基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂及其制备方法和用途，本发明以嘌呤骨架作为细胞膜染料的基础，通过合理的脂溶端亲水端的调控设计，得到了基于嘌呤骨架的细胞膜靶向染色试剂，该类试剂在快速靶向染色的同时，能够较长时间的停滞在细胞膜上，有利于长时的监测。此外，由于该染色试剂具有聚集诱导型化合物的特性，在良溶剂中发光很弱或不发光，在不良溶剂中发出强烈的荧光，使得该类染料还具有免洗的特异表现。本发明的制备方法收率高、反应条件温和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、靶向性高。

权利要求

1.一种基于嘌呤骨架的化合物，其特征在于，其结构如式(Ⅰ)所示：式(Ⅰ)中：

R1为C1-C20烷基；

R2为

R3为C1-C20烷基或R3为 其中，n＝0-8。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为C1-C20烷基，R2为 R3为甲基或R3为 其中n＝0-3。

3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为 n＝1或3；R2为 R3为 n＝0。

4.权利要求1-3任一项所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括：(1)将2,6-二氯嘌呤和R1的卤代物R1-X溶于第一有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌，得到 其中，X为Cl，Br或I；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；

(2)将 加入至含有第二弱碱的第二有机溶剂中搅拌，然后加入R2取代的 加热搅拌，得到 所述第二有机溶剂为二氧六环和四氢呋喃中的一种或两种组合，所述第二弱碱为正丁基锂、叔丁醇钾、叔丁醇钠、氢化钾、氢化钠、碳酸钾和碳酸钠中的一种或多种组合；

(3)将2，4-甲酰基苯硼酸和催化剂溶于水和有机溶剂的混合溶剂中，加入第三弱碱，然后加入 混合，回流，得到 所述催化剂为四三苯基磷钯，所述混合溶剂为四氢呋喃和水或者二氧六环和水的混合溶剂，所述第三弱碱为碳酸钾、碳酸钠、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；

(4)将 与R3取代的 溶于第三有机溶剂，加入第四弱碱，搅拌，制得基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂；所述第三有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和醋酸酐中的一种或多种组合，所述第四弱碱为醋酸钠和哌啶中的一种或两种组合；

所述R1、R2和R3分别为权利要求1-3任一项所述的R1、R2和R3。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的加热温度为50-120℃，步骤(2)的加热温度为50-100℃。

6.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂中的应用。

说明书

基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂及其

制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化学领域，尤其涉及生物膜靶向染色技术领域，具体涉及一种基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 细胞膜(也称为质膜或细胞质膜)，由磷脂双分子层与嵌插的蛋白组成，是将细胞的内部与外部环境分离的生物膜，它保护细胞不受其环境的影响，是生物体细胞的重要组成成分。它已被证明参与多种细胞过程和生物学功能，如细胞迁移、细胞扩散、吞噬、内吞、胞吐和物质的选择性渗透。细胞膜异常是细胞状态极差及多种疾病的重要标志物。因此，开发高选择性、高灵敏度的检测技术以准确对细胞膜进行可视化，尤其是活体可视化，对于探索与解决医学早期诊断和研究生物学中的基本问题具有重要意义。

[0003] 目前，对于观测细胞膜的方法主要有普通光学显微镜观测、荧光染色标记、透射电镜、扫描电镜观测、原子力显微镜观测等方法。然而，普通光学显微镜分辨率不高，无法观测内层组织中的细胞膜形态；扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜等通常需要对细胞进行固定得到死细胞样本，制样繁琐，设备昂贵。相比之下，荧光染色方法由于其易操作、快响应、高灵敏、对组织细胞无伤害等特点而被广泛采用。

[0004] 现有的染色方法通常有以下两类：①通过标靶细胞膜上蛋白间接靶向细胞膜成像；②通过标靶磷脂双分子层进行染色成像。由于不同细胞靶向细胞膜蛋白的表达数量不同，且连接特异性识别位点费时费力，并不高效。现存的磷脂分子层靶向的染料中，虽然已有商售的DiO、DiI、CellMask等染料，但由其于对细胞膜的特异靶向性不高，仍有大部分染料逸散进细胞内，造成信号干扰，且需要多次的洗涤以去除背景信号，并不能满足临床上需要的快速、精准、简便等要求。此外，洗涤过程与生物过程的连续感测或监测是不相容的，因此开发新的更具优势的免洗细胞膜染料显得尤为重要。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂及其制备方法和用途，以解决现有细胞膜磷脂分子层靶向染料因需要多次洗涤而导致的操作过程复杂、耗时长、成像结果准确性低、不能连接感测的问题。

