一种GLI2-shRNA及其用途

摘要

本发明公开了一种GLI2‑shRNA及其用途，其核苷酸序列为：GATCCGTGTGGAGGACTGCCTACATA TTTCAAGAGAATATGTAGGCAGTCCTCCACATTTTTTATGTTTTTTA。还公开一种载体和宿主及用途。本发明能有效降低GLI2mRNA及蛋白的表达，同时能够上调肝内胆管上皮细胞E‑cadherin的表达，并下调Vim及α‑SMA的蛋白表达水平进而逆转胆管上皮细胞的上皮间充质转换。

权利要求

1.一种GLI2-shRNA，其对应的DNA序列为SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的GLI2-shRNA在用于制备治疗胆道闭锁药物上的应用。

说明书

一种GLI2-shRNA及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种GLI2-shRNA及其用途。

背景技术

[0002] 胆道闭锁是一种炎性硬化性胆管病变，是导致儿童肝移植的主要疾病，胆管上皮细胞发生上皮间充质转换(EMT)是导致肝纤维化的主要病理进程之一。研究证明，EMT在胚胎发育、组织的再生修复、器官纤维化、癌细胞的转移中起重要作用。许多组织器官损伤后通过EMT机制形成纤维组织、瘢痕组织达到创伤修复，但这一过程持续存在可造成组织器官纤维化、硬化，如肺纤维化、肾脏纤维化等。Shh信号通路在胚胎发育、上皮一间充质和上皮一上皮之间的信号传导中、细胞分化及组织修复中发挥重要作用，而在正常成熟组织中处于失活状态。研究发现Shh信号通路异常激活与胆道闭锁中上皮间充质转化密切相关。Glis是该通路的终末转录因子，Gli2作为该通路的主要效应因子可直接反映通路的活性状态参与胆道闭锁的发生与发展。因此特异性沉默Gli2对于其在疾病中的作用机制研究至关重要，为相关疾病的治疗提供应用基础。目前还没有关于沉默Gli2mRNA及蛋白质表达的基因的相关文献。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种沉默Gli2的基因序列，该沉默Gli2的基因能有效降低GLI2mRNA及蛋白的表达，同时能够上调肝内胆管上皮细胞E-cadherin的表达，并下调Vim及α-SMA的蛋白表达水平进而逆转胆管上皮细胞的上皮间充质转换。

[0004] 本发明通过下述技术方案实现：

[0005] 一种GLI2-shRNA及其用途，其核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。其中SEQIDNO：1为：

[0006] GATCCGTGTGGAGGACTGCCTACATATTTCAAGAGAATATGTAGGCAGTCCTCCACATTTTTTATGTTTTTTA。

[0007] 含前所述的GLI2-shRNA基因的载体。

[0008] 含如前所述的载体的宿主。

[0009] 进一步的，宿主为沉默Gli2的重组慢病毒，由如权利要求1所述的沉默Gli2的基因序列构建到载体上再由慢病毒包装而得。

[0010] 进一步的，沉默Gli2的重组慢病毒的构建方法，包括以下步骤：

[0011] 1)、将沉默Gli2的基因序列经酶切后连接至载体上，转化挑取阳性克隆，进行测序鉴定，得到正确的克隆；

[0012] 2)、将正确的克隆PCR扩增后提取重组质粒，将重组质粒与辅助质粒一起质粒转染到宿主细胞中进行慢病毒包装，获得重组慢病毒。如上所述的载体可以为pLent-U6-Puro载体等，如上所述的辅助质粒可以为pMDLg-pRRE、pMD2.G、pRSV-Rev病毒包装辅助质粒等，如上所述宿主细胞可以为293T细胞等。本发明所提及的载体、辅助质粒和宿主细胞并不局限于上述所举，只要依据本发明的沉默基因序列所设计的载体、慢病毒等均在本发明的保护范围内。

[0013] 为更好的说明本发明，一种GLI2-shRNA及其用途的构建方法，为根据GLI2CDS序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别GLI2的沉默序列如SEQIDNO：1所示并通过现有技术进行合成。

