辅助性表位肽及其应用

摘要

本发明涉及辅助性表位肽及其应用。该辅助性表位肽是通过将序列SEQ ID NO:1中的一个或两个氨基酸残基替换为4‑硝基苯丙氨酸得到的。该辅助性表位肽可用于增强抗原或抗原表位的免疫原性，或用于制备或构建疫苗。本发明的辅助性表位肽能通用性地增强现有抗原或抗原表位的免疫原性，提高特异性抗体的滴度，具有潜在的辅助激活CTL效应的能力。

权利要求

1.一种辅助性表位肽，其特征是，所述辅助性表位肽是通过将序列SEQ ID NO:1中的一个或两个氨基酸残基替换为4-硝基苯丙氨酸得到的；所述辅助性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:20之一所示，其中Xaa为4-硝基苯丙氨酸。

2.权利要求1所述辅助性表位肽用于制备或构建疫苗的用途。

3.含有权利要求1所述辅助性表位肽的产品，所述产品为药物、药物组合物、生物芯片、疫苗、或疫苗组合物。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征是，所述疫苗或疫苗组合物为肿瘤疫苗或疫苗组合物。

5.融合抗原，其特征是，由权利要求1所述辅助性表位肽与抗原或抗原表位连接而成；

所述抗原或抗原表位含有氨基酸残基，所述辅助性表位肽与抗原或抗原表位的氨基酸残基相连。

6.根据权利要求5所述的融合抗原，其特征是，所述辅助性表位肽经连接肽与抗原或抗原表位的氨基酸残基相连，所述连接肽序列为GPSL。

7.根据权利要求6所述的融合抗原，其特征是，所述抗原选自HER2、PD-L1、PD-1、EGFR、CD20、CD66e、CD227、VEGFR、IL-2R、CTLA-4、PSMA、TOLL-1、GATA-4、NY-ESO-1、FR-α、CA125、EpCAM-CD3、P53、Mesothelin、WT1、Aβ蛋白之一。

8.根据权利要求6所述的融合抗原，其特征是，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:40-SEQ ID NO:43之一所示。

9.根据权利要求6所述的融合抗原，其特征是，所述融合抗原为多肽，且其序列为SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:39之一、或为SEQ ID NO:44-SEQ ID NO:47之一。

10.含有权利要求5至9任一项所述融合抗原的疫苗或疫苗组合物。

说明书

辅助性表位肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种辅助性表位肽及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

[0002] 肿瘤疫苗是一种最有效、最经济的癌症治疗方案，有限次数的疫苗注射即可带来长期的抗肿瘤免疫反应。而在临床应用中，肿瘤疫苗的治疗效果一直不太理想，其原因除了肿瘤自身抗原性较低以外，机体对于肿瘤抗原的免疫耐受可能也是重要的因素。最新的研究表明，免疫耐受主要是因为体内抗原特异性的CD4+T细胞被消除了，而和CD8+T细胞或者B细胞是否被消除没有太大关系。因此，招募不依赖自身抗原的CD4+T细胞，打破CD4+T细胞的免疫耐受状态，可能是激发肿瘤疫苗治疗潜力的关键步骤。

[0003] CD4+T细胞是人体内免疫反应的开关，能调节免疫反应的强弱。一方面，耐受机制能减弱针对自身抗原的免疫反应，从而维持体内稳态；另一方面，打破耐受能带来针对自身抗原的强烈免疫反应，但与此同时也有诱发自身免疫性疾病的风险。所以，为了使治疗达到最好的效果，我们应该在最小化自身免疫疾病损害的基础上，尽量打破免疫耐受，从而使肿瘤的免疫治疗效果最大化。

[0004] PG·Schultz等人发现，在部分天然的蛋白质中部分位点引入非天然氨基酸可以形成新的MHC-Ⅱ分子限制的CD4表位，提高其免疫原性。同时，因为新的表位完全是外源性的，所以不会引发自身免疫疾病。然而，并不是所有的天然蛋白质或天然多肽引入任意非天然氨基酸，都能提高免疫原性，这就需要研究者来进行针对性研究。本发明的发明人所在课题组以辅助性T表位肽PADRE为研究对象进行了大量研究，以期获得通用性的辅助性表位肽。

[0005] 经检索发现，专利号CN201110303946.1、授权公告号CN102370979B的中国发明专利，公开了一种针对人TNF-α分子的自体疫苗的构建方法，其中用到了PADRE氨基酸序列AKFVAAWTLKA。

