3为AuNCs@Tf对铜离子的选择性和灵敏度；其中A、AuNCs@Tf与各金属离子相互作用相对荧光比较图，B、不同浓度的铜离子加入到AuNCs@Tf的荧光发射光谱，C、铜离子浓
度与荧光强度的线性关系图，D、紫外灯下AuNCs@Tf试纸与不同浓度的铜离子作用图。
度与荧光强度的线性关系图，D、紫外灯下AuNCs@Tf试纸与不同浓度的铜离子作用图。
[0016] 图4为AuNCs@Tf‑Cu2+对GSH的选择性和灵敏度；其中A、不同浓度的GSH加入到 2+
AuNCs@Tf‑Cu 的荧光发射光谱，B、谷胱甘肽浓度与荧光强度的线性关系图，C、 AuNCs@Tf‑
2+
Cu 与生物分子和离子相互作用相对荧光比较图，D、同型半胱氨酸(Hcy,15μM)和半胱氨酸
2+
(Cys,15μM)存在下GSH(150μM)在AuNCs@Tf‑Cu 中的的荧光强度。
AuNCs@Tf‑Cu 的荧光发射光谱，B、谷胱甘肽浓度与荧光强度的线性关系图，C、 AuNCs@Tf‑
2+
Cu 与生物分子和离子相互作用相对荧光比较图，D、同型半胱氨酸(Hcy,15μM)和半胱氨酸
2+
(Cys,15μM)存在下GSH(150μM)在AuNCs@Tf‑Cu 中的的荧光强度。
[0017] 图5不同浓度AuNCs@Tf对人宫颈癌细胞(HeLa)活性的影响。
[0018] 图6用激光共聚焦显微镜观察AuNCs@Tf与溶酶体共定位图。
[0019] 图7AuNCs@Tf‑Cu2+用于溶酶体中GSH传感和癌细胞识别；其中A、用荧光显微镜观察 2+
AuNCs@Tf‑Cu 与人宫颈癌细胞(HeLa),人肝癌细胞(HepG2)，人结肠癌细胞(HCT 116)和小
2+
鼠成纤维细胞(3T3)作用不同时间图，B、AuNCs@Tf‑Cu 与不同细胞孵育时间的相对荧光强
2+
度图(数据来自图7A)，C、AuNCs@Tf‑Cu 进入不同细胞的相对速率常数，D、个数比1:1的人宫
2+
颈癌细胞(HeLa)与小鼠成纤维细胞(3T3)混合培养，加入AuNCs@Tf‑Cu 1h后用荧光显微镜
观察的图。
AuNCs@Tf‑Cu 与人宫颈癌细胞(HeLa),人肝癌细胞(HepG2)，人结肠癌细胞(HCT 116)和小
2+
鼠成纤维细胞(3T3)作用不同时间图，B、AuNCs@Tf‑Cu 与不同细胞孵育时间的相对荧光强
2+
度图(数据来自图7A)，C、AuNCs@Tf‑Cu 进入不同细胞的相对速率常数，D、个数比1:1的人宫
2+
颈癌细胞(HeLa)与小鼠成纤维细胞(3T3)混合培养，加入AuNCs@Tf‑Cu 1h后用荧光显微镜
观察的图。
[0020] 图8AuNCs@Tf与不同细胞作用图；A、用荧光显微镜观察AuNCs@Tf与人宫颈癌细胞 (HeLa),人肝癌细胞(HepG2)，人结肠癌细胞(HCT 116)和小鼠成纤维细胞(3T3)作用不同时
间图，B、AuNCs@Tf与不同细胞孵育时间的相对荧光强度图(数据来自图8A)，C、AuNCs@Tf 进
入不同细胞的相对速率常数。
间图，B、AuNCs@Tf与不同细胞孵育时间的相对荧光强度图(数据来自图8A)，C、AuNCs@Tf 进
入不同细胞的相对速率常数。
[0021] 图9滤纸上的AuNCs@Tf按顺序加入Cu2+和GSH的照片和荧光图像；其中A、汉字，B、指纹。
具体实施方式
[0022] 以下为实施例中使用的材料：
[0023] 转铁蛋白(Holo‑Transferrin human，分子量为7.7×104)为Sigma试剂有限公司生产；
[0024] 四氯金酸(HAuCl4·4H2O，分子量为411.9)为上海展云化学试剂厂生产；
[0025] 氢氧化钠(NaOH，分子量为40.0)为北京化工厂生产；
[0026] 谷胱甘肽(C10H17N3O6S，分子量为307.33)为生工生物生产；
[0027] 各种生物分子、小分子和离子(半胱氨酸Cys、同型半胱氨酸Hcy、苯丙氨酸PHE、赖+ + 2+
氨酸Lys、酪氨酸Tyr、葡萄糖glucose、抗坏血酸VC、钾离子K、钠离子Na 、钙离子Ca 、硫离
2‑ ‑ 2‑ ‑
子S 、碘离子I、草酸根离子C2O4 、氰根离子CN)
