一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用转让专利
申请号 : CN201910211067.2
文献号 : CN109735524B
文献日 : 2020-11-06
发明人 : 陈豪 , 陈鹏 , 狄国虎 , 郑洲
申请人 : 青岛大学
摘要 :
本发明涉及一种具有嗜冷（Cold‑adapted）特性的内切型碱性果胶酶PelV307及其应用。所述果胶酶PelV307的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的果胶酶PelV307氨基酸序列与已知功能的果胶酶的相似度只有56%。本发明所述的果胶酶最适反应温度为30℃，在0℃和10℃下的酶活力分别能达到30℃活性下的33.4%和68.6%。本发明所述果胶酶为碱性果胶酶，最适反应pH为8.6，降解方式为内切，降解产物为二糖和三糖，具有良好的应用前景。
权利要求 :
1.一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.如权利要求1所述的果胶酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
3.如权利要求1所述的果胶酶的制备与纯化方法，其特征是：所述步骤如下：
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307转接至LB液体培养基中，含50 μg/mL卡纳霉素，在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD600=0 .6，加入终浓度为0 .1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h，发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液，上样于5 mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 ml/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分，将活性成分透析去除咪唑即可；
所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307制备方法如下：
将果胶酶PelV307的产酶基因序列，如SEQ ID NO.2所示，以限制性内切酶Nde I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下：正向引物：SEQ ID NO .3：pelV307EF： 5’- CATATGTCTCAAAAATACCTATCTCT-3’ (Nde I)，反向引物：SEQ ID NO .4：pelV307ER： 5’- CTCGAGTAGGTATAGTTTACCAGCACC -3’ (Xho I) ，PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟，PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS，购自大连宝生物公司， PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物，pET24a (+)质粒DNA，购自美国Invitrogen公司，同样用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段，酶切所用酶和底物反应体系均参照大连宝生物提供的产品说明操作，双酶切处理的PCR产物和pET-24a(+)质粒载体参照DNA连接酶，购自大连宝生物公司，根据说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株，购自美国Invitrogen公司，涂布在 Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上，含有50 μg/mL卡纳霉素的，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中，含有50 μg/mL卡纳霉素，转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜，将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET-24a(+)-pelV307，重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，购自大连宝生物公司，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307，保存在-80℃备用；
所述果胶酶PelV307的产酶基因序列pelV307为人工合成序列。
4.如权利要求1所述的果胶酶在裂解大分子果胶中的应用。
5.如权利要求1所述的果胶酶在制备不饱和果胶寡糖中的应用。
6.一种果胶寡糖的制备方法，其特征是，将权利要求1所述的具有嗜冷特性的碱性果胶酶加入900 μl 0.3%果胶底物，20 mM GlyNaOH缓冲液，pH=8.6，在0-60℃下反应10 min。
说明书 :
一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 果胶是植物细胞壁和中胶层的重要组成部分，主要是直链α-1,4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸残基组成的复合多糖，一般带有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、乳糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起，含有20种不同的糖苷键。
