一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用

摘要

本发明涉及一种具有热稳定特性的ι‑卡拉胶酶CgiV及其应用。本发明提供的ι‑卡拉胶酶基因来源于海洋细菌Vibrio sp.SY01，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769。所述ι‑卡拉胶酶CgiV的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。氨基酸序列与已知功能的ι‑卡拉胶酶相似度仅为88％。本发明所述的ι‑卡拉胶酶为重组表达工程菌株纯化所得，具有热稳定特性，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h，具备工业化应用潜质。

权利要求

1.一种新型ι-卡拉胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.如权利要求1所述的ι-卡拉胶酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的ι-卡拉胶酶的制备与纯化方法，其特征是：具体步骤如下：

将大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CgiV转接至LB液体培养基中含50μg/mL氨苄青霉素，在

37℃摇床中180rpm震荡培养至OD600＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在20℃诱导24h，发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；上样于镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分，将活性成分透析去除咪唑即得，所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CgiV制备方法如下：

将ι-卡拉胶酶CgiV基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下：正向引物：SEQ ID NO.3：PCgiVF：

5’-CATGCCATGGATGATTAAAGCATCTGATTTC-3’ (Nco I)反向引物：SEQ ID NO.4：PCgiVR：

5’-CCGCTCGAGTTTACCTTGTTTACAGTTTTTTAC-3’ (Xho I)PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟，PCR反应所用DNA聚合酶为PrimerstarHS购自大连宝生物公司，PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物，pET22b(+)质粒DNA，购自美国Invitrogen公司，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段，酶切所用酶和底物反应体系均参照大连宝生物提供的产品说明操作，双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶，购自大连宝生物公司，说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株，购自美国Invitrogen公司，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上，含有50μg/mL氨苄青霉素，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中，含有50μg/mL氨苄青霉素，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜，将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CgiV，重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，购自大连宝生物公司，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CgiV，保存在-80℃备用；

所述ι-卡拉胶酶CgiV的产酶基因CgiV来源于海洋细菌Vibrio sp.SY01，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769。

4.如权利要求1所述的ι-卡拉胶酶在降解卡拉胶中的应用。

5.如权利要求1所述的ι-卡拉胶酶在制备卡拉胶寡糖中的应用。

6.一种水解卡拉胶的方法，其特征是，步骤如下：将卡拉胶底物置于0-70℃保温10min后加入将权利要求1所述的具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶，所述ι-卡拉胶酶溶解于pH7.0的磷酸盐缓冲液。

7.如权利要求5所述的方法，其特征是，将卡拉胶底物置于0-70℃保温10min后加入将权利要求1所述的具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶，所述ι-卡拉胶酶溶解于pH7.0的磷酸盐缓冲液。

说明书

一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有热稳定特性的新型ι-卡拉胶酶CgiV及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 卡拉胶是由1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。根据是否含有3,6-内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量的不同，目前工业上生产和使用的卡拉胶主要为ι-型、ι-型和λ-型三种，其二糖单元分别含有1个、2个和3个硫酸基。卡拉胶寡糖作为一种富含硫酸基的硫酸酯化糖类物质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、降血脂、免疫调节和抗凝血等生物活性。

[0003] 卡拉胶降解酶是一种糖水解酶，通过断裂卡拉胶的β-1,4糖苷键将大分子卡拉胶降解为寡糖的酶。ι-卡拉胶酶是指专一性降解ι-卡拉胶的卡拉胶酶，传统的ι-卡拉胶酶是从海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然ι-卡拉胶酶产量低，发展基因工程的ι-卡拉胶酶势在必行。并且大多数报道的ι-卡拉胶酶热稳定和热恢复性较差，容易失活，无法达到工业化应用的要求。因此，寻找具有特殊性质的ι-卡拉胶酶具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶CgiV及其应用。本发明提供的ι-卡拉胶酶基因来源于海洋细菌Vibrio sp.SY01，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769，保藏单位地址：武汉大学，保藏日期：2018年11月12日。本发明提供的ι-卡拉胶酶与已有ι-卡拉胶酶的氨基酸相似度仅为88％。最适反应温度为40℃；具有热稳定特性，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h。酶解主产物为ι-卡拉胶二糖和四糖。

[0005] 一方面，本发明提供一种新型ι-卡拉胶酶CgiV，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] SEQ ID NO.1：

[0007] MIKASDFYTDKIKEAKKTVNYTGYKVNNKDDQDDSKNLQKAIDDLTAIKKGGVINIPEGKYYFKNIILKSNVHIVIDEKATIYATYPGSDKNFMIMSFGEFGTHYVSVRAKKGMYTVDLSVSKNKNVRMFQVNNSENYKGQQRENILDDNTKFNGITLGYCKYNGKYVMPENGVIKNCRIEKAHYGYGLIQSQASTNVYYENIWGDGGVTLRLETDNLKMNDLQVGGNHNIHGKNIYCQNGNAASHYTHEMQNGHVEMDGVESVNCGFAVRIGKGYVSKKQKVANLKPGTYANQAVESKLGRGCAQGTYREWNGGTRWAARVTQKDACLDKAKLEYGIEPGSFGTVKVSNIKSTYGTTAQVKSKHFKYMPCPERKLIRVCLALMVSPHSIQNGHVEAENVEAVNCVNAKGKGGAPKGYWNVEITNVESVGYPHQSKDILYEQDAVKNCKEGK[0008] 另一方面，本发明还提供一种ι-卡拉胶酶CgiV对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

