一种在骨髓间充质干细胞中高表达CTLA4Ig的方法

摘要

本发明提供了CTLA4Ig导入到骨髓间充质干细胞中后不同启动子条件下基因表达量的关系，通过研究表明，采用MSCp启动子表达的CTLA4Ig表达量最高，为临床上CTLA4Ig导入到骨髓间充质干细胞对免疫排斥的治疗提供了理论依据和实验数据，有着广阔的应用前景。

权利要求

1.一种在骨髓间充质干细胞中高表达CTLA4Ig的方法，其特征在于：使用表达载体在骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig基因，以SEQ ID NO：1所示的序列为启动子构建表达载体进行CTLA4Ig基因的表达，其中CTLA4Ig基因采用如下方法获得：首先全合成P1、P2和P3的引物序列：

P1:5'-GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC-3'P2:5'-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC-3'P3:5'-GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCACGG-3'用P2和P3引物,以鼠DNA为模板，经半套式PCR扩增后,再用P1和P3引物,经引物重叠PCR,对CTLA4基因改构,获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因；PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamH I酶切、电泳回收,连接至经相同酶切的表达载体pIg；经酶切鉴定后,命名为pIg-CTLA4。

说明书

一种在骨髓间充质干细胞中高表达CTLA4Ig的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种在骨髓间充质干细胞中高表达CTLA4Ig的方法。

背景技术

[0002] MSC是来源于发育早期中胚层的一类异质性多能干细胞，广泛分布于骨髓、脂肪、脐带等多种组织。根据国际细胞治疗协会(ISCT)的鉴定标准，人MSC至少具备3个基本特征：(1)在标准培养条件下具有塑料表面黏附性；(2)表达特定细胞表面标志物CD105、CD73、CD90，同时不表达CD45、CD34、CD14(或CD11b)、CD79α(或CD19)和人类白细胞抗原(HLA)-DR，不同物种MSC表达的表面标志物与人相比略有差异；(3)能够在体外定向诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。此外，MSC在特定的条件下能够跨系、甚至跨胚层分化为其他类型组织细胞。

[0003] 近年来研究发现，MSC具有独特的免疫学特性，有望在器官移植中发挥重要作用。首先，MSC本身具有极低的免疫原性和较低的抗原提呈能力。MSC本身表达低水平的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子，几乎不表达MHCⅡ类分子和Fas配体(Fasligand，FasL)，以及共刺激分子CD80、CD86、CD40和CD40L等，通常不会刺激机体产生强烈的免疫反应。由于缺乏共刺激分子，使其本身的抗原提呈能力也较低，不容易引起严重的免疫排斥反应。不过，MSC并非完全能够逃逸免疫系统的杀伤作用，有研究显示经腹腔注射的MSC移植到免疫缺陷小鼠体内后，能够存在超过120d，其在免疫系统健全的同基因型小鼠体内尚能存在大约
40d，在同种异基因小鼠体内却仅能存在大约20d。Schmuck等发现经颈静脉注射的人MSC移植到SD大鼠体内后会迅速分布于体内不同器官，不过移植8d后，仅有0.06％能被检测到。然而，MSC在受体内的存活是其发挥作用的前提，目前在应用中通常会多次输注MSC以维持其在体内发挥作用的时间。其次，MSC具有免疫调节能力，可以降低受体免疫排斥反应。MSC能够依赖旁分泌各种免疫因子对各种免疫细胞包括T细胞、B细胞、树突状细胞等发挥免疫调节作用，有效抑制这些免疫细胞引起的免疫排斥反应。Bartholomew等在体外实验中证明MSC能够抑制混合淋巴细胞反应中的淋巴细胞增殖。Wu等发现应用MSC能够延长同种异体移植的大鼠心脏在受体内的存活时间，并且通过病理学分析发现MSC能够有效减少炎症细胞在供体组织中的渗透。不仅如此，MSC的免疫调节作用甚至能跨越物种，不受MHC限制，供体、受体和第三方来源的MSC均能抑制异种抗原引起的免疫应答。MSC发挥免疫抑制功能并非一成不变，而是依赖于其所处的炎症微环境。MSC的免疫调节功能需要炎症微环境中炎症介质的“赋权”，并且表现出在低炎症状态下“促炎”或在高炎症状态下“抗炎”的免疫调节作用。
器官移植引起的免疫排斥反应强烈，通常都是处于高炎症状态，利用MSC的免疫调节作用来保护移植物在受体中存活对于器官移植来说是个极具应用前景的选择。