[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

[0007] 一种基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂，其特征在于，其结构如式(Ⅰ)所示：

[0008]

[0009] 式(Ⅰ)中：

[0010] R1为C1-C20烷基；

[0011] R2为 其中，R为C1-C10烷基链或芳香基团，Ar为芳香基团；

[0012] R3为C1-C20烷基或带电荷的烷基季胺链。

[0013] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，Ar为苯环、呋喃或噻吩。

[0014] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，R3为 其中，n＝0-8。

[0015] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，R1为C1-C20烷基，R2为 R3为C1烷基或带电荷的烷基季胺链。

[0016] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，R3为 其中n＝0-3。

[0017] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，R1为 n＝1或3；R2为 R3为或 n＝0。

[0018] 一种基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂的制备方法，包括：

[0019] (1)将2,6-二氯嘌呤和R1的卤代物R1-X溶于第一有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌，得到第一中间体；其中，X为Cl，Br或I；

[0020] (2)将所述第一中间体加入至含有第二弱碱的第二有机溶剂中搅拌，然后加入R2取代的 加热搅拌，得到第二中间体；

[0021] (3)将2，4-甲酰基苯硼酸和催化剂溶于水和有机溶剂的混合溶剂中，加入第三弱碱，然后加入所述第二中间体混合，回流，得到第三中间体；

[0022] (4)将所述第三中间体与R3取代的 溶于第三有机溶剂，加入第四弱碱，搅拌，制得基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂。

[0023] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤(1)中，所述第一有机溶剂包括DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱包括碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；

[0024] 步骤(2)中，所述第二有机溶剂包括二氧六环和四氢呋喃中的一种或两种组合，所述第二弱碱包括正丁基锂、叔丁醇钾、叔丁醇钠、氢化钾、氢化钠、碳酸钾和碳酸钠中的一种或多种组合；

[0025] 步骤(3)中，所述催化剂为四三苯基磷钯，所述混合溶剂为四氢呋喃和水或者二氧六环和水的混合溶剂，所述第三弱碱包括碳酸钾、碳酸钠、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；

[0026] 步骤(4)中，所述第三有机溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和醋酸酐中的一种或多种组合，所述第四弱碱包括醋酸钠和哌啶中的一种或两种组合。

[0027] 需要说明的是，上述有机溶剂和碱为混合物时，其混合比例可以是任意的。

[0028] 进一步地，在本发明较佳的实施例中，步骤(1)的加热温度为50-120℃，步骤(2)的加热温度为50-100℃。

[0029] 基于嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂在生物体细胞膜上进行荧光成像中的应用。

[0030] 本发明具有以下有益效果：

[0031] 本发明将以嘌呤为基础的聚集诱导型化合物与由烷基链亲脂端和季铵盐亲水端特性有效结合，设计并合成了超快速、免洗、高靶向、高稳定性的细胞膜染色试剂，可用于体外培养细胞、组织细胞的细胞膜染色。本发明制得的染色试剂具有较大的斯托克斯位移(＞150nm)可以有效避免背景光的干扰，且亲脂链亲水链的调控对细胞膜探针的设计合成具有较强的指导意义。本发明的染色试剂对于细胞膜染色具有超快速染色、免洗成像的特性，能够有效降低背景荧光的干扰，且免洗的过程可解决长时染色、多次洗涤带来细胞环境的变化和细胞丢失等问题，提升了细胞成像结果的准确性，减小手术的复杂性并且使长时监测生物过程的成为可能。此外，本发明提供的嘌呤骨架的免洗类聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂具有毒副作用小、原料经济易得、整条合成路线可操作性强、反应条件温和、总体成本较低等优势。