[0006] 申请号CN201611207485.7、申请公布号CN106749674A的中国发明专利申请，公开了新型哮喘多肽疫苗及其制备方法，涉及含有PADRE多肽aK-Cha-VAaWTLKAa的融合多肽，其中a表示D-丙氨酸，Cha表示L-环己基丙氨酸。

[0007] 然而，以上述技术方案为代表的现有技术中尚不存在以PADRE多肽为基础进行改造获得的通用性辅助性表位肽。

发明内容

[0008] 本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种辅助性表位肽，具有通用性，能增强抗原或抗原表位的免疫原性；此外，还提供涉及该辅助性表位肽的用途。

[0009] 为实现上述主要目的，本发明的技术方案如下：

[0010] 一种辅助性表位肽，其特征是，该辅助性表位肽是通过将序列SEQ ID NO:1中的一个或两个氨基酸残基替换为4-硝基苯丙氨酸得到的。

[0011] 优选地，该辅助性表位肽的序列为SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:20之一。

[0012] 本发明还提供：

[0013] 前文所述辅助性表位肽的用途，所述用途为用于增强抗原或抗原表位的免疫原性，所述抗原或抗原表位含有氨基酸残基；或者，所述用途为用于制备或构建疫苗。

[0014] 含有前文所述辅助性表位肽的产品，所述产品为药物、药物组合物、生物芯片、疫苗、或疫苗组合物。所述疫苗或疫苗组合物包括肿瘤疫苗或疫苗组合物。

[0015] 本发明还提供：

[0016] 融合抗原，其特征是，由前文所述辅助性表位肽与抗原或抗原表位连接而成；所述抗原或抗原表位含有氨基酸残基，所述辅助性表位肽与抗原或抗原表位的氨基酸残基相连。

[0017] 优选地，所述辅助性表位肽经连接肽与抗原或抗原表位的氨基酸残基相连，所述连接肽序列为GPSL。

[0018] 优选地，所述抗原或抗原表位为HER2、PD-L1、PD-1、EGFR、CD20、CD66e、CD227、VEGFR、IL-2R、CTLA-4、PSMA、TOLL-1、GATA-4、NY-ESO-1、FRα、CA125、EpCAM-CD3、P53、Mesothelin、WT1、Aβ蛋白之一，或者为SEQ ID NO:40-SEQ ID NO:43之一。

[0019] 优选地，所述融合抗原为多肽，且其序列为SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:39之一、或为SEQ ID NO:44-SEQ ID NO:47之一。

[0020] 本发明还提供：

[0021] 含有前文所述融合抗原的疫苗或疫苗组合物。

[0022] 发明人在深入地反复实践研究中发现，以辅助性T表位肽PADRE为基础(PADRE序列为AKFVAAWTLKAAA)，将其中的一个或两个氨基酸残基替换为4-硝基苯丙氨酸(又名：对硝基苯丙氨酸)后所得的辅助性表位肽，能显著增强已有抗原或抗原表位的免疫原性，打破CD4+T细胞免疫耐受，而且该辅助性表位肽具有通用性。

[0023] 与现有技术相比，本发明的辅助性表位肽能通用性地增强现有抗原(如HER2分子、PD-L1分子等)或抗原表位(如B细胞表位等)的免疫原性，提高特异性抗体的滴度；该辅助性表位肽完全是外源性的，在打破免疫耐受的同时，不会引起自身免疫性疾病等反应，生理毒性较低；该辅助性表位肽具有潜在的辅助激活CTL效应的能力，在临床上可以辅助构建个性化疫苗，治疗预防肿瘤；该辅助性表位肽具有优异的辅助已有抗原或抗原表位产生抗体或产生CTL效应的能力，对于构建高效、持久的疫苗提供了思路和前期基础。

附图说明

[0024] 图1至图19分别为实施例2的试验例1至19的结果示意图。

[0025] 图20至图22分别为实施例2的试验例21至23的结果示意图。

[0026] 图23为实施例2的试验例20的结果示意图。

[0027] 图24为实施例2的试验例24的结果示意图。

具体实施方式

[0028] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

[0029] 实施例1、构建辅助性表位肽

[0030] 以序列SEQ ID NO:1的辅助性T表位肽PADRE为基础，将其中的一个氨基酸或两个氨基酸残基替换为4-硝基苯丙氨酸，所得序列如下表所示：

[0031]

