一种红果冬青优株组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种红果冬青优株组培快繁方法，属于植物组培技术领域，包括获取外植体：选用红果冬青优株当年生的嫩芽芽尖，清洗、消毒、灭菌；诱导培养：外植体转入诱导培养基诱导新芽；增殖培养：新芽转入增殖培养基培养30d得到增殖的苗芽；生根培养：切取苗芽芽尖转入生根培养基，培养15d得到生根苗；炼苗移栽：将生根苗密封2‑3d后覆膜炼苗10d，随后移栽；通过本发明公开的组培快繁方法提高了红果冬青的繁殖系数，大大缩短了生根培育周期，提高了繁殖速度，相对于常规冬青属组培方法，存活率更高，适应力更强。

权利要求

1.一种红果冬青优株组培快繁方法，其特征在于，所述方法如下：

A.获取外植体：选取红果冬青优株当年生的嫩芽芽尖，清洗、消毒、灭菌，无菌水清洗滤干，得到无菌外植体；

B.诱导培养：将无菌外植体转接入芽的诱导培养基，所述诱导培养基的配方如下：MS培养基+NAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，所述诱导培养基pH＝5.8，于培养温度25℃、光照强度为1800lx、光照时间为12h/d条件下培养30-40d，得到诱导的新芽；

C.增殖培养：将诱导的新芽转入增殖培养基，增殖培养基的配方如下：MS培养基+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L+KT0.2mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.3mg/L，所述增殖培养基pH＝5.8，于培养温度25℃、光照强度1800-2000lx、光照时间12h/d条件下培养30d，得到增殖的苗芽；

D.生根培养：将增殖的苗芽切取2-4cm芽尖，转接至生根培养基，生根培养基的配方如下：1/2MS培养基+IBA 0.5mg/L+IAA 0.2mg/L+维生素H0.5mg/L+卡拉胶6.5g/L+蔗糖30g/L，所述生根培养基pH＝5.8，于培养温度25℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d条件下培养

15d，得到生根苗；

E.炼苗移栽：生根苗密封2-3d，密封结束后取出生根苗洗净根部的琼脂，用1wt‰多菌灵浸泡20min后种植于基质盘中，于环境温度为25℃、基质湿度≥70％，光照强度为2000lx的条件下前3d期间全天覆透明薄膜，第3-7d期间每天揭膜1-2h，第7-10d期间白天揭膜，夜间覆膜，同时喷施MS营养液，覆膜炼苗结束后施薄肥，培养28d天后移栽至15孔穴盘。

2.根据权利要求1所述的一种红果冬青优株组培快繁方法，其特征在于，所述获取外植体步骤中，清洗、消毒、灭菌具体操作如下：洗洁精清洗芽尖后用流水冲洗3-5min，随后用

75wt％酒精消毒20-25s，无菌水清洗后滤干，再用0.1wt％升汞溶液震荡消毒8min。

3.根据权利要求2所述的一种红果冬青优株组培快繁方法，其特征在于，所述基质盘中的基质由珍珠岩和草炭按照体积比为1:1的比例混合而成。

4.根据权利要求3所述的一种红果冬青优株组培快繁方法，其特征在于，所述炼苗移栽步骤中，向基质盘中喷洒1/2MS营养液直至基质湿度≥70％。

5.根据权利要求4所述的一种红果冬青优株组培快繁方法，其特征在于，所述炼苗移栽步骤中，培养28d期间，每7d喷施一次1wt‰多菌灵。

说明书

一种红果冬青优株组培快繁方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种红果冬青优株组培快繁方法。

背景技术

[0002] 红果冬青(Ilex purpurea Hassk)，冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)常绿乔木。红果冬青兼具药用价值和观赏价值，中华药典明确记载红果冬青叶可入药，较大的药用价值，也是常用中成药急支糖浆配方的主要成分。红果冬青雌雄异株，雌株入秋后红果累累，鲜艳美丽，挂果期较长，可从当年10月持续到次年4～5月，是观赏价值较高的景观树种。

[0003] 长梗冬青苷属于红果冬青中药用价值较大的一种化学物质，具有清热解毒，消肿止痛的功能。可用于感冒，扁桃体炎，咽喉肿痛，急性胃肠炎，风湿骨痛；外用治跌打损伤，痈疖疮疡，外伤出血，烧烫伤。目前，红果冬青药材主要来源于野生资源，且每株药用成分含量差异大，不能稳定供应，不足以满足制药行业。现在，红果冬青主要通过种子繁殖和扦插繁殖，上述两种方法繁殖效率较低，不能满足优良品种快速繁殖的生产要求；偶见通过组培进行繁殖。但是，现有技术的组培繁殖方法在繁殖再生植株的时候，可能会出现污染率高、生根难、生长慢、组培苗存活率低等情况，不利于红果冬青组培苗的培养。