附图说明

[0032] 图1为本发明制备方法的合成路线图。

[0033] 图2(a)为实施例1的染色试剂的氢谱。

[0034] 图2(b)为实施例1的染色试剂的碳谱。

[0035] 图2(c)为实施例1的染色试剂的高分辨质谱。

[0036] 图3(a)为实施例2的染色试剂的氢谱。

[0037] 图3(b)为实施例2的染色试剂的碳谱。

[0038] 图3(c)为实施例2的染色试剂的高分辨质谱。

[0039] 图4(a)为实施例3的染色试剂的氢谱。

[0040] 图4(b)为实施例3的染色试剂的碳谱。

[0041] 图4(c)为实施例3的染色试剂的高分辨质谱。

[0042] 图5(a)为实施例4的染色试剂的氢谱。

[0043] 图5(b)为实施例4的染色试剂的碳谱。

[0044] 图5(c)为实施例4的染色试剂的高分辨质谱。

[0045] 图6为实施例1的染色试剂在DMSO溶液中的紫外吸收光谱。

[0046] 图7为实施例2的染色试剂在DMSO溶液中的紫外吸收光谱。

[0047] 图8为实施例3的染色试剂在DMSO溶液中的紫外吸收光谱。

[0048] 图9为实施例4的染色试剂在DMSO溶液中的紫外吸收光谱。

[0049] 图10为实施例1的染色试剂在DMSO/甲苯混合溶液中的发射光谱。

[0050] 图11为实施例2的染色试剂在DMSO/甲苯混合溶液中的发射光谱。

[0051] 图12为实施例3的染色试剂在DMSO/甲苯混合溶液中的发射光谱。

[0052] 图13为实施例4的染色试剂在DMSO/甲苯混合溶液中的发射光谱。

[0053] 图14为实施例1、2、3、4的染色试剂在DMSO/甲苯混合溶液中的αAIE值。

[0054] 图15为实施例1、2、3、4的染色试剂在甲苯中的归一化荧光发射光谱。

[0055] 图16为实施例1、2、3、4的染色试剂在固体状态下的归一化荧光发射光谱。

[0056] 图17为实施例1、2、3、4的染色试剂的MTS细胞毒性实验。

[0057] 图18为实施例1、2、3、4的染色试剂在B16细胞中的细胞膜染色激光共聚焦实验。

具体实施方式

[0058] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0059] 本发明实施例中，2,6-二氯嘌呤、吲哚、4-甲酰基苯硼酸、各类溶剂、催化剂、碱购于伊诺凯科技有限公司，细胞株购于ATCC(American Type Culture Collection)，10％胎牛血清(FBS)购于Hyclone，1640培养基购于美国Gibco。

[0060] 本发明实施例的合成路线如图1所示，过程包括：

[0061] (1)将2,6-二氯嘌呤和R1的卤代物R1-X溶于第一有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌，得到第一中间体；其中，X为Cl，Br或I；

[0062] (2)将所述第一中间体加入至含有第二弱碱的第二有机溶剂中搅拌，然后加入R2取代的 加热搅拌，得到第二中间体；

[0063] (3)将2，4-甲酰基苯硼酸和催化剂溶于水和有机溶剂的混合溶剂中，加入第三弱碱，然后加入所述第二中间体混合，回流，得到第三中间体；

[0064] (4)将所述第三中间体与R3取代的 溶于第三有机溶剂，加入第四弱碱，搅拌，制得基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂。

[0065] 下面结合实施例对本发明进一步说明。

[0066] 实施例1：

[0067] 本实施例的基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂的制备方法，包括以下步骤：

[0068] (1)合成第一中间体：2,6-二氯-9-正丙基-9-氢-嘌呤

[0069] 合成路线如下：

[0070]

[0071] 将2，6-二氯嘌呤(1.0mmol)、1-溴丙烷(1.5mol)和碳酸钾(3.0mmol)在DMSO(5mL)中混合搅拌6小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(3:2)洗脱，得到第一中间体为白色固体，产率为57％。洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝2：3(V/V)。最终得白色固体，产率61％。

[0072] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11-8.08(s,1H),4.22-4.16(t,2H),1.95-1.85(m,2H),0.94-0.88(t,3H)。

[0073] (2)合成第二中间体：2-氯-6-(1-氢-吲哚)-9-正丙基-9-氢-嘌呤

[0074] 合成路线如下：

[0075]

[0076] 在氮气保护下，将吲哚(1g，14mmol)加入到NaH(2g，21mmol，60％分散在矿物油中)在干燥THF(500mL)中的悬浮液中。将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢加入化合物1(3.2mL，14mmol，在50mL干THF中溶解)。将混合物加热至70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(3:1)洗脱，得到第二中间体为白色固体，产率为57％。