[0032]

[0033]

[0034] 注：各序列中的X为4-硝基苯丙氨酸。

[0035] 实施例2、验证辅助性表位肽的实施效果

[0036] 从实施例1中选取辅助性表位肽和不同的抗原分子相结合，构建融合抗原，验证其诱导产生抗体或诱导产生CTL效应的能力。该试验的主要步骤为：

[0037] (1)将辅助性表位肽经连接肽与不同的抗原或抗原表位相连，连接肽序列为GPSL(即Gly-Pro-Ser-Leu)，构建出多个融合抗原。

[0038] (2)将(1)所得融合抗原分别与完全弗氏佐剂相1：1等体积混合乳化，以每只小鼠皮下注射50μg融合抗原的剂量进行免疫，实验小鼠品系包括C57、Balb/c和Fvb；分别在初次免疫7天和14天后，将(1)所得融合抗原和不完全弗氏佐剂1：1等体积混合乳化，以每只小鼠皮下注射50μg融合抗原的剂量进行免疫。

[0039] (3)检测方法有两种，第一种为：分别取初次免疫7天、14天、21天和28天的小鼠眼眶全血，离心取血清，通过间接ELISA法检测抗体滴度；第二种为：免疫完成后一周，处死小鼠，取脾脏，分离出PBMC(外周血单核细胞)，采用LDH(乳酸脱氢酶)试剂盒检测CTL效应。

[0040] 按照上述主要步骤，本实施例的主要实施过程如下：

[0041] 第一步、构建融合抗原后，针对每个融合抗原，将6-8周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为3组，每组6只，分别为PBS组，现有抗原或抗原表位组，抗原-PADRE或抗原表位-PADRE组，以及含融合抗原的疫苗组。

[0042] 第二步、采用皮下免疫的方式，免疫3次，间隔一周，每次50μg。与弗氏佐剂1:1等体积混合。

[0043] 第三步、采用方法1或方法2进行检测。

[0044] 方法1：免疫后每周取血，6000rpm离心20min分离血清，共取4周。采用如下间接ELISA法检测抗体滴度。

[0045] (1)包被：将现有抗原或抗原表位用包被液稀释至5μg/mL，在酶标条中每孔加入100μL，置于37℃恒温箱中孵育2h；

[0046] (2)PBST清洗5次，每次5min；

[0047] (3)封闭：在酶标条中每孔加入150μL封闭液，置于4℃孵育过夜；

[0048] (4)重复步骤(2)；

[0049] (5)孵一抗：将采集的小鼠血清用抗体稀释液倍比稀释后，每孔加入100μL，置于37℃恒温孵育2h；

[0050] (6)重复步骤(2)；

[0051] (7)孵二抗：HRP-goat-anti-mouse IgG用抗体稀释液按1:10000的比例稀释，每孔加入100μL，置于37℃恒温孵育45min；

[0052] (8)重复步骤(2)；

[0053] (9)加底物：酶标条中每孔加入100μl TMB底物反应液，置于37℃恒温箱中避光孵育15min；

[0054] (10)终止反应：每孔加入50μl 2M的H2SO4终止液终止反应。

[0055] (11)显色：在450/630nm下，检测孔内样品的吸光值。

[0056] 方法2：免疫完成后一周，处死小鼠，取脾脏，分离出PBMC(外周血单核细胞)，采用LDH(乳酸脱氢酶)试剂盒检测CTL效应。

[0057] (1)设置对照组：共分为效应细胞自发释放组、实验组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、体积校正对照组和背景对照组；

[0058] (2)250g离心4分钟，以使效应细胞与靶细胞充分接触；

[0059] (3)37℃，5％CO2孵育检测板4小时；靶细胞最大释放组中加入裂解液，每100μl培养基加10μl裂解溶液(10×)。该体系中Triton X-100的浓度为0.8％，可使靶细胞完全裂解(收获上清前45分钟加入裂解溶液)；

[0060] (4)250g离心4分钟；

[0061] (5)转移50μl上清至另一孔板；

[0062] (6)解冻检测缓冲液，取12ml(避光)，将剩余的迅速冻存(可以使用37℃水浴解冻，但不可放置过长时间)。将12ml检测缓冲液添加到一瓶底物混合液(可用于两个96孔板)中，倒置混匀；稀释后，避光、迅速添加；