[0004] 专利申请号为201410478843.2的发明专利“一种金叶龟甲冬青组培繁殖方法”，经过消毒灭菌、初代培养、继代培养、壮苗培养、生根培养、炼苗、移栽步骤等繁殖金叶龟甲冬青，能够提高金叶龟甲冬青的繁殖系数，加快金叶龟甲冬青的繁殖速度，提高金叶龟甲冬青的成活率，但是，金叶龟甲冬青的繁殖方法不仅不能用于红果冬青的繁殖，而且繁殖步骤较多，周期过长，不利于红果冬青的快速繁殖，且完全没有提及组培过程中降低污染率的问题。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种红果冬青优株组培快繁方法，通过本发明公开的组培快繁方法提高了红果冬青的增殖系数，同时还提高了繁殖速度，且污染率小，存活率高。

[0006] 本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

[0007] 一种红果冬青优株组培快繁方法，所述方法如下：

[0008] A.获取外植体：选取红果冬青优株当年生的嫩芽芽尖，清洗、消毒、灭菌，无菌水清洗滤干，得到无菌外植体；

[0009] 本发明采用嫩芽芽尖进行组培，嫩芽芽尖分化能力更强，诱导率更高，芽段长势更好，更利于再生植株植株的稳定生长。

[0010] B.诱导培养：将无菌外植体转接入芽的诱导培养基，于培养温度25℃、光照强度为1800lx、光照时间为12h/d条件下培养30-40d，得到诱导的新芽；

[0011] 培养温度为25℃有利于芽的诱导和芽点的生长，减少诱导时间，转接外植体后远茎段生长，变粗变高，17d后逐渐在底部以原嫩芽为中心，圆周形式诱导出新生的丛芽。且光照强度为1800lx的条件下，有利于丛芽的生长，缩短培养时间，提高芽的质量。

[0012] C.增殖培养：将诱导的新芽转入增殖培养基，于培养温度25℃、光照强度1800-2000lx、光照时间12h/d条件下培养30d，得到增殖的苗芽；

[0013] 采用上述的诱导培养后，采用本发明记载的增殖条件、增殖培养基进行培养，新芽的增殖速度较快，30d左右增殖系数达到4-5，增殖苗已经十分粗壮，不需要经过壮苗阶段，有效的缩短了培育周期。

[0014] D.生根培养：将增殖的苗芽切取2-4cm芽尖，转接至生根培养基，于培养温度25℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d条件下培养15d，得到生根苗；

[0015] 通过本发明的生根培养步骤长出的芽苗生根长度在1cm左右，移栽成活率较高，且便于提高人工的移栽速度，若根部长于1cm后，在移栽过程容易伤根断根。

[0016] E.炼苗移栽：密封2-3d天后，取出生根苗洗净根部的琼脂，用1wt‰多菌灵浸泡20min后种植于基质盘中，于环境温度为25℃、基质湿度≥70％，光照强度为2000lx的条件下覆膜炼苗，同时喷施MS营养液，覆膜炼苗10d天，施薄肥，培养28d天后移栽至15孔穴盘。

[0017] 通过本发明的方法进行炼苗，幼苗具有更强的适应能力，茎干更加粗壮，长势更好。覆膜炼苗10d后喷施薄肥后根系更加发达，茎叶长势更好，茎干木质化速度快。本方法不需要揭盖炼苗，可直接种植于基质盘中，不仅减少了幼苗污染的可能性，还简化了操作。

[0018] 进一步，所述获取外植体步骤中，清洗、消毒、灭菌具体操作如下：洗洁精清洗芽尖后用流水冲洗3-5min，随后用75wt％酒精消毒20-25s，无菌水清洗后滤干，再用0.1wt％升汞溶液震荡消毒8min。

[0019] 酒精消毒时间严格控制在20-25s内，避免伤害外植体的同时杀菌效果良好，并且还降低了外植体被污染的概率。

[0020] 进一步，所述覆膜炼苗是前3d期间全天覆透明薄膜，第3-7d期间每天揭膜1-2h，第7-10d期间白天揭膜，夜间覆膜。

[0021] 覆膜过久容易出现纤细苗，苗幼嫩且对环境适应能力差，经阳光斜晒后会出现日灼现象，并滋生霉菌，覆膜时间不够则易出现不可逆转的萎焉，所以采用本发明记载的覆膜炼苗操作与增殖、生根操作步骤进行结合，可以稳定幼苗的根系和加快植株适应环境，促使幼苗的生长更加稳定。

[0022] 进一步，所述诱导培养基的配方如下：MS培养基+NAA0.2mg/L+6BA 1.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L组成，所述诱导培养基pH＝5.8。