氨酸Lys、酪氨酸Tyr、葡萄糖glucose、抗坏血酸VC、钾离子K、钠离子Na 、钙离子Ca 、硫离
2‑ ‑ 2‑ ‑
子S 、碘离子I、草酸根离子C2O4 、氰根离子CN)
[0028] 三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3，分子量为121.14)为天津市光复精细化工研究所生产。
[0029] 实施例1
[0030] 转铁蛋白还原并包被制备红色荧光金纳米团簇。
[0031] 称取5mg的转铁蛋白(Tf)，在其中加入lmL二蒸水，配成5mg/mL的转铁蛋白溶液。称取 206.0mg四氯金酸(HAuCl4·4H2O)，在50mL棕色容量瓶中配制0.01M浓度的HAuCl4溶液并
放置4℃冰箱冷藏备用。配制1M的NaOH溶液10mL。取1mL的0.01M HAuCl4溶液用二蒸水稀释
四倍。取1mL稀释后的溶液，放入微波管中，加入1mL的转铁蛋白溶液在室温下搅拌5分钟。用
40μL的1M NaOH溶液将混合溶液的pH调节至12后，将溶液置于微波反应器中并密封。将反应
条件设置为80℃，60min，150W，250psi，高搅拌速度，预搅拌时间为2min。反应后将其放入4
℃冰箱备用(图1为制备材料时改变HAuCl4和Tf的摩尔比、温度、时间、pH 以确定最佳的反
应条件)。
放置4℃冰箱冷藏备用。配制1M的NaOH溶液10mL。取1mL的0.01M HAuCl4溶液用二蒸水稀释
四倍。取1mL稀释后的溶液，放入微波管中，加入1mL的转铁蛋白溶液在室温下搅拌5分钟。用
40μL的1M NaOH溶液将混合溶液的pH调节至12后，将溶液置于微波反应器中并密封。将反应
条件设置为80℃，60min，150W，250psi，高搅拌速度，预搅拌时间为2min。反应后将其放入4
℃冰箱备用(图1为制备材料时改变HAuCl4和Tf的摩尔比、温度、时间、pH 以确定最佳的反
应条件)。
[0032] 实施例2
[0033] (1)金纳米团簇AuNCs@Tf紫外以及荧光表征。
[0034] 图2A插图中观察到，合成的材料在日光灯下呈现棕色，在紫外灯下具有强烈的红色荧光。取200μL制得的AuNCs@Tf溶液加入800μL二蒸水进行稀释，测定紫外吸收曲线和荧
光发射曲线。紫外吸收结果显示在280nm处有明显的吸收，荧光光谱显示最佳发射峰在
640nm。
光发射曲线。紫外吸收结果显示在280nm处有明显的吸收，荧光光谱显示最佳发射峰在
640nm。
[0035] (2)金纳米团簇AuNCs@Tf的红外分析(FTIR)谱图表征。
[0036] 为了确定转铁蛋白结合在AuNCs@Tf表面，将所制得的AuNCs@Tf液体经过冷冻干燥器干燥得到固体。分别取转铁蛋白与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光
谱；接着取所制得的AuNCs@Tf与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱。
谱；接着取所制得的AuNCs@Tf与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱。
[0037] 在图2B中，它们的光谱几乎无法区分，表明转铁蛋白已经固定在AuNCs的表面上。‑1 ‑1
转铁蛋白的C＝O和N‑H的伸缩振动分别为1654cm 和1540cm ，而AuNCs@Tf的峰值位移，这
‑1
种转变主要是由于Tf和Au的相互作用导致的转铁蛋白骨架结构的变化。AuNCs@Tf在881cm
‑1
和798cm 处显示出新的峰，这个峰可能归因于类似醌的不饱和碳碳双键。这可能是由于转
铁蛋白中的酪氨酸残基(烯醇结构)被HAuCl4氧化成醌。
转铁蛋白的C＝O和N‑H的伸缩振动分别为1654cm 和1540cm ，而AuNCs@Tf的峰值位移，这
‑1
种转变主要是由于Tf和Au的相互作用导致的转铁蛋白骨架结构的变化。AuNCs@Tf在881cm
‑1
和798cm 处显示出新的峰，这个峰可能归因于类似醌的不饱和碳碳双键。这可能是由于转
铁蛋白中的酪氨酸残基(烯醇结构)被HAuCl4氧化成醌。