[0063] (7)50μl/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30分钟(未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃保存6-8周；

[0064] (8)添加50μl终止溶液，将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值(490或492nm)；

[0065] (9)结果统计，细胞杀伤率(％)＝[(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)]×100％。

[0066] 采用间接ELISA法检测的试验例如下表所示：

[0067] 试验序号 辅助性表位肽 现有抗原或抗原表位 融合抗原序列 间接ELISA法结果图1 SEQ ID NO:2 HER2抗原表位 SEQ ID NO:21 图1
2 SEQ ID NO:3 PD-L1分子 SEQ ID NO:22 图2
3 SEQ ID NO:4 PD-1胞外区 SEQ ID NO:23 图3
4 SEQ ID NO:5 EGFR SEQ ID NO:24 图4
5 SEQ ID NO:6 CD20 SEQ ID NO:25 图5
6 SEQ ID NO:7 CD66e SEQ ID NO:26 图6
7 SEQ ID NO:8 CD227胞外区 SEQ ID NO:27 图7
8 SEQ ID NO:9 VEGFR胞外区 SEQ ID NO:28 图8
9 SEQ ID NO:10 IL-2Ra SEQ ID NO:29 图9
10 SEQ ID NO:11 CTLA-4 SEQ ID NO:30 图10
11 SEQ ID NO:12 PSMA SEQ ID NO:31 图11
12 SEQ ID NO:13 TOLL-1 SEQ ID NO:32 图12
13 SEQ ID NO:14 GATA-4 SEQ ID NO:33 图13
14 SEQ ID NO:15 NY-ESO-1 SEQ ID NO:34 图14
15 SEQ ID NO:16 FR-α SEQ ID NO:35 图15
16 SEQ ID NO:17 EPCAM SEQ ID NO:36 图16
17 SEQ ID NO:18 P53 SEQ ID NO:37 图17
18 SEQ ID NO:19 Mesothelin SEQ ID NO:38 图18
19 SEQ ID NO:20 WT1 SEQ ID NO:39 图19
20 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:47 图23
24 SEQ ID NO:6 Aβ蛋白-42 SEQ ID NO:48 图24

[0068] 各图所表示的结果如下：

[0069] 图1显示，与HER2抗原表位组、HER2-PADRE组相比，本实施例所构建的HER2融合抗原组(即HER2-1pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:21，即TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDML RHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTGPSLXKFVAAWTLKAAA。

[0070] 图2显示，与PD-L1分子组、PD-L1-PADRE组相比，本实施例所构建的PD-L1融合抗原组(即PD/L1-2pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:22，即MQLKPMEINPEMLNKVLSRLGVAGQWRFVDVLGLEEESLGSVPAPACALLLLFPLTAQHENFRKKQIEELKGQEVSPKVYFMKQTIGNSCGTIGLIHAVANNQDKLGFEDGSVLKQFLSETEKMSPEDRAKCFEKNEAIQAAHDAVAQEGQCRVDDKVNFHFILFNNVDGHLYELDGRMPFPVNHGASSEDTLLKDAAKVCREFTEREQGEVRFSAVALCGPSLAXFVAAWTLKAAA。

[0071] 图3显示，与PD-1胞外区组、PD-1-PADRE组相比，本实施例所构建的PD-1融合抗原组(即PD/1-3pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:23，即PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVGPSLAKXVAAWTXKAAA。

[0072] 图4显示，与EGFR组、EGFR-PADRE组相比，本实施例所构建的EGFR融合抗原组(即EGFR-4pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:24，即MERKERPFDVIGQLAALRRYARSLVRNSDDAEDLVHDALLRAYEKKQSFRRGGNLRTWLLSIMHNAHIDRVRQARSLARRHDEAAVEAEQSLQAGQEHAVRLKQVRDAFFHLSEEQREALHLVAIEDLSYQEAAMALDIPIGTLMSRISRARAQLREFEEKTPRAAHLRLIGGDGNEGNGPSLAKFXAAWTLKAAA。

[0073] 图5显示，与CD20组、CD20-PADRE组相比，本实施例所构建的CD20融合抗原组(即CD20-5pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:25，即MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSPGPSLAKFVXAWTLKAAA。

[0074] 图6显示，与CD66e组、CD66e-PADRE组相比，本实施例所构建的CD66e融合抗原组(即CD66e-6pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:26，即KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGPSLAKFVAXWTLKAAA。

[0075] 图7显示，与CD227胞外区组、CD227-PADRE组相比，本实施例所构建的CD227融合抗原组(即CD227-7pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:27，即SGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGGPSLAKFVAAXTLKAAA。

[0076] 图8显示，与VEGFR胞外区组、VEGFR-PADRE组相比，本实施例所构建的VEGFR融合抗原组(即VEGFR-8pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:28，即ASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILT IKANTTLQITCRGQRDLDWLWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKKGFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKSLISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECANEPSQAVSVTNPYPCEEWRSVEDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTRGPEITLQPDMQPTEQESVSLWCTADRSTFENLTWYKLGPQPLPIHVGELPTPVCKNLDTLWKLNATMFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCLAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPTITGNLENQTTSIGESIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDEGLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIEGAQEKTNLEGPSLAKFVAAWXLKAAA。

[0077] 图9显示，与IL-2Ra组、IL-2Ra-PADRE组相比，本实施例所构建的IL-2Ra融合抗原组(即IL/2Ra-9pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:29，即ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQGPSLAKFVAAWTXKAAA。

[0078] 图10显示，与CTLA-4组、CTLA-4-PADRE组相比，本实施例所构建的CTLA-4融合抗原组(即CTLA/4-10pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:30，即KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDGPSLAKFVAAWTLXAAA。

[0079] 图11显示，与PSMA组、PSMA-PADRE组相比，本实施例所构建的PSMA融合抗原组(即PSMA-11pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:31，即QGQAQQQAYDRGITIFSPDGRLYQVEYAREAVKRGTASIGVRTPEGVVLAADKRSRSPLMEPTSVEKIHKADDHIGIASAGHVADARQLIDFARRQSQVNRLRYGEPIGIETLTKEVTDHIQQYTQVGGARPFGVALLIGGVENGTPRLYETDPSGTPYEWKAVSIGADRGDHQEHLEENFRDDLTLDEGIELALEAIASTSDEGTAPDGVDVATVSAETERFVELSNDEIESYLEANDLLATEDDEQTEEGPSLAKFVAAWTLKXAA。

[0080] 图12显示，与TOLL-1组、TOLL-1-PADRE组相比，本实施例所构建的TOLL-1融合抗原组(即TOLL/1-12pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:32，即SEFLVDRSKNGLIHVPKDLSQKTTILNISQNYISELWTSDILSLSKLRILIISHNRIQYLDISVFKFNQELEYLDLSHNKLVKISCHPTVNLKHLDLSFNAFDALPICKEFGNMSQLKFLGLSTTHLEKSSVLPIAHLNISKVLLVLGETYGEKEDPEGLQDFNTESLHIVFPTNKEFHFILDVSVKTVANLELSNIKCVLEDNKCSYFLSILAKLQTNPKLSNLTLNNIETTWNSFIRILQLVWHTTVWYFSISNVKLQGQLDFRDFDYSGTSLKALSIHQVVSDVFGFPQSYIYEIFSNMNIKNFTVSGTRMVHMLCPSKISPFLHLDFSNNLLTDTVFENCGHLTELETLILQMNQLKELSKIAEMTTQMKSLQQLDISQNSVSYDEKKGDCSWTKSLLSLNMSSNILTDTIFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSIPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPGCGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELGEFVKNIDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGTLLKDFHMSELSCNITGPSLAKFVAAWTLKAXA。

[0081] 图13显示，与GATA-4组、GATA-4-PADRE组相比，本实施例所构建的GATA-4融合抗原组(即GATA/4-13pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:33，即MYQSLAMAANHGPPPGAYEAGGPGAFMHGAGAASSPVYVPTPRVPSSVLGLSYLQGGGAGSASGGASGGSSGGAASGAGPGTQQGSPGWSQAGADGAAYTPPPVSPRFSFPGTTGSLAAAAAAAAAREAAAYSSGGGAAGAGLAGREQYGRAGFAGSYSSPYPAYMADVGASWAAAAAASAGPFDSPVLHSLPGRANPAARHPNLDMFDDFSEGRECVNCGAMSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGINRPLIKPQRRLSASRRVGLSCANCQTTTTTLWRRNAEGEPVCNACGLYMKLHGVPRPLAMRKEGIQTRKRKPKNLNKSKTPAAPSGSESLPPASGASSNSSNATTSSSEEMRPIKTEPGLSSHYGHSSSVSQTFSVSAMSGHGPSIHPVLSALKLSPQGYASPVSQSPQTSSKQDSWNSLVLADSHGDIITAGPSLAKFVAAWTLKAAX。