[0077] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ89.14-9.11(d,1H),8.97-8.93(d,1H),7.96-7.94(s,1H),7.64-7.58(d,1H),7.42-7.36(t,1H),7.31-7.26(t,1H),6.81-6.78(d,1H),4.23-4.17(t,
2H),2.00-1.90(m,2H),1.01-0.95(t,3H)。

[0078] (3)合成第三中间体：4-(6-(1-氢-吲哚)-9-正丙基-9氢-嘌呤)-2-苯甲醛[0079] 合成路线如下：

[0080]

[0081] 于氮气保护下，将化合物2(342mg，1.1mmol)、4-甲酰基苯硼酸(1.5eq)、四三苯基磷钯(0.05eq)和2.0mL碳酸钠水溶液(2M)加入10.0mL二氧六环中，回流8小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用二氯甲烷洗脱，得到第三中间体为白色固体，产率为88％。

[0082] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.12-10.09(s,1H),9.22-9.19(d,1H),9.03-8.99(d,1H),8.71-8.65(t,3H),8.14-8.09(d,2H),7.72-7.68(d,1H),7.46-7.41(t,1H),7.32-7.27(t,1H),6.95-6.91(d,1H),4.37-4.30(t,2H),2.00-1.91(m,2H),0.94-0.88(t,3H)。

[0083] (4)合成基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂：(E)-4-(4-(6-(1-氢-吲哚)-9-正丙基-9-氢-嘌呤)-2-苯乙烯基)-1-甲基吡啶-1-六氟磷酸化物

[0084] 合成路线如下：

[0085]

[0086] 在乙醇(10mL)中加入化合物3(381mg，1mmol)和1，4-二甲基吡啶-1-碘化物(235mg，1mmol)后，将哌啶(0.05mL)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约12小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，然后用饱和的六氟磷酸钾丙酮溶液(10mL)溶解。在室温下搅拌2小时后，减压蒸馏去丙酮，然后过滤得到粗产物。粗品经中性氧化铝柱层析纯化。用甲醇/二氯甲烷＝20/1(V：V)洗脱，得到深黄色固体，产率为25％。

[0087] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),7.73(dd,J＝12.5,7.4Hz,6H),7.54(t,J＝6.9Hz,3H),7.47(dt,J＝7.1,3.5Hz,6H),7.31(d,J＝8.7Hz,1H),6.54(dd,J＝8.8,2.3Hz,
1H),6.48(d,J＝2.1Hz,1H),5.55(d,J＝28.6Hz,1H),3.40(q,J＝7.1Hz,4H),1.20(t,J＝
7.1Hz,6H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.7,161.9,157.2,151.1,144.0,133.3,133.2,
131.9,130.3,128.9,128.8,127.3,126.4,108.9,96.5,56.4,55.4,44.8,12.5。HRMS(ESI)C33H30NO3P[M+H]+520.2040。

[0088] 本实施例制得的基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图2(a)-图2(c)所示。

[0089] 实施例2：

[0090] 本实施例与实施例1基本相同，区别在于改变第三中间体R3的取代基，其合成路线如下：

[0091]

[0092] 在乙醇(10mL)中加入第三中间体(381mg，1mmol)和1，4-二甲基吡啶-1-碘化物(235mg，1mmol)后，将哌啶(0.05mL)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约12小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，然后用饱和的六氟磷酸钾丙酮溶液(10mL)溶解。在室温下搅拌2小时后，减压蒸馏去丙酮，然后过滤得到粗产物。粗品经中性氧化铝柱层析纯化。用甲醇/二氯甲烷＝20/1(V：V)洗脱，得到黄色固体，产率为37％。

[0093] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.22-9.20(d,1H),9.06-9.03(d,1H),8.88-8.84(d,2H),8.67-8.65(s,1H),8.59-8.52(d,2H),8.25-8.21(d,2H),8.09-8.02(d,1H),7.96-7.91(d,2H),7.73-7.69(d,1H),7.64-7.57(d,1H),7.47-7.41(t,1H),7.33-7.28(t,1H),6.94-
6.92(d,1H),4.36-4.30(t,2H),4.27-4.24(s,3H),1.99-1.90(t,2H),1.38-1.27(m,4H),
13
0.89-0.83(t,3H). C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.04,154.01,152.62,149.00,146.10,
145.63,140.20,139.57,137.38,135.66,130.67,129.00,128.80,124.80,124.34,124.14,
123.23,121.53,121.20,116.73,108.56,47.44,43.74,29.28,28.62,22.00,14.26.HRMS(ESI):m/z:Calcd for C32H31N6+:499.2605；[M-PF6]+Found:499.2605.