[0009] SEQ ID NO.2：

[0010] ATGATTAAAGCATCTGATTTCTACACAGATAAAATTAAAGAAGCAAAAAAAACAGTAAACTACACAGGTTACAAAGTAAACAACAAAGATGATCAAGATGATTCTAAAAACTTACAAAAAGCAATTGATGATTTAACAGCAATTAAAAAAGGTGGTGTAATTAACATTCCAGAAGGTAAATACTACTTCAAAAACATTATTTTAAAATCTAACGTACATATTGTAATTGATGAAAAAGCAACAATTTACGCAACATACCCAGGTTCTGATAAAAACTTCATGATTATGTCTTTCGGTGAATTCGGTACACATTACGTATCTGTACGTGCAAAAAAAGGTATGTACACAGTAGATTTATCTGTATCTAAAAACAAAAACGTACGTATGTTCCAAGTAAACAACTCTGAAAACTACAAAGGTCAACAACGTGAAAACATTTTAGATGATAACACAAAATTCAACGGTATTACATTAGGTTACTGTAAATACAACGGTAAATACGTAATGCCAGAAAACGGTGTAATTAAAAACTGTCGTATTGAAAAAGCACATTACGGTTACGGTTTAATTCAATCTCAAGCATCTACAAACGTATACTACGAAAACATTTGGGGTGATGGTGGTGTAACATTACGTTTAGAAACAGATAACTTAAAAATGAACGATTTACAAGTAGGTGGTAACCATAACATTCATGGTAAAAACATTTACTGTCAAAACGGTAACGCAGCATCTCATTACACACATGAAATGCAAAACGGTCATGTAGAAATGGATGGTGTAGAATCTGTAAACTGTGGTTTCGCAGTACGTATTGGTAAAGGTTACGTATCTAAAAAACAAAAAGTAGCAAACTTAAAACCAGGTACATACGCAAACCAAGCAGTAGAATCTAAATTAGGTCGTGGTTGTGCACAAGGTACATACCGTGAATGGAACGGTGGTACACGTTGGGCAGCACGTGTAACACAAAAAGATGCATGTTTAGATAAAGCAAAATTAGAATACGGTATTGAACCAGGTTCTTTCGGTACAGTAAAAGTATCTAACATTAAATCTACATACGGTACAACAGCACAAGTAAAATCTAAACATTTCAAATACATGCCATGTCCAGAACGTAAATTAATTCGTGTATGTTTAGCATTAATGGTATCTCCACATTCTATTCAAAACGGTCATGTAGAAGCAGAAAACGTAGAAGCAGTAAACTGTGTAAACGCAAAAGGTAAAGGTGGTGCACCAAAAGGTTACTGGAACGTAGAAATTACAAACGTAGAATCTGTAGGTTACCCACATCAATCTAAAGATATTTTATACGAACAAGATGCAGTAAAAAACTGTAAAGAAGGTAAATAA

[0011] 另一方面，本发明还提供一种新型ι-卡拉胶酶CgiV的制备方法。

[0012] 另一方面，本发明还提供了所述ι-卡拉胶酶CgiV在水解卡拉胶中的应用。

[0013] 另一方面，本发明还提供了所述ι-卡拉胶酶CgiV在制备ι-卡拉胶寡糖中的应用。

[0014] 另一方面，一种水解ι-卡拉胶的方法，所选用的ι-卡拉胶酶为CgiV。

[0015] 优选：所述水解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为40℃。

[0016] 有益效果：

[0017] 1.本发明的ι-卡拉胶酶CgiV为结构与功能新颖的ι-卡拉胶酶，归属于多糖水解酶第82家族(GH82)，其氨基酸序列与已有的ι-卡拉胶酶序列相似度为88％。

[0018] 2.本发明提供了一种制备ι-卡拉胶酶CgiV的方法，即利用基因工程的技术方法，将CgiV的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经摇瓶发酵后，发酵液酶活力达到37.9U/mL。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达88.6％，蛋白质纯度高达
98.2％。

[0019] 3.本发明的ι-卡拉胶酶CgiV具有优良的理化性质，具有热稳定特性，在50℃的活性半衰期长达0.7h，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h。降解产物分析，该酶降解主产物为ι-卡拉胶二糖和四糖。

[0020] 综上所述，本发明所述的ι-卡拉胶酶CgiV具有良好的工业化应用前景。

[0021] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

[0022] 保藏日期：2018年11月12日；

[0023] 保藏编号：CCTCC No：M2018769。

附图说明

[0024] 图1为本发明ι-卡拉胶酶CgiV蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化所得ι-卡拉胶酶CgiV)；