[0023] 进一步，所述增殖培养基的配方如下:MS培养基+NAA 0.2mg/L+6BA2mg/L+KT0.2g/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.3mg/L组成，所述增殖培养基pH＝5.8。

[0024] 进一步，所述生根培养基的配方如下:1/2MS培养基+IBA 0.5mg/L+IAA0.2mg/L+维H 0.5mg/L+卡拉胶6.5g/L+蔗糖30g/L组成，所述生根培养基pH＝5.8。

[0025] 生根培养基加入的IBA为0.25mg/L，可以大大提前根的诱导时间，加入维H以后，生长速度更快，植株翠绿，在10d即可出现根点，15d根长可达1cm。

[0026] 进一步，所述基质盘中的基质由珍珠岩和草炭按照体积比为1:1的比例混合而成。

[0027] 进一步，所述炼苗移栽步骤中，向基质盘中喷洒1/2MS营养液直至基质湿度≥70％。

[0028] 覆膜炼苗期间喷施营养液有助于加快植株适应环境，促进生长。

[0029] 进一步，所述炼苗移栽步骤中，培养28d期间，每7d喷施一次1wt‰多菌灵。

[0030] 本发明的有益效果：

[0031] 1、本发明公开的组培快繁方法将红果冬青的繁殖系数提升至4-5。

[0032] 2、总组培时间缩短至120天左右，提高了繁殖速度，且受污染率下降，生根率和移栽成活率提高至97％以上。

具体实施方式

[0033] 以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：

[0034] 实施例1：组培快繁方法一：

[0035] A.获取外植体：选取红果冬青优质雌株当年生的200株嫩芽,剪掉多余叶片,留下芽尖，用清水洗净后再用洗洁精清洗,然后用流水冲洗4min将洗洁精洗净，随后用75wt％酒精消毒23s，用无菌水将酒精清洗干净后滤干，再用0.1wt％升汞溶液震荡消毒8min，用无菌水将升汞溶液清洗滤干，得到无菌外植体；

[0036] B.诱导培养：将无菌外植体转接入芽的诱导培养基，诱导培养基由MS培养基+NAA0.2mg/L+6BA 1.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L制成，pH＝5.8，于培养温度为25℃、光照强度为1800lx、光照时间为12h/d的条件下培养40d，得到诱导的新芽；

[0037] C.增殖培养：将诱导的新芽转入增殖培养基，增殖培养基由MS培养基+NAA0.2mg/L+6BA 2mg/L+KT0.2g/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.3mg/L制成，pH＝5.8，于培养温度为25℃、光照强度为1800lx、光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到增殖的丛芽；

[0038] D.生根培养：将增殖的苗芽切取2cm左右芽尖，转接至生根培养基，生根培养基由1/2MS培养基+IBA 0.5mg/L+IAA 0.2mg/L+维H 0.5mg/L+卡拉胶6.5g/L+蔗糖30g/L制成，pH＝5.8，于培养温度为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为12h/d的条件下培养15d，得到生根苗；

[0039] E.炼苗移栽：当经过生根培养后，生根苗的根部长度长至1cm左右，此时可进行炼苗移栽，密封3d，密封期间不可打开密封盖，密封期结束后将生根苗取出，洗净根部琼脂，用1wt‰多菌灵浸泡20min后，种植于等体积的珍珠岩和草炭混合的基质盘中，于环境温度为
25℃、基质湿度≥70％，光照强度为2000lx的条件下进行覆膜炼苗，炼苗前3d期间全天覆透明薄膜，第3-7d期间每天揭膜1-2h，第7-10d期间白天揭膜，夜间覆膜，覆膜炼苗期间，当基质湿度＜70％时，喷洒1/2MS营养液直至基质湿度≥70％，覆膜炼苗完成后施1wt‰由N15-P15-K15组成的复合薄肥，培养28d天移栽至15孔穴盘。

[0040] 以上所有步骤均无菌操作。

[0041] 实施例2：组培快繁方法二：

[0042] A.获取外植体：选取与实施例1相同的红果冬青优质雌株当年生的200株嫩芽,剪掉多余叶片,留下芽尖，用清水洗净后再用洗洁精清洗,然后用流水冲洗3min将洗洁精洗净，随后用75wt％酒精消毒20s，用无菌水将酒精清洗干净后滤干，再用0.1wt％升汞溶液震荡消毒8min，用无菌水将升汞溶液清洗滤干，得到无菌外植体；

[0043] B.诱导培养：将无菌外植体转接入芽的诱导培养基，诱导培养基由MS培养基+NAA0.2mg/L+6BA 1.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L制成，pH＝5.8，于培养温度为25℃、光照强度为1800lx、光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到诱导的新芽；