[0014] 如前所述的基因在用于制备治疗胆道闭锁药物上的应用。

[0015] 进一步的，上述应用为用于制备逆转胆管上皮细胞的上皮间充质转换药物上的应用。

[0016] 进一步的，上述应用为用于制备降低GLI2mRNA及蛋白表达、同时上调肝内胆管上皮细胞E-cadherin的表达、下调Vim及α-SMA的蛋白表达水平药物上的应用。

[0017] 本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

[0018] 本发明能有效降低GLI2mRNA及蛋白的表达，同时能够上调肝内胆管上皮细胞E-cadherin的表达，并下调Vim及α-SMA的蛋白表达水平进而逆转胆管上皮细胞的上皮间充质转换。

附图说明

[0019] 此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

[0020] 图1为RT-PCR检测Gli2基因图。

[0021] 图2为Western blot检测Gli2蛋白表达水平图。

[0022] 图3为Western blot检测EMT相关蛋白的表达情况图。

具体实施方式

[0023] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

[0024] 实施例1

[0025] 1基因合成及病毒载体构建

[0026] 大致步骤如下：

[0027] 第一步，序列设计

[0028] 根据GLI2CDS序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别GLI2的沉默序列并通过现有技术进行合成。

[0029] 第二步，对目的序列及表达载体进行双酶切

[0030] 将合成的靶序列及pLent-U6-Puro载体进行双酶切，利用胶回收试剂盒回收靶序列及线性载体。

[0031] 第三步，将靶序列与载体进行连接

[0032] 将上一步中的两个产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，转化，提取等步骤获得沉默载体GLI2-shRNA。

[0033] 第四步，慢病毒包装

[0034] 将上一步获得的沉默载体与辅助质粒一起转染293T细胞，经培养，PEG沉淀收集得到GLI2-shRNA慢病毒。

[0035] 第五步，沉默靶蛋白效率检测

[0036] 将得到的GLI2-shRNA慢病毒转染mIBEC细胞，利用QPCR，Western blot等手段检测沉默效率，并检测上皮间充质转换相关蛋白E-cadherin，Vim及α-SMA的蛋白表达水平。

[0037] 具体实施过程如下：

[0038] 1.1.1基因合成Gli2的shRNA基因。

[0039] 以GLI2的CDS序列(小鼠NM_010296)作为基础，在invitrogen公司主页上在线设计GLI2的shRNA，设计原则：19bp的特异性结合GLI2的序列的GC含量45％-55％，同时将选取的片段进行BLAST比对，选择特异性识别GLI2的序列，其核苷酸序列为SEQIDNO：1所述，shRNA采用现有基因合成方法制备，如PCR法，退火温度45-65℃，也可以委托有关专业公司合成。

[0040] 1.1.2载体与目的基因酶切回收

[0041] 表1.1酶切体系

[0042]

[0043] 在1％的琼脂糖凝胶，100v条件下电泳30min，胶回收载体与目的基因片[0044] 1.1.3目的基因片段与载体的连接，连接体系如下：

[0045] 表1.2连接体系

[0046]

[0047] 16℃，孵育0.5-1h。

[0048] 1.2转化及验证

[0049] 1.2.1将要转化的DNA片段加入到装有TOP10感受态细胞的管中，(50μl感受态细胞需要25ng DNA)，体积应不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min。

[0050] 1.2.2将离心管混合物放入42℃水浴，热激90s，不要摇动管。快速将管转移到冰浴中静置2min。

[0051] 1.2.3每管加入200μL SOC液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。

[0052] 1.2.4将已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的LB培养基上。

[0053] 1.2.5倒置平板，于37℃培养，12-16小时后可出现菌斑。

[0054] 1.2.6随机挑取菌落，进行测序验证

[0055] 1.3慢病毒/腺病毒包装

[0056] 1.3.1用DMEM+10％FBS铺板293T细胞，6孔板2mL/孔，细胞密度达到70％-80％时可用于转染。细胞的密度和状态对于病毒包装的影响很大，因此需要保证较少的传代次数和良好的细胞状态。