[0004] 最后，MSC具有迁移和趋化作用，能够被招募到炎症或组织损伤部位，参与抵抗促炎症因子的释放和组织修复。MSC表达的基质细胞衍生因子(stromalcell-derived factor-1 alpha，SDF-1α)与趋化因子受体CXCR4的相互作用被认为是促使MSC迁移至移植损伤部位的关键因素，而T细胞分泌的炎症因子白细胞介素(IL)-3也被证明能够促进SDF-1α-CXCR4信号通路对MSC的迁移作用。Teo等观察到静脉注射的MSC在2h后就能穿过血管壁进入炎症部位，证明MSC具有很强的趋化和迁移能力。在器官移植中，MSC的这一特性有助于其定位到移植造成损伤部位，发挥靶向治疗作用。

[0005] 器官移植是终末期器官功能衰竭的有效治疗方法，甚至成为许多的危重患者赖以生存的唯一途径。然而，接受移植手术的受体需长期使用免疫抑制剂来抵抗免疫排斥反应，维持免疫耐受，防止供体器官被排斥。一方面，免疫抑制剂能够缓解急性免疫排斥反应，但可能无法避免慢性免疫排斥反应及其造成的移植器官功能丧失；另一方面，长期使用免疫抑制剂多伴有严重的不良反应，如增加糖尿病和心血管疾病风险等，还容易引起反复感染甚至恶性肿瘤。因此，现阶段的研究者亟需探索降低器官移植免疫排斥的新方法，寻找临床上可行的诱导移植器官耐受而维持其长期存活的新途径。

[0006] 近年来，联合细胞移植来减轻器官移植过程中的免疫排斥反应逐渐成为新的研究热点，树突状细胞、造血干细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)等先后被用于诱导免疫耐受的研究并取得了良好的结果。其中，MSC受到越来越多的重视并取得了许多令人兴奋的效果，有望成为抵抗免疫排斥、诱导免疫耐受、长期维持移植器官功能的理想细胞。

[0007] 器官移植术后复杂的免疫排斥反应是影响移植器官长期存活和发挥功能的巨大障碍，而非特异性的免疫抑制剂的不良反应会严重影响器官移植受体的预后和生活质量。基于MSC的免疫学特性，越来越多的研究者致力于利用其免疫调节作用降低器官移植受体对移植物的免疫排斥进而诱导长期免疫耐受，同时利用移植部位的炎症损伤来招募更多的MSC参与组织靶向修复从而保护移植器官长期发挥功能。事实上，已有临床研究尝试用MSC来代替某些免疫抑制剂来长期保护移植器官的功能。Pan等对32例接受肾移植的受体进行了长达2年的随访，发现MSC可以部分替代具有肾毒性的免疫抑制剂，进而维持移植肾脏对受体免疫排斥的抵抗能力。近年来，MSC在器官移植中的应用研究已取得了丰富的进展。

[0008] 供体器官短缺的问题严重制约了器官移植手术的开展，仅在我国每年就有30万人亟需器官移植，但最终能得到供体接受移植的患者还不到1万例。因此，许多人寄希望于用异种器官来解决供体器官不足的燃眉之急，然而，机体对异种器官的免疫排斥反应更加强烈。猪作为异种器官移植的供体，经过基因改造后其器官可有效降低超急性免疫排斥反应并长期在受体体内存活。尽管如此，其他形式的免疫排斥反应依然存在并且会损伤异种移植的移植器官。近期已有研究发现联合MSC共移植能有效缓解异种胰岛移植中的免疫排斥反应。研究利用MSC的来诱导异种移植器官的免疫耐受，有助于加速异种器官移植的临床应用，从而缓解器官短缺的难题。