[0094] 本实施例制得的基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图3(a)-图3(c)所示。

[0095] 实施例3：

[0096] 本实施例与实施例1基本相同，区别在将步骤(4)中的的甲基吡啶盐换为4-甲基-1-(3-(三甲铵)丙基)吡啶-1-溴化铵，其合成路线如下：

[0097]

[0098] 得到深褐色固体，产率33％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.23-9.20(d,1H),9.09-9.03(m,3H),8.71-8.69(s,1H),8.62-8.57(d,2H),8.37-8.33(d,2H),8.20-8.14(d,1H),
8.02-7.98(d,2H),7.74-7.67(m,2H),7.47-7.42(t,1H),7.34-7.28(t,1H),6.95-6.93(d,
1H),4.65-4.60(t,2H),4.40-4.34(t,2H),3.11-3.7(s,9H),1.99-1.92(m,2H),0.89-0.83
13
(t,3H). C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.08,154.10,153.50,149.06,146.25,145.04,
140.83,139.78,137.37,135.68,130.69,129.15,129.00,128.93,124.83,124.58,124.36,
123.26,121.57,121.29,116.71,109.99,108.61,62.25,57.24,52.91,45.50,24.47,
23.06,11.51.HRMS(ESI):m/z:Calcd for C35H39F6N7P+:702.2903；[M-PF6]+Found:
702.2902.

[0099] 本实施例制得的基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图4(a)-图4(c)所示。

[0100] 实施例4：

[0101] 本实施例与实施例1基本相同，区别在于改变第三中间体R3的取代基以及参与步骤(4)的甲基吡啶盐不同，其合成路线如下：

[0102]

[0103] 得到深褐色固体，产率37％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24-9.20(d,1H),9.07-9.03(d,1H),9.01-8.87(d,2H),8.70-8.68(s,1H),8.62-8.58(d,2H),8.36-8.31(d,2H),
8.18-8.12(d,1H),8.02-7.97(d,2H),7.74-7.65(m,2H),7.45-7.42(t,1H),7.34-7.29(t,
1H),6.95-6.93(d,1H),4.61-4.45(t,2H),4.40-4.34(t,2H),3.11-3.7(s,9H),1.99-1.93(m,2H),1.41-29(m,4H),0.89-0.84(t,3H).1.61-1.58(s,2H),1.40-1.27(m,4H),0.89-
0.83(t,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ157.04,154.05,153.48,149.04,146.17,145.03,
140.79,139.74,137.37,135.67,130.68,129.13,128.98,128.87,124.83,124.56,124.36,
123.26,121.55,121.24,116.72,108.59,62.25,57.24,52.90,43.76,29.28,28.61,24.49,+ +
22.00,14.26.HRMS(ESI):m/z:Calcd for C37H43F6N6P :730.3216；[M-PF6] Found:
730.3217.

[0104] 本实施例制得的基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图5(a)-图5(c)所示。

[0105] 试验例1紫外吸收光谱

[0106] 将上述实施例1-4制得的基于嘌呤骨架的聚集诱导型细胞膜靶向染色试剂分别配制成5mM的DMSO母液。分别配为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10uL的DMSO溶液，扫描紫外吸收值，绘图。实施例1的染色试剂的紫外吸收光谱如图6所示，实施例2的染色试剂的紫外吸收光谱如图7所示，实施例3的染色试剂的紫外吸收光谱如图8所示，实施例4的染色试剂的紫外吸收光谱如图9所示。如图所示，每个化合物有两个吸收峰。其中一个在λ＝330nm附近，这归因于π-π*跃迁，另一个在λ＝375nm附近出现，这表示分子内电荷转移(ICT)跃迁。另外，无论是延长给电子烷基链还是增加带正电荷的吸电子亲水端，都会略微调整给电子供体-受体(D-A)的性质，导致吸收峰红移。