[0003] 果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布在高等植物和微生物中。目前多种微生物来源果胶酶已经进入到商品化应用阶段，销售额可占到微生物酶制剂产值的25%。但是目前商品化的果胶酶多为酸性果胶酶，在碱性条件下活性较弱。碱性果胶酶研究较少，寻找具有特殊性质的碱性果胶酶，并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。
发明内容
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有嗜冷（Cold-adapted）特性的碱性果胶酶PelV307及其应用。该酶与已有功能的果胶酶的氨基酸相似度仅为56%。最适反应温度为30℃，最适反应pH为8.6；具有嗜冷的特性，在0 ℃和10 ℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为不饱和二糖和三糖。
[0005] 一方面，本发明提供一种新型具有嗜冷特性的碱性果胶酶PelV307，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] SEQ ID NO.1：
[0007] MSQKYLSLSLVSLAVAGSMALNSAYAASLSTNQELTAADIGYATENGGTTGGADAVSDNIYLVSNKTDFKAALKEDKGEPRIIQISGTIDISGGEEYSDFDDQKSRSQIKIPADTTIIGVTSDAGFTNGSLVVSKVENVIIRNISIETPVDVEPHYEDGDGWNAEWDSMTITYSTNVWVDHVTFDDGSFTDADYEEVDGEEYVQHDGQLDIKHGSDYVTVSNSIFKNHNKTMLIGHSKSNSSEDDGHLRVTLANNIFSSIIQRTPRVRFGKIHVFNNLFEGDYKDDTYGYMYSFGLGYKGSIFSEKNIFTIDNLKDSKKCKLVSVKQSNSSLLDDDSVFNGSSLSLDDCDIPTDNLSWTVPYNYSLLSTDELEASLESNAGAGKLYL
[0008] 另一方面，本发明还提供所述果胶酶PelV307对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
[0009] SEQ ID NO.2：
[0010] ATGTCTCAAAAATACCTATCTCTATCTCTAGTTTCTCTAGCTGTTGCTGGTTCTATGGCTCTAAACTCTGCTTACGCTGCTTCTCTATCTACTAACCAAGAACTAACTGCTGCTGACATCGGTTACGCTACTGAAAACGGTGGTACTACTGGTGGTGCTGACGCTGTTTCTGACAACATCTACCTAGTTTCTAACAAAACTGACTTCAAAGCTGCTCTAAAAGAAGACAAAGGTGAACCACGTATCATCCAAATCTCTGGTACTATCGACATCTCTGGTGGTGAAGAATACTCTGACTTCGACGACCAAAAATCTCGTTCTCAAATCAAAATCCCAGCTGACACTACTATCATCGGTGTTACTTCTGACGCTGGTTTCACTAACGGTTCTCTAGTTGTTTCTAAAGTTGAAAACGTTATCATCCGTAACATCTCTATCGAAACTCCAGTTGACGTTGAACCACACTACGAAGACGGTGACGGTTGGAACGCTGAATGGGACTCTATGACTATCACTTACTCTACTAACGTTTGGGTTGACCACGTTACTTTCGACGACGGTTCTTTCACTGACGCTGACTACGAAGAAGTTGACGGTGAAGAATACGTTCAACACGACGGTCAACTAGACATCAAACACGGTTCTGACTACGTTACTGTTTCTAACTCTATCTTCAAAAACCACAACAAAACTATGCTAATCGGTCACTCTAAATCTAACTCTTCTGAAGACGACGGTCACCTACGTGTTACTCTAGCTAACAACATCTTCTCTTCTATCATCCAACGTACTCCACGTGTTCGTTTCGGTAAAATCCACGTTTTCAACAACCTATTCGAAGGTGACTACAAAGACGACACTTACGGTTACATGTACTCTTTCGGTCTAGGTTACAAAGGTTCTATCTTCTCTGAAAAAAACATCTTCACTATCGACAACCTAAAAGACTCTAAAAAATGTAAACTAGTTTCTGTTAAACAATCTAACTCTTCTCTACTAGACGACGACTCTGTTTTCAACGGTTCTTCTCTATCTCTAGACGACTGTGACATCCCAACTGACAACCTATCTTGGACTGTTCCATACAACTACTCTCTACTATCTACTGACGAACTAGAAGCTTCTCTAGAATCTAACGCTGGTGCTGGTAAACTATACCTATAA
[0011] 另一方面，本发明还提供一种所述果胶酶PelV307的制备方法。
[0012] 另一方面，本发明还提供了所述果胶酶PelV307在裂解果胶中的应用。
[0013] 另一方面，本发明还提供了所述果胶酶PelV307在制备果胶寡糖中的应用。
[0014] 另一方面，一种裂解果胶的方法，所选用的果胶酶为所述果胶酶PelV307。
[0015] 优选：所述裂解条件中反应温度为0 60℃。最适反应温度为30℃。~
[0016] 优选：所述裂解条件中反应pH为3.0 10.6。最适反应pH为8.6。~
[0017] 有益效果：
[0018] 1.本发明的果胶酶PelV307为结构与功能新颖的酶，归属于多糖裂解酶第1家族（PL-1），其氨基酸序列与已知功能的果胶酶序列相似度最高仅为56%。