[0009] 但是采用干细胞移植时仍然会存在一定的免疫排斥问题。在现有技术中，为了解决该问题，CN105802907A提供了一种提高老年人骨髓间充质干细胞移植后生存能力的预处理方法，该方法为将从老年人骨髓所取得的传代稳定的间充质干细胞置于加入了0.5μmol/L的SRT1720、5mM的NAD+和20mM的谷氨酰胺的常规培养基中，预处理24小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植治疗。本发明的有益效果体现在：SRT1720预处理可通过抑制老年人骨髓间充质干细胞外源性凋亡通路而抑制其在应激条件下的凋亡，经SRT1720预处理的间充质干细胞移植后在缺血心肌内的生存率增加，治疗缺血性心肌病的效果明显改善。

[0010] CN102764272A提供了经PD-Ll基因修饰的骨髓间充质干细胞在抑制移植排斥反应、诱导外周免疫耐受中的应用。该充质干细胞不仅保持了BMSCs自身的免疫调节作用，同时又增加了PD-Ll对τ细胞活化的抑制作用，赋予了该细胞更强的免疫调节作用，使其能够与移植后的T细胞结合，从而减轻或延迟移植排斥反应的发生。

[0011] 另外，免疫调节分子CTLA4Ig具有诱导移植免疫耐受的作用,借助腺病毒的转染能力,有可能使CTLA4Ig在器官移植物中高效表达,实现器官特异性免疫耐受。但是在目前的干细胞中表达时，仍然存在着表达效率低的缺陷，进而影响了免疫耐受效果。因此，需要对其进行改进。

发明内容

[0012] 本发明提供一种高表达CTLA4Ig的方法。

[0013] 进一步的，本发明提供了一种制备pIg-CTLA4(或CTLA4Ig)基因的方法，[0014] 首先全合成P1、P2和P3的引物序列。

[0015] P1:5'-GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC-3'

[0016] P2:5'-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC-3'

[0017] P3:5'-GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCACGG-3'

[0018] 用P2和P3引物,以鼠DNA为模板，经半套式PCR扩增后,再用P1和P3引物,经引物重叠PCR,对CTLA4基因改构,获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因。PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamH I酶切、电泳回收,连接至经相同酶切的表达载体pIg。经酶切鉴定后,命名为pIg-CTLA4。

[0019] 进一步的，本发明提供一种转CTLA4Ig基因的骨髓间充质干细胞。

[0020] 本发明提供一种表达载体，具体的是将CTLA4Ig基因与pCDH慢病毒骨架载体连接后构建而成。

[0021] 进一步的，本发明提供了在骨髓间充质干细胞中高表达的启动子—MSCp启动子，其序列如SEQ ID NO：1所示。将pCFH中的启动子替换为MSCp启动子。

[0022] 进一步的，本发明提供一种鉴定所述干细胞的方法，包括鉴定转基因干细胞中mRNA和目标蛋白的表达量。

[0023] 有益效果

[0024] 本发明研究了CTLA4Ig导入到骨髓间充质干细胞中后不同启动子条件下基因表达量的关系，通过研究表明，采用MSCp启动子表达的CTLA4Ig表达量最高，为临床上CTLA4Ig导入到骨髓间充质干细胞对免疫排斥的治疗提供了理论依据和实验数据。

附图说明

[0025] 图1为载体结构图。

[0026] 图2为蛋白表达量图，泳道1为pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs的CTLA-4Ig蛋白表达结果，泳道2和4分别是pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-pIg-CTLA4-MSCs的CTLA-4Ig蛋白表达结果，泳道3为空白对照的蛋白表达量。

[0027] 图3为mRNA相对表达量图，1为空白对照，2为pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs，3为pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs，4为pCDH-pIg-CTLA4-MSCs，黑色条带为CTLA-4Ig基因相对表达量，灰色条带为β-Actin的表达量。

具体实施方式

[0028] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明:

[0029] 实施例1骨髓间充质干细胞的分离制备

[0030] 骨髓间充质干细胞(MSC)分离和培养

[0031] 将Wistar大鼠拉颈处死后取股骨与胫骨进行分离，制成骨髓细胞悬液，并与等量DMEM混合后离心，再加入Percoll分离液离心，抽取有核细胞层，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM，接种于培养瓶中，置于37℃、体积分数为5％CO2的恒温培养箱中培养。接种48h后更换培养液，之后每隔3d更换一次培养液。待培养细胞接近80％融合后，再用0.25％胰酶消化，传代培养至第5代细胞备用。

[0032] 实施例2表达载体的构建

[0033] 首先全合成P1、P2和P3的引物序列。

[0034] P1:5'-GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC-3'

[0035] P2:5'-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC-3'

[0036] P3:5'-GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCACGG-3'

[0037] 用P2和P3引物,以鼠DNA为模板，经半套式PCR扩增后,再用P1和P3引物,经引物重叠PCR,对CTLA4基因改构,获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因。PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamH I酶切、电泳回收,连接至经相同酶切的表达载体pIg。该载体含有可融合的人IgG1Fc,并要求欲表达的基因含剪切供体,其自身带剪切受体。经酶切鉴定后,命名为pIg-CTLA4。最后,序列测定表明基因正确。随后以含有EcoRI和BamH I酶切位点的双引物来扩增pIg-CTLA4基因，以EcoRI和BamH I双酶切。回收的目的片段与pCDH慢病毒骨架载体连接过夜。本发明所述的pCDH慢病毒骨架载体为pCDH-EF1α-CymR-T2A-RFP(购买自SBI公司，货号为QM300PA-1)，以下简称pCDH慢病毒骨架载体，其结构图如图1所示。

[0038] 另外，申请人前期自己制备了MSCp启动子，其能够在骨髓间充质干细胞中具有较好的启动表达效果。在此，使用本领域常规的实验方法，将pCDH慢病毒骨架载体中的启动子替换为MSCp启动子，制备得到pCDH-MSCp载体，另外，以将pCDH慢病毒骨架载体中的启动子替换为SV40启动子，制备得到pCDH-SV40载体。将pIg-CTLA4与pCDH-MSCp载体和pCDH-SV40载体分别双酶切后同样连接过夜。次日连接产物转入感受态DH5a，小量抽提质粒，分别采用pIg-CTLA4基因PCR与MSCp启动子以及SV40启动子序列进行PCR鉴定，经过鉴定分别都扩增得到了1100多bp以及400bp和SV40启动子相应长度的产物，说明构建成功。

[0039] 实施例3转基因骨髓间充质干细胞制备

[0040] 一、慢病毒的包装

[0041] 转染前1天，将293T 105个细胞接种于15cm2培养皿中，37℃5％CO2过夜培养。取1.5ml Opti-MEM培养基，加入100μl的含有穿梭质粒和包装质粒的(pCDH-MSCp-pIg-CTLA4载体或pCDH-pIg-CTLA4载体或pCDH-SV40-pIg-CTLA4载体∶PPA2X2∶EMG＝5∶3∶2)慢病毒；另取1.5ml Opti-MEM，加入300μl Lip2000；将上述两种液体充分混匀，室温静置25分钟。然后转染培养皿中的细胞，8小时后除去转染液加入新鲜培养液。72小时收集上清，利用Biomiga公司EZgeneTM试剂盒按照标准流程浓缩病毒，-80℃冰箱保存。将293T细胞以1×104浓度接种于24孔板，37℃5％CO2培养24小时后各孔加入不同浓度梯度的病毒液100μl(10-1、10-2、
10-3、10-5)以pCDH-GFP病毒感染293T细胞染细胞作为对照组。72小时后通过荧光显微镜观察，计算荧光细胞数，并根据公式TU/μl＝(GFP阳性细胞率×转染细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积)×1/稀释因子计算出病毒液滴度。慢病毒3种质粒共同转染293T细胞后，72小时后观察细胞荧光表达。构建的质粒能够成功感染293T细胞。根据计算公式计算出浓缩后pCDH-MSCp-pIg-CTLA4载体慢病毒病毒液滴度为7.2×108TU/ml，pCDH-SV40-pIg-CTLA4
8
载体慢病毒病毒液滴度为6.9×10TU/ml，pCDH-pIg-CTLA4载体慢病毒病毒液滴度为6.5×
108TU/ml，空质粒pCDH-GFP的滴度为4.2×108TU/ml，能满足外源基因表达对病毒滴度的要求。