[0044] C.增殖培养：将诱导的新芽转入增殖培养基，增殖培养基由MS培养基+NAA0.2mg/L+6BA 2mg/L+KT0.2g/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.3mg/L制成，pH＝5.8，于培养温度为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为12h/d的条件下培养30d，得到增殖的丛芽；

[0045] D.生根培养：将增殖的苗芽切取4cm左右芽尖，转接至生根培养基，生根培养基由1/2MS培养基+IBA 0.5mg/L+IAA 0.2mg/L+维H 0.5mg/L+卡拉胶6.5g/L+蔗糖30g/L制成，pH＝5.8，于培养温度为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为12h/d的条件下培养15d，得到生根苗；

[0046] E.炼苗移栽：当经过生根培养后，生根苗的根部长度长至1cm左右，此时可进行炼苗移栽，密封2d，密封期间不可打开密封盖，密封期结束后将生根苗取出，洗净根部琼脂，用1wt‰多菌灵浸泡20min后，种植于等体积的珍珠岩和草炭混合的基质盘中，于环境温度为
25℃、基质湿度≥70％，光照强度为2000lx的条件下进行覆膜炼苗，炼苗前3d期间全天覆透明薄膜，第3-7d期间每天揭膜1-2h，第7-10d期间白天揭膜，夜间覆膜，覆膜炼苗期间，当基质湿度＜70％时，喷洒1/2MS营养液直至基质湿度≥70％，覆膜炼苗完成后施1wt‰由N15-P15-K15组成的复合薄肥，培养28d天移栽至15孔穴盘。

[0047] 以上所有步骤均无菌操作。

[0048] 对比实施例3：对照组1：

[0049] 消毒：选取与实施例1相同优质雌株的200株茎段，每个茎段带有芽节，使用饱和洗洁精溶液浸泡90min，用流水冲洗4min，使用75wt％的酒精溶液浸泡1min，并用0.1wt％升汞溶液消毒8min，使用无菌水清洗5次，风干后切割形成1.0-1.5cm长的带有0.5-1.0cm叶柄的茎段；

[0050] 诱导培养：将处理好的茎段接种到诱芽培养基上，诱芽培养基由WPM+IBA0.50mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L制成，pH＝5.8，培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d，培养时间为40d；

[0051] 增殖培养：将诱芽培养基上生长出的新芽切割成0.5-1.0cm的单芽或顶芽，然后接种到增殖培养基中，诱导培养基由MS+ZT0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30mg/L+琼脂7mg/L制成，pH＝5.8，培养温度为25℃，光照强度为2200lx，光照时间为12h/d，培养时间为35d；

[0052] 壮苗培养：将增殖培养的芽苗移栽至壮苗培养基，壮苗培养基由MS+ZT0.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30mg/L+琼脂7mg/L，pH＝5.8，培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d，培养时间为30d；

[0053] 生根培养：将经过壮苗培养后嫩茎为2cm左右的芽苗移植到生根培养基中，生根培养基由1/2WPM+IBA 0.10mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L制成，pH＝5.8，培养温度为25℃，光照强度为2200lx，光照时间为12h/d，培养时间为30d；

[0054] 炼苗：生根培养后，打开瓶口，洗净根部，用1wt‰多菌灵浸泡20min后，移栽至等体积的泥炭、珍珠岩混合基质盘中，于环境温度为25℃、基质湿度≥70％，光照强度为2200lx的条件下进行覆膜炼苗，炼苗前3d期间全天覆透明薄膜，第3-7d期间每天揭膜1-2h，第7-10d期间白天揭膜，夜间覆膜，覆膜10d后揭膜、施1wt‰由N15-P15-K15组成的复合薄肥，培养28d天后移栽至15孔穴盘。

[0055] 以上所有步骤均无菌操作。

[0056] 对实施例1、实施例2和对比实施例3增殖培养阶段的增殖系数、生根率、移栽成活率进行统计，统计结果如表1所示：

[0057] 表1

[0058]实施例 实验总株数 增殖系数 生根率 移栽成活率 组培总时间
实施例1 300株 5 100％ 100％ 126d
实施例2 300株 4 100％ 100％ 115
对比实施例2 300株 2 65％ 70％ 173d

[0059] 通过表1的数据可以得出，与对比实施例3(以下简称对比例)的现有技术的组培方式进行比较，实施例1的增殖系数为5，实施例2的增殖系数为4，分别比对比例多3和2，生根率和移栽成活率均为100％，比对比例分别多35％和30％，实施例1组培总时间为126d(40d+30d+15d+3d+10d+28d)，实施例2组培总时间为115d(30d+30d+15d+2d+10d+28d)，分别比对比例(40d+35d+30d+30d+10d+28d)少47d和58d，说明本发明的通过嫩芽芽尖进行组培，在省略壮苗步骤的条件下减少了总组培时间，但是提高繁殖系数和生根率及移栽存活率。

[0060] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。