[0057] 1.3.2转染前将细胞转至无血清培养基中培养。500μL无血清培养基稀释2μg表达质粒+1.5μg pMDLg-pRRE+1.5μg pMD2.G+1.5μg pRSV-Rev病毒包装辅助质粒。

[0058] 1.3.3用500μL无血清培养基稀释15μL Lip2000。5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min。

[0059] 1.3.4从6孔板中吸出1mL无血清培养基，然后滴加入1mL质粒和脂质体混合物。

[0060] 1.3.5 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMEM+10％FBS。

[0061] 1.4收获病毒液

[0062] 1.4.1收集转染后48h(转染即可为0h计起)的细胞上清液，补加培养基继续培养。注意此时收液已含有病毒颗粒，以保鲜膜包裹离心管，置于4℃保存。

[0063] 1.4.2将所收毒液于4℃，5000rpm离心10min，除去细胞碎片。

[0064] 1.4.3以0.45μm滤器过滤上清液于50mL超速离心管中，加入5X PEG8000于4℃沉淀过夜，10000rpm离心弃上清，10mL PBS复溶沉淀。

[0065] 1.4.4在15mL离心管中加入2mL 20％蔗糖溶液，将10mL病毒液小心加入上层，25000rpm、4℃离心2h。

[0066] 1.4.5用1mL PBS重悬沉淀，0.22μm滤器过滤除菌。

[0067] 1.4.6集中后的病毒悬液分装成50μL每份，-80℃保存在成品管中。

[0068] 为进一步说明本发明中Gli2-shRNA的有益效果，特做以下对比实验：

[0069] 1.5 Gli2-shRNA慢病毒感染mIBEC

[0070] 1.5.1取mIBEC，0.125％的胰酶消化30s-1min，将细胞吹下，1000rpm离心5min，弃上清，沉淀用小鼠肝内胆管内皮细胞专用培养基重悬，计数。

[0071] 1.5.2取24孔板及6孔板，24孔板铺板密度为1×10E5个/孔铺24孔板，6孔板铺板密度为5x10E5个/孔，24孔板中提前加入爬片，在37℃，5％CO2条件下培养过夜。

[0072] 1.5.3次日，将病毒进行梯度稀释，使MOI为40。将稀释好的病毒分别加入24孔板，250μL/孔，6孔板加入量为1ml/孔，5h后各孔补加培养基，24h后观察，细胞无病变，不换液。
48h后分别提取RNA，QPCR及Western blot检测Gli2及Gli2，Snail，Slug表达及EMT特征性细胞因子E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表达情况。

[0073] 1.5.4取出24孔板，弃培养上清，PBS洗3次后加4％多聚甲醛固定20min。

[0074] 1.5.5弃固定液，PBS洗涤3次，每次5min。

[0075] 1.5.6封闭：各孔加500μl封闭液(5％胎牛血清+0.3％的Trion，PBS配制)室温封闭30min。

[0076] 1.5.7分别加入CK19(用封闭液1:50稀释)及α-SMA(用封闭液1:400稀释)，4℃孵育过夜

[0077] 1.5.8 PBS洗涤3次，每次5min加入对应属性的二抗(1:400稀释)，室温避光孵育2h。

[0078] 1.5.9 PBS洗涤3次后，加入DAPI工作液染色10min，PBS漂洗3次后加抗荧光淬灭剂封片，拍照。

[0079] 经上述对比实验内容，得到如图1、图2、图3所示结果。从图1、图2、图3可以明显看出，Gli2-shRNA能够可有效降低Gli2的表达，可上调肝内胆管上皮细胞E-cadherin，下调Vim及α-SMA的蛋白表达水平进而逆转肝内胆管上皮细胞的上皮间充质转化。

[0080] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0081] 基因序列表SEQIDNO：1如下，

[0082]