[0019] 2.本发明提供了一种制备该新型果胶酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将果胶酶PelV307的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经摇瓶发酵后，发酵液酶活力高达120.9 U/mL。并且该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率达到71.3%，蛋白质纯度高达95%。
[0020] 3.本发明的果胶酶PelV307具有优良的理化性质，该酶最适反应pH为8.6。并且，其具有嗜冷特性，在0 ℃和10 ℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为不饱和果胶二糖和三糖
[0021] 综上所述，本发明所述的果胶酶PelV307具有良好的应用前景。
附图说明
[0022] 图1为本发明果胶酶PelV307与已知功能果胶酶序列之间的进化关系结果；
[0023] 图2为本发明果胶酶PelV307蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得果胶酶PelV307）；
[0024] 图3为本发明果胶酶PelV307的温度和pH适应性分析（A，果胶酶PelV307的最适反应温度；B，果胶酶PelV307的温度稳定性；C，果胶酶PelV307的最适反应pH；D，果胶酶PelV307的pH稳定性）；
[0025] 图4为本发明粘度法检测果胶酶PelV307的降解方式（实线为反应体系粘度变化，虚线为反应体系A235变化）；
[0026] 图5为高效液相法（A）和阴离子一级质谱法（B）检测本发明果胶酶PelV307的降解产物（DP2，不饱和果胶二糖；DP3，不饱和果胶三糖）。
具体实施方式
[0027] 实施例1 果胶酶PelV307序列分析
[0028] 本发明所述果胶酶PelV307的产酶基因pelV307为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌Vibrio sp. HY628具有较高的果胶酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的果胶酶序列。我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了序列优化，并由华大基因公司进行全合成。本发明所述果胶酶PelV307包含有1164个碱基序列，编码387个氨基酸序列。利用National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain (CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool (Blast)发现，该序列包含有一个多糖裂解酶第1家族（PL-
1）的保守区。已经报道的果胶酶中，与PelV307氨基酸序列相似度最高的为来源于Dickeya chrysanthemi的多糖裂解酶第1家族（PL-1）的果胶酶PelD（Genbank AAA24854），两者之间的氨基酸序列相似度（Identity）为56%。本发明所述的果胶酶PelV307氨基酸序列进行Blast分析，将其与已报道的果胶酶，利用ClustalX软件进行多重序列比对，并利用Mega
7.1软件进行进化树分析。如图1所示，果胶酶PelV307与其他已经报道的果胶酶具有较远的亲缘关系，为一个新颖的果胶酶。
1）的保守区。已经报道的果胶酶中，与PelV307氨基酸序列相似度最高的为来源于Dickeya chrysanthemi的多糖裂解酶第1家族（PL-1）的果胶酶PelD（Genbank AAA24854），两者之间的氨基酸序列相似度（Identity）为56%。本发明所述的果胶酶PelV307氨基酸序列进行Blast分析，将其与已报道的果胶酶，利用ClustalX软件进行多重序列比对，并利用Mega
7.1软件进行进化树分析。如图1所示，果胶酶PelV307与其他已经报道的果胶酶具有较远的亲缘关系，为一个新颖的果胶酶。
[0029] 实施例2 果胶酶PelV307的重组表达
[0030] 将实施例1中所述的果胶酶PelV307的产酶基因序列以限制性内切酶Nde I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点）：
[0031] 正向引物：SEQ ID NO.3：pelV307EF：
[0032] 5’- CATATGTCTCAAAAATACCTATCTCT-3’ (Nde I)
[0033] 反向引物：SEQ ID NO.4：pelV307ER：
[0034] 5’- CTCGAGTAGGTATAGTTTACCAGCACC -3’ (Xho I)
[0035] PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共 30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。
[0036] PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET24a (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。
[0037] 双酶切处理的PCR产物和pET-24a(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL卡纳霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL卡纳霉素），转速为
180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET-24a(+)-pelV307。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307，保存在-80℃备用。
180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET-24a(+)-pelV307。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307，保存在-80℃备用。