[0038] (3)金纳米团簇AuNCs@Tf的透射电镜分析谱图以及粒径分析谱图表征。
[0039] 为了确认金纳米团簇形貌和尺寸大小，将AuNCs@Tf溶液超声半小时滴在铜网上制样，待液体挥发，用透射电镜进行观察。此外将超声的AuNCs@Tf液体放入马尔文粒度仪中测
量粒径。
量粒径。
[0040] 图2C为所制备的AuNCs@Tf的透射电镜分析谱图，从图中可看出所制得的AuNCs@Tf分散均匀且呈球状，粒径为4.75±0.5nm。插图为所制备的AuNCs@Tf的粒径分析谱图，结果
水力学直径6.25±0.7nm，与透镜电镜的结果相一致。
水力学直径6.25±0.7nm，与透镜电镜的结果相一致。
[0041] (4)金纳米团簇AuNCs@Tf的X射线衍射分析(XRD)谱图表征。
[0042] 为了观察所制得的AuNCs@Tf的晶型状态，将所制得的AuNCs@Tf液体样品经过冷冻干燥器干燥得到固体，并研磨制样测量。
[0043] 在图2D中，AuNCs@Tf的特征衍射峰分别为31.5°，45.2°，68.7°和75.2°，分别对应于晶格面(111)，(200)，(220)和(311)。这表明AuNCs@Tf处于面心立方(fcc)结构中。
[0044] (5)金纳米团簇AuNCs@Tf的X射线光电子能谱分析(XPS)谱图表征。
[0045] 为了确认AuNCs@Tf表面的官能团和元素，将所制得的液体样品经过冷冻干燥器干燥得到固体，在X射线光电子能谱分析仪上进行表征。
[0046] 如图2E所示，AuNCs@Tf上有五种元素Au，S，O，C和N。如图2F所示Au 4f光谱的XPS 光谱证实存在两个不同的Au 4f7/2双峰，一个在84.4eV，另一个在87.8eV分别归属于Au(0)
和Au(I)。对于AuNCs@Tf，Au(1)/Au(0)的比例为1.51，这意味着Au(I)(Au‑S键的主要形式)
为 AuNCs@Tf中的所有Au原子的60.2％。人们普遍认为Au(I)‑硫醇盐络合物的聚集是金纳
米团簇(AuNCs)发光的主要原因。
和Au(I)。对于AuNCs@Tf，Au(1)/Au(0)的比例为1.51，这意味着Au(I)(Au‑S键的主要形式)
为 AuNCs@Tf中的所有Au原子的60.2％。人们普遍认为Au(I)‑硫醇盐络合物的聚集是金纳
米团簇(AuNCs)发光的主要原因。
[0047] 实施例3
[0048] 各种离子与合成的金纳米团簇AuNCs@Tf的相互作用的荧光研究。
[0049] 配制0.1M的各离子溶液2mL(Mg2+,Pb2+,K+,Cd2+,Cr3+,Bi3+,Zn2+,Na+,Al3+,Ca2+,Ag+,2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Mn , Ba ,Cu ,Hg ,Co ,Ni )于2mL的EP管中，取1mL制得的AuNCs@Tf溶液，向其中加入pH
＝4.5 的Tris‑HCl溶液9ml进行稀释。设置荧光光谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑
2+
740nm)，取 1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL Mg 溶液，进
行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数据，其它离子重复上述实验。图3A记录了实验结果，
2+
结果证明Cu 能使AuNCs@Tf的荧光淬灭。
Mn , Ba ,Cu ,Hg ,Co ,Ni )于2mL的EP管中，取1mL制得的AuNCs@Tf溶液，向其中加入pH
＝4.5 的Tris‑HCl溶液9ml进行稀释。设置荧光光谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑
2+
740nm)，取 1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL Mg 溶液，进