[0025] 图2为本发明ι-卡拉胶酶CgiV的最适反应温度；

[0026] 图3为本发明ι-卡拉胶酶CgiV的温度稳定性；

[0027] 图4为本发明ι-卡拉胶酶CgiV在30℃的活性半衰期；

[0028] 图5为本发明ι-卡拉胶酶CgiV在40℃的活性半衰期；

[0029] 图6为本发明ι-卡拉胶酶CgiV在50℃的活性半衰期；

[0030] 图7为薄层层析(TLC)法检测本发明ι-卡拉胶酶CgiV的酶解产物(M，ι-卡拉胶寡糖DP2、4糖DP4标准品；0，酶解前底物；1，酶解后产物)。

具体实施方式

[0031] 实施例1ι-卡拉胶酶CgiV序列分析

[0032] 本发明所述ι-卡拉胶酶CgiV的产酶基因CgiV来源于海洋细菌Vibrio sp.SY01，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769。包含有1359个碱基序列，编码452个氨基酸序列。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶(GH 82)家族的保守区。已经报道的ι-卡拉胶酶中，与CgiV氨基酸序列相似度最高的为来源于Flavobacterium sp.的GH82家族的ι-卡拉胶酶(Genbank APX55175)，两者之间的氨基酸序列相似度(Identity)为88％。

[0033] 实施例2ι-卡拉胶酶CgiV的重组表达

[0034] 将实施例1中ι-卡拉胶酶CgiV基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

[0035] 正向引物：SEQ ID NO.3：PCgiVF：

[0036] 5’-CATGCCATGGATGATTAAAGCATCTGATTTC-3’(Nco I)

[0037] 反向引物：SEQ ID NO.4：PCgiVR：

[0038] 5’-CCGCTCGAGTTTACCTTGTTTACAGTTTTTTAC-3’(Xho I)

[0039] PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

[0040] PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

[0041] 双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CgiV。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CgiV，保存在-80℃备用。

[0042] 实施例3ι-卡拉胶酶CgiV的发酵及纯化制备方法

[0043] 将实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CgiV转接至LB液体培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD600＝0.6。加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导24h。ι-卡拉胶酶活性利用DNS法测定，具体方法为：100μl酶液加入900μl 0.3％ι-卡拉胶底物(20mM磷酸盐缓冲液，pH＝7.0)，在40℃下反应10min，加入750μl DNS试剂终止反应，沸水中煮沸10min，用分光光度计测定A520的数值。对照组加入样品后直接加入750μL的DNS试剂并沸水煮沸10min后检测。酶活力定义为：每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶用量定义为一个酶活力单位(U)。经检测，发酵液中ι-卡拉胶酶的酶活力为37.9U/mL。

[0044] 发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；上样于镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到88.6％。纯化所得酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，纯化所得CgiV的分子量约为45kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得ι-卡拉胶酶的蛋白纯度达到98.2％。

[0045] 实施例4温度对ι-卡拉胶酶CgiV的影响

[0046] 为了检测卡拉胶酶最适反应温度，0.3％的卡拉胶底物分别置于0-70℃保温10min后加入将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶(溶解于pH7.0的磷酸盐缓冲液)，用DNS法检测酶活性，根据OD520的数值确定酶促反应的最适反应温度，以酶活性最高时的活性定义为100％。如图2所示，ι-卡拉胶酶CgiV的最适反应温度为40℃。

[0047] 将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶1mL在不同温度(0-70℃)下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度(40℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图3所示，ι-卡拉胶酶CgiV温度稳定性较好，在40℃下孵育1h，仍然可保持87.3％的活性，在50℃下孵育1h，仍然可保持37.2％的活性。

[0048] 实施例5ι-卡拉胶酶CgiV的热稳定性测定

[0049] 将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶CgiV分别在30℃、40℃、50℃孵育不同时间，分别检测剩余的酶活力，以孵育前的活力作为100％，利用origin软件计算酶活力在不同温度下丧失一半的时间，即活性半衰期(t1/2)。如图4所示，CgiV在30℃下保持良好的稳定性，活性半衰期(t1/2)长达42h；如图5所示，CgiV在40℃下的活性半衰期(t1/2)为6.5h；如图6所示，CgiV在50℃下的活性半衰期(t1/2)为0.7h。通过半衰期检测发现，本发明所提供的ι-卡拉胶酶CgiV具备良好的热稳定性，在运输和发生催化过程中，具备良好的应用前景。

[0050] 实施例6ι-卡拉胶酶CgiV酶解产物薄层层析分析

[0051] 将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶CgiV纯酶(20U)与0.1％的ι-卡拉胶在40℃下孵育6h，然后在高效薄层层析板(HPTLC)检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2h的HPTLC层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰乙酸:水＝2:1:1)的展缸中20min，吹干层析板，浸入显色剂(苯胺二苯胺)中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图7所示，与标准品迁徙率比较发现，ι-卡拉胶酶CgiV酶解主产物为二糖(DP2)和四糖(DP4)。