[0042] 二、慢病毒感染MSCs

[0043] 感染前1天，将处于指数生长期的MSCs以5×104接种于12孔板中，将待转染细胞分组:A-C组:目的基因质粒转染组；D组:空质粒转染组。次日，将病毒以180倍的感染复数(MOI＝180)感染细胞，并加入终浓度5μg/ml的Polybrene增加转染率(D组以同样方法转染空质粒pCDH-GFP)。24小时更换培养基，72小时观察转染细胞荧光表达情况。通过嘌呤霉素(2μg/ml)筛选得到稳定扩大培养后进行基因表达检测。通过PCR检测，结果得到了稳定表达目的基因的转基因MSCs细胞，分别命名为pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-pIg-CTLA4-MSCs、和pCDH-GFP-MSCs。

[0044] 实施例4干细胞中蛋白表达量分析

[0045] CTLA-4Ig转染的4种细胞上清中CTLA-4Ig蛋白检测经Protein A亲和层析柱纯化，细胞上清所获蛋白样品用Western blot检测，相同细胞量的基础上，CTLA-4Ig蛋白表达结果如图2所示，泳道1为pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs的CTLA-4Ig蛋白表达结果，泳道2和4分别是pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-pIg-CTLA4-MSCs的CTLA-4Ig蛋白表达结果，泳道3为空白对照的蛋白表达量。从结果可以看出，上清中CTLA-4Ig转染的pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-pIg-CTLA4-MSCs各有一条分子量约50KD附近的能与抗人CTLA-4Ig单抗特异性结合的蛋白免疫印迹条带,而对照细胞上清相应位置无特异条带。而且从蛋白表达量上可以看出，pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs的表达量要远远高于pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs、pCDH-pIg-CTLA4-MSCs这两种启动子的表达量，这充分说明MSCp启动子特异性适合在骨髓间充质干细胞中表达外源蛋白。

[0046] 实施例5转基因干细胞中CTLA4Ig mRNA表达量检测

[0047] RT-PCR检测基因表达为分别取重组腺病毒感染4天的BMMSCs转基因干细胞各3*105个，应用TRIzol试剂并参照试剂盒说明书分别提取细胞总RNA，并以此为模板反转录其中的mRNA为cDNA.分别设计并合成下述引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，检测转基因干细胞在未诱导及不同诱导时间CTLA4Ig的基因表达情况，并用AlphaImager3300软件对结果进行分析。

[0048] CTLA4Ig:F:5’-TCAAGATCTATGGGGGTACTGCTCACACA-3’

[0049] R:5’-ACTCTCGAGCTATTTACCAGGAGAGCGGGA-3’

[0050] β-Actin:F:5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’

[0051] F:5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’

[0052] 以空白组的β-Actin的表达量作为对照，计算各转基因组的相对表达量，结果如图3所示，2为pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs、3为pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs、4位pCDH-pIg-CTLA4-MSCs，黑色条带为CTLA-4Ig基因相对表达量，灰色条带为β-Actin的表达量。从结果可以看出，pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs中的CTLA4pIgmRNA表达量最高，可以达到β-Actin的
1.8倍，而pCDH-SV40-pIg-CTLA4-MSCs和pCDH-pIg-CTLA4-MSCs中的CTLA4pIg mRNA表达量只有β-Actin的1.3和1.4倍，表达量远远低于pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs。这充分的说明，在pCDH-MSCp-pIg-CTLA4-MSCs中，CTLA4pIg可以得到高表达。

[0053] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。