行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数据，其它离子重复上述实验。图3A记录了实验结果，
2+
结果证明Cu 能使AuNCs@Tf的荧光淬灭。
[0050] 实施例4
[0051] 铜离子与合成的金纳米团簇AuNCs@Tf的相互作用的荧光研究。
[0052] 配制不同浓度的Cu2+溶液。取1mL制得的AuNCs@Tf溶液，向其中加入pH＝4.5的Tris‑HCl 溶液9ml进行稀释。设置荧光光谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑740nm)，取
2+
1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL Cu 溶液，进行搅拌后，计
2+
时2min，扫描样品，记录数据，将不同浓度的Cu 溶液重复上述实验。图3B、3C结果表明，在一
2+
定浓度范围内(0‑2300nM),Cu 的浓度与相对荧光强度成良好的线性关系，且检测限为
232nM。
2+
1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL Cu 溶液，进行搅拌后，计
2+
时2min，扫描样品，记录数据，将不同浓度的Cu 溶液重复上述实验。图3B、3C结果表明，在一
2+
定浓度范围内(0‑2300nM),Cu 的浓度与相对荧光强度成良好的线性关系，且检测限为
232nM。
[0053] 实施例5
[0054] Cu2+荧光试纸的制作。
[0055] 将AuNCs@Tf浸泡滤纸并吹干，再将滤纸浸泡到不同浓度的铜离子(10μM,20μM,40μM, 100μM,200μM,400μM)中吹干，在365nm紫外灯激发，如图3D所示，可以得到不同浓度的
2+ 2+ 2+
Cu 和AuNCs@Tf作用后，AuNCs@Tf‑Cu 荧光的变化，将Cu 的测定可视化。
2+ 2+ 2+
Cu 和AuNCs@Tf作用后，AuNCs@Tf‑Cu 荧光的变化，将Cu 的测定可视化。
[0056] 实施例6
[0057] 谷胱甘肽与AuNCs@Tf‑Cu2+体系的相互作用的荧光研究。
[0058] 配制不同浓度的谷胱甘肽溶液。取1mL制得的AuNCs@Tf溶液，向其中加入pH＝4.52+
的 Tris‑HCl溶液9ml进行稀释，向其中加入100μL 0.04M的Cu 溶液，进行搅拌。设置荧光光
谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑740nm)，取上述溶液1mL置于荧光比色皿中扫描样品，
记录数据；向荧光杯中加入10μL谷胱甘肽溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数
据；将不同浓度的谷胱甘肽溶液重复上述实验。图4A、4B结果表明，在一定浓度范围内(0‑
150μM), 谷胱甘肽的浓度与相对荧光强度成良好的线性关系，且检测限为2.86μM。
的 Tris‑HCl溶液9ml进行稀释，向其中加入100μL 0.04M的Cu 溶液，进行搅拌。设置荧光光
谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑740nm)，取上述溶液1mL置于荧光比色皿中扫描样品，
记录数据；向荧光杯中加入10μL谷胱甘肽溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数
据；将不同浓度的谷胱甘肽溶液重复上述实验。图4A、4B结果表明，在一定浓度范围内(0‑
150μM), 谷胱甘肽的浓度与相对荧光强度成良好的线性关系，且检测限为2.86μM。
[0059] 实施例7
[0060] AuNCs@Tf‑Cu2+体系对GSH的选择性。
[0061] 配制0.01M的各种生物分子、小分子和离子溶液2mL(半胱氨酸Cys、同型半胱氨酸+
Hcy、苯丙氨酸PHE、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、葡萄糖glucose、抗坏血酸VC、钾离子K、钠离子
+ 2+ 2‑ ‑ 2‑ ‑