[0038] 实施例3 果胶酶PelV307的发酵及纯化制备方法
[0039] 将实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307转接至LB液体培养基中（50 μg/mL卡纳霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD600=0.6，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h。果胶酶活性测定方法为：100 μl酶液加入900 μl 0.3%果胶底物（20 mM Gly-NaOH缓冲液，pH=8.6），在30℃下反应10 min，用分光光度计测定A235数值。酶活力定义为1 ml酶液引起A235数值增加0.1为一个酶活力单位。发酵液酶活力可达120.9 U/mL。
[0040] 发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液，上样于5 mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 ml/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到71.3%。纯化所得果胶酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图2所示，纯化所得PelV307的分子量大约为36.5 kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得果胶酶PelV307的蛋白纯度达到95%以上。
[0041] 实施例4 温度和pH对果胶酶PelV307的影响
[0042] 将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307 100 μl加入900 μl 0.3%果胶底物（20 mM Gly-NaOH缓冲液，pH=8.6），在不同温度（0-60℃）下反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下果胶酶PelV307的相对酶活力。如图3A所示，果胶酶PelV307的最适反应温度为30℃。具有嗜冷的特性，在0 ℃和10 ℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。
[0043] 将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307（1 ml）在不同温度（0-60 ℃）下孵育1 h，取出后，立即在其最适反应温度（30℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3B所示，果胶酶PelV307温度稳定性较差，在30 ℃下孵育1 h，酶即失去大部分活性，利于在反应过程中定向灭活，终止反应。
[0044] 将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307 100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（Gly-NaOH缓冲液，pH=8.6），在4种不同缓冲液中反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同pH条件下果胶酶PelV307的相对酶活力。使用的4种缓冲液分别为50 mM 磷酸盐缓冲液，甘氨酸-NaOH缓冲液，Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液。如图3C所示，果胶酶PelV307的最适反应pH为8.6。
[0045] 将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307在不同pH条件（3-10.6）下孵育12 h，取出后，立即在其最适反应pH（8.6）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3D所示，果胶酶PelV307只在比较狭窄的pH范围内保持稳定。
[0046] 实施例5 果胶酶PelV307降解方式的粘度法检测
[0047] 使用乌氏粘度计进行降解方式的确定，0.1 ml果胶酶PelV307酶液（30 U）加入9.9 ml 0.3%果胶底物，30℃反应不同时间（1、5、10、30、60 min），煮沸10 min终止反应。在室温条件下，利用乌氏粘度计计算不同酶解时间的产物粘度。同时，利用A235法测定不同酶解时间的产物的吸光度变化，测定对应的酶活力。通过测定结果（图4）可知，酶解反应初期（1-5分钟），产物粘度急剧下降，而此时A235法检测的酶解产物形成的不饱和双键没有急剧增加，说明果胶酶PelV307的酶解方式为内切。
[0048] 实施例6 果胶酶PelV307降解产物的高效液相检测
[0049] 将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307（10 U）与0.1%的果胶底物共孵育过夜，降解产物12,000 g离心10分钟，弃沉淀，将上清20 μl上样至预平衡（0.2 M的碳酸氢铵）的凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300）。流速为0.6 ml/min，流动相为0.2 M的碳酸氢铵，检测时间为40分钟，在235 nm下检测吸光度。如图5A所示，与标准寡糖出峰时间进行比对发现，果胶酶PelV307的降解产物主要为不饱和果胶二糖和三糖。
[0050] 实施例7 果胶酶PelV307酶解产物质谱（ESI-MS）分析
[0051] 将实施例6中孵育所得样品进行脱盐处理，并与乙腈进行等体积混合，进行阴离子一级质谱检测，确定酶解产物的分子量。阴离子模式一级质谱结果表明（图5B），降解主产物为不饱和果胶二糖和三糖，与HPLC检测结果一致。