[0107] 试验例2聚集诱导特性表征

[0108] 将实施例1、2、3、4制得的染色试剂配为5mM的DMSO母液。分别加入DMSO、甲苯(TL)和DMSO\TL的混合溶液测定其荧光光谱，得到荧光发射曲线。与DMSO溶液相比，在DMSO\TL的混合溶液中，待测物的最大发射波长发生明显红移，荧光强度随TL比例的增加逐渐增强，含TL比例为100％时荧光强度达到最大。其中，实施例1的染色试剂的荧光强度变化如图10，实施例2的染色试剂的荧光强度变化如图11，实施例3的染色试剂的荧光强度变化如图12，实施例4的染色试剂的荧光强度变化如图13。此外，图14为实施例1、2、3、4制得的染色试剂的αAIE值变化在TL中的荧光发射光谱汇总，图15为实施例1、2、3、4制得的染色试剂在TL中的荧光发射光谱汇总，图16为实施例1、2、3、4制得的染色试剂在固体状态下的荧光发射光谱汇总。由于这四种化合物都属于有机盐，本发明选择二甲基亚砜(DMSO)作为其良溶剂，甲苯(TL)作为不良溶剂。例如，虽然在DMSO中，实施例4几乎不发射荧光，但在DMSO/TL(>80％TL)中，聚集态的实施例4发射出强烈的荧光。这种观察到的现象可能归因于分子内运动受限(RIM)过程。在化合物实施例1、实施例2、实施例3中也观察到类似现象。此外，当TL含量增加到99.9％时，实施例1、实施例2、实施例3和实施例4的荧光强度分别比它们在纯二甲基亚砜中高8.46、14.6、5.99和8.24倍。

[0109] 试验例3 MTS细胞毒性实验

[0110] 处于对数生长期的B16细胞接种于96孔培养板中，每孔接种10000个细胞，用含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的(青霉素-链霉素，1000KU/L)的DMEM(H)培养基在37℃，5％CO2条件下培养过夜。待细胞完全贴壁，加入不同浓度梯度的实施例1、2、3、4制得的染色试剂，每个浓度设3个复孔，同时设空白对照组。加药后继续培养24小时，MTS法检测细胞的抑制率，结果如图17所示。在20μm的高浓度下，无论探针或DIO对B16细胞都几乎没有细胞毒性。然而，当浓度上升到40μm，探针的细胞通过率在68％左右时，DIO染料的细胞活性降低了
31％。这种现象可能归因于，在高浓度时，长烷基链对细胞膜生理活性活性有比较大的影响，这意味着DIO的毒性在较大浓度时比探针高许多。当在较低浓度时，烷基链插入磷脂双分子层后，质膜的生理功能仍能比较好的保持。然而，在较高的DIO浓度下，DIO在磷脂双层膜中的长烷基链的压缩可能会干扰膜的流动性等生理功能，导致高毒性。与DIO相比，探针的短烷基链对磷脂双层的影响很小。

[0111] 试验例4对B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)细胞膜染色的激光共聚焦成像

[0112] 将B16细胞在35毫米培养皿中培养一夜。在一定浓度下染一定时间后(在DMSO<0.1vol％的1mL培养基中加入1μL 5mM的化合物母液),震荡摇晃5秒-30秒钟，在激光共聚焦显微镜下用适当的激发和发射滤光片对染料进行成像：λex＝405nm，λem＝470-600nm。结果如图18所示。首先对其成像条件进行了优化。由于探针具有水溶性以及和细胞膜之间的静电相互作用和相似相容性，预计探针可以均匀地分散在水溶液中，并且可以快速嵌入到质膜中。因此，对探针的染色周期进行了研究。值得注意的是，这些探针在进行细胞染色后不用清洗直接用于成像。在小鼠黑色素瘤细胞(小鼠癌细胞B16)中可以清楚地观察到它们的细胞膜。染色周期实验的结果表明，当染色时间减少到1分钟、30秒、10秒甚至5秒时，各探针的荧光成像质量没有明显变化，表明其可用于超快成像。

[0113] 综上所述，本发明以嘌呤骨架作为细胞膜染料的基础，通过合理的脂溶端亲水端的调控设计，得到了基于嘌呤骨架的细胞膜靶向染色试剂，该类试剂在快速靶向染色的同时，能够较长时间的停滞在细胞膜上，有利于长时的监测。此外，由于该染色试剂具有聚集诱导型化合物的特性，在良溶剂中发光很弱或不发光，在不良溶剂中发出强烈的荧光，使得该类染料还具有免洗的特异表现。本发明的制备方法收率高、反应条件温和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、靶向性高。

[0114] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。