Na 、钙离子Ca 、硫离子S 、碘离子I 、草酸根离子C2O4 、氰根离子CN )。取1mL制得的
AuNCs@Tf溶液，向其中加入pH＝4.5的Tris‑HCl溶液9ml进行稀释，向其中加入100μL 0.04M
2+
的Cu 溶液，进行搅拌。设置荧光光谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑740nm)，取上述溶
液1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL半胱氨酸溶液，进行搅
拌后，计时2min，扫描样品，记录数据；继续重复滴定，直到荧光不再变化，保存数据。其它生
2+
物小分子重复上述实验。图4C记录了实验结果，结果证明AuNCs@Tf‑Cu 对谷胱甘肽具有选
择性。
Hcy、苯丙氨酸PHE、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、葡萄糖glucose、抗坏血酸VC、钾离子K、钠离子
+ 2+ 2‑ ‑ 2‑ ‑
Na 、钙离子Ca 、硫离子S 、碘离子I 、草酸根离子C2O4 、氰根离子CN )。取1mL制得的
AuNCs@Tf溶液，向其中加入pH＝4.5的Tris‑HCl溶液9ml进行稀释，向其中加入100μL 0.04M
2+
的Cu 溶液，进行搅拌。设置荧光光谱仪的参数(λex＝410nm,λem＝570nm‑740nm)，取上述溶
液1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL半胱氨酸溶液，进行搅
拌后，计时2min，扫描样品，记录数据；继续重复滴定，直到荧光不再变化，保存数据。其它生
2+
物小分子重复上述实验。图4C记录了实验结果，结果证明AuNCs@Tf‑Cu 对谷胱甘肽具有选
择性。
[0062] 此外，由于细胞内GSH含量是Cys的10倍，我们检测了AuNCs@Tf‑Cu2+在其他生物硫醇存在下对GSH检测的影响。取上述淬灭的溶液1mL置于荧光比色皿中扫描样品，记录数据；
向荧光杯中加入10μL 15.3mM谷胱甘肽溶液和10μL 1.53mM同型半胱氨酸溶液，进行搅拌
后，计时2min，扫描样品，记录数据；取上述淬灭的溶液1mL置于荧光比色皿中，向荧光杯中
加入10μL 15.3mM谷胱甘肽溶液和10μL 1.53mM半胱氨酸溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描
样品，记录数据。如图4D所示，Hcy(0.1当量)或Cys(0.1当量)的存在不会干扰GSH的检测。这
2+
暗示AuNCs@Tf‑Cu 对GSH的选择性检测。
向荧光杯中加入10μL 15.3mM谷胱甘肽溶液和10μL 1.53mM同型半胱氨酸溶液，进行搅拌
后，计时2min，扫描样品，记录数据；取上述淬灭的溶液1mL置于荧光比色皿中，向荧光杯中
加入10μL 15.3mM谷胱甘肽溶液和10μL 1.53mM半胱氨酸溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描
样品，记录数据。如图4D所示，Hcy(0.1当量)或Cys(0.1当量)的存在不会干扰GSH的检测。这
2+
暗示AuNCs@Tf‑Cu 对GSH的选择性检测。
[0063] 实施例8
[0064] 细胞毒性实验的研究。
[0065] 将处于对数生长期的人宫颈癌细胞(HeLa)(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)3
按每孔5×10 个接种于96孔培养板，待细胞贴壁后，换200μL含AuNCs@Tf(浓度由大到小为：
0μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM)的培养基配制的各实验组，培养24h后，将含AuNCs@
Tf的培养液除去，每孔分别加入200μL新鲜培养基，接着每孔加入20μl 5mg/ml 的MTT溶液，
继续培养4h，然后除去孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，在酶标仪上进