[0082] 图14显示，与NY-ESO-1组、NY-ESO-1-PADRE组相比，本实施例所构建的NY-ESO-1融合抗原组(即NY/ESO/1-3、5pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:34，即

[0083] MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRRGPSLAKXVXAWTLKAAA。

[0084] 图15显示，与FR-α组、FR-α-PADRE组相比，本实施例所构建的FR-α融合抗原组(即FRα-3、8pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:35，即[0085] RIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGPSLAKXVAAWXLKAAA。

[0086] 图16显示，与EPCAM组、EPCAM-PADRE组相比，本实施例所构建的EPCAM融合抗原组(即EPCAM-3、11pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:36，即

[0087] QEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKGPSLAKXVAAWTLKXAA。

[0088] 图17显示，与P53组、P53-PADRE组相比，本实施例所构建的P53融合抗原组(即P53-5、8pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:37，即[0089] MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSDGPSLAKFVXAWXLKAAA。

[0090] 图18显示，与MESOTHELIN组、MESOTHELIN-PADRE组相比，本实施例所构建的MESOTHELIN融合抗原组(即Mesothelin-5、11pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:38，即

[0091] LAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGPSLAKFVXAWTLKXAA。

[0092] 图19显示，与WT1组、WT1-PADRE组相比，本实施例所构建的WT1融合抗原组(即WT1-8、11pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:39，即[0093] MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLALGPSLAKFVAAWXLKXAA。

[0094] 图23显示，与B表位SEQ ID NO:43组、B表位SEQ ID NO:43-PADRE组相比，本实施例所构建的表位融合抗原组(即B表位+3pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。

[0095] 该B表位SEQ ID NO:43为FLPESFDGDPASNTAPLQPE。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:47，即

[0096] FLPESFDGDPASNTAPLQPEGPSLAKFXAAWTLKAAA。

[0097] 图24显示，与Aβ蛋白-42组、Aβ蛋白-PADRE组相比，本实施例所构建的Aβ蛋白-42融合抗原组(即A-beta protein-6pPhe-PADRE)产生的抗体滴度显著上升。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:48，即

[0098] LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAGPSLAKFVAXWTLKAAA。

[0099] 采用CTL效应检测的试验例如下表所示：

[0100] 试验序号 辅助性表位肽 现有抗原或抗原表位 融合抗原序列 CTL效应检测结果图21 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:44 图20
22 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:45 图21
23 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:46 图22

[0101] 各图所表示的结果如下：

[0102] 图20显示，与表位SEQ ID NO:40组、表位SEQ ID NO:40-PADRE组相比，本实施例所构建的表位融合抗原组(即表位1+1p-PADRE)所诱导产生的CTL效应明显增强。

[0103] 该表位SEQ ID NO:40为VLDNGDPL。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:44，即VLDNGDPLGPSLXKFVAAWTLKAAA。

[0104] 图21显示，与表位SEQ ID NO:41组、表位SEQ ID NO:41-PADRE组相比，本实施例所构建的表位融合抗原组(即表位2+2p-PADRE)所诱导产生的CTL效应明显增强。

[0105] 该表位SEQ ID NO:41为TGYLYISA。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:45，即TGYLYISAGPSLAXFVAAWTLKAAA。

[0106] 图22显示，与表位SEQ ID NO:42组、表位SEQ ID NO:42-PADRE组相比，本实施例所构建的表位融合抗原组(即表位3+3p-PADRE)所诱导产生的CTL效应明显增强。

[0107] 该表位SEQ ID NO:42为VLDNGDPLGPSLTGYLYISA。该融合抗原的序列为SEQ ID NO:46，即

[0108] VLDNGDPLGPSLTGYLYISAGPSLAKXVAAWTLKAAA。

[0109] 此外，本实施例实际上还验证了实施例1中其余辅助性表位肽与现有抗原或抗原表位连接所得融合抗原的诱导产生抗体或诱导产生CTL效应的能力，受篇幅所限，具体试验结果不在此处一一列出。结果表明，实施例1的所有辅助性表位肽均具有优异的辅助已有抗原或抗原表位产生抗体或产生CTL效应的能力。

[0110] 除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。