行MTT检测。
按每孔5×10 个接种于96孔培养板，待细胞贴壁后，换200μL含AuNCs@Tf(浓度由大到小为：
0μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM)的培养基配制的各实验组，培养24h后，将含AuNCs@
Tf的培养液除去，每孔分别加入200μL新鲜培养基，接着每孔加入20μl 5mg/ml 的MTT溶液，
继续培养4h，然后除去孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，在酶标仪上进
行MTT检测。
[0066] 图5为不同浓度AuNCs@Tf对人宫颈癌细胞(HeLa)活性的影响。由图可知，细胞即使在高浓度的AuNCs@Tf孵育下存活率仍达80％以上，表明材料有相对较低的毒性。
[0067] 实施例9
[0068] AuNCs@Tf在细胞内的分布。
[0069] 为了进一步确定细胞中AuNCs@Tf的位置，使用绿色溶酶体探针。将HeLa细胞以1.05
× 10 个细胞的密度接种到35mm培养皿中，培养20小时后，将AuNCs@Tf(1mg/mL)加入培养
皿中。1小时后，用PBS洗涤3次以除去游离的AuNCs@Tf。接着将绿色溶酶体探针加入细胞中
并继续孵育30分钟后，将其洗涤3次以除去游离的溶酶体探针。最后，用激光共聚焦显微镜
观察细胞。AuNCs@Tf在405nm处激发，并且在600‑700nm处收集发射。绿色溶酶体探针在
488nm激发，并在500‑600nm收集发射。
× 10 个细胞的密度接种到35mm培养皿中，培养20小时后，将AuNCs@Tf(1mg/mL)加入培养
皿中。1小时后，用PBS洗涤3次以除去游离的AuNCs@Tf。接着将绿色溶酶体探针加入细胞中
并继续孵育30分钟后，将其洗涤3次以除去游离的溶酶体探针。最后，用激光共聚焦显微镜
观察细胞。AuNCs@Tf在405nm处激发，并且在600‑700nm处收集发射。绿色溶酶体探针在
488nm激发，并在500‑600nm收集发射。
[0070] 如图6A所示，可以观察到AuNCs@Tf发出红色荧光，LysoTracker发出绿色荧光，并且合成图像可以观察到橙色荧光，表明AuNCs@Tf和溶酶体定位。通常，当共定位系数接近或
大于0.5(r≥0.5)时，共定位指数良好。因此，可以说我们可以认为AuNCs@Tf已进入溶酶体
(图6B)。
大于0.5(r≥0.5)时，共定位指数良好。因此，可以说我们可以认为AuNCs@Tf已进入溶酶体
(图6B)。
[0071] 实施例10
[0072] 肿瘤细胞的识别。
[0073] 将人宫颈癌细胞(HeLa)，人肝癌细胞(HepG2)，人结肠癌细胞(HCT116)和小鼠成纤5
维细胞(3T3)以1.0×10个细胞的密度接种到35mm培养皿中(前三个代表肿瘤细胞，后者代
2+
表正常细胞)，培养20小时后，将AuNCs@Tf‑Cu (Off)体系加入培养皿中，在不同时间下用荧
光显微镜拍照。在实验中，选择AuNCs@Tf(On)作为对照。
维细胞(3T3)以1.0×10个细胞的密度接种到35mm培养皿中(前三个代表肿瘤细胞，后者代
2+
表正常细胞)，培养20小时后，将AuNCs@Tf‑Cu (Off)体系加入培养皿中，在不同时间下用荧
光显微镜拍照。在实验中，选择AuNCs@Tf(On)作为对照。
[0074] 为了进一步说明AuNCS@Tf‑Cu2+识别肿瘤细胞的能力，将HeLa细胞和3T3细胞以数2+
量比1:1的体积比混合。在细胞贴壁后，将2mg/mL AuNCs@Tf‑Cu 加入培养皿中1小后用荧光
显微镜拍照。
量比1:1的体积比混合。在细胞贴壁后，将2mg/mL AuNCs@Tf‑Cu 加入培养皿中1小后用荧光
显微镜拍照。
[0075] 如图7A所示，HeLa，HepG2和HCT 116细胞与AuNCs@Tf‑Cu2+一起孵育，开始时没有荧光，随着时间的延长，红色荧光信号逐渐出现并变亮。此外，我们发现在图7B中三种癌细胞
中，GSH对HepG2细胞的荧光强度增强是最亮的，与HeLa和HCT 116细胞相比，假一级速率常
2+
数增强了2倍和5倍(图7C，表1)，暗示AuNCs@Tf‑Cu 系统对HepG2细胞的灵敏度和选择性是
2+
最佳的。而正常细胞(3T3)与AuNCs@Tf‑Cu 一起孵育时，即使孵育时间达到2小时也未观察
到荧光(图7A)。作为对照，在AuNCs@Tf和3T3细胞孵育2小时后也观察到明亮的荧光(图8A)。
在三种癌细胞中也发现了这种现象，并且HepG2细胞摄取的AuNCs@Tf 的速率在三种癌细胞
2+
中最快(图8B，8C)。这可以解释HepG2细胞吸收的AuNCs@Tf‑Cu 的速率很快导致GSH对系统
的快速响应。
中，GSH对HepG2细胞的荧光强度增强是最亮的，与HeLa和HCT 116细胞相比，假一级速率常
2+
数增强了2倍和5倍(图7C，表1)，暗示AuNCs@Tf‑Cu 系统对HepG2细胞的灵敏度和选择性是
2+
最佳的。而正常细胞(3T3)与AuNCs@Tf‑Cu 一起孵育时，即使孵育时间达到2小时也未观察
到荧光(图7A)。作为对照，在AuNCs@Tf和3T3细胞孵育2小时后也观察到明亮的荧光(图8A)。
在三种癌细胞中也发现了这种现象，并且HepG2细胞摄取的AuNCs@Tf 的速率在三种癌细胞
2+
中最快(图8B，8C)。这可以解释HepG2细胞吸收的AuNCs@Tf‑Cu 的速率很快导致GSH对系统
的快速响应。
[0076] 为了进一步说明AuNCs@Tf‑Cu2+对GSH的选择性，我们将HeLa细胞和3T3细胞以数量2+
比 1:1的比例混合到培养皿中。细胞贴壁后，将AuNCs@Tf‑Cu 加入培养皿中。1小时后，观察
细胞。如图7D所示，在圆圈中标记的癌细胞中有红色荧光，而在正常细胞中没有观察到荧
光。这一有趣的结果表明，金纳米簇材料可以靶向溶酶体原位恢复癌细胞的荧光，在识别癌
细胞方面具有广阔的前景，可以应用于癌症的诊断和预防。
比 1:1的比例混合到培养皿中。细胞贴壁后，将AuNCs@Tf‑Cu 加入培养皿中。1小时后，观察
细胞。如图7D所示，在圆圈中标记的癌细胞中有红色荧光，而在正常细胞中没有观察到荧
光。这一有趣的结果表明，金纳米簇材料可以靶向溶酶体原位恢复癌细胞的荧光，在识别癌
细胞方面具有广阔的前景，可以应用于癌症的诊断和预防。
[0077] 表1
[0078]
[0079] 实施例11
[0080] AuNCs@Tf作为信息加密和解密的研究。
[0081] 我们将AuNCs@Tf储存液填满钢笔中在滤纸上写汉字，在空气中干燥。然后使用2+
365nm 紫外灯照射。然后我们将Cu 溶液滴在汉字上并用紫外灯照射它。最后，将GSH溶液滴
在汉字上并用紫外灯照射。
365nm 紫外灯照射。然后我们将Cu 溶液滴在汉字上并用紫外灯照射它。最后，将GSH溶液滴
在汉字上并用紫外灯照射。
[0082] 我们在手指蘸取AuNCs@Tf并将指纹印染在滤纸上，在空气中干燥。然后使用365nm2+
紫外灯照射指纹。然后我们将Cu 溶液滴在指纹上并用紫外灯照射它。最后，将GSH溶液滴在
指纹上并用紫外灯照射。
紫外灯照射指纹。然后我们将Cu 溶液滴在指纹上并用紫外灯照射它。最后，将GSH溶液滴在
指纹上并用紫外灯照射。
[0083] 基于Cu2+和GSH对荧光信号的刺激响应，我们设计了一种新颖的信息加密和解密方案。我们在滤纸上用AuNCs@Tf写汉字和印刷指纹(图9)，当暴露于365nm的UV光时，可以清楚
2+
地看到汉字和指纹信息。将Cu 加载到浸渍有AuNCs@Tf的滤纸上后，汉字和指纹的荧光被淬
2+
灭，这样我们加密了信息。然后，我们将GSH加载到浸渍AuNCs@Tf‑Cu 的汉字和指纹上。猝灭
的荧光恢复，我们可以重新获取信息。这种现象表明AuNCs@Tf在信息加密和解密过程中也
有很大的应用前景。
2+
地看到汉字和指纹信息。将Cu 加载到浸渍有AuNCs@Tf的滤纸上后，汉字和指纹的荧光被淬
2+
灭，这样我们加密了信息。然后，我们将GSH加载到浸渍AuNCs@Tf‑Cu 的汉字和指纹上。猝灭
的荧光恢复，我们可以重新获取信息。这种现象表明AuNCs@Tf在信息加密和解密过程中也
有很大的应用前景。