一种基于反馈控制的微藻氮营养胁迫培养过程的调节方法

摘要

本发明提供了一种基于反馈控制的微藻氮营养胁迫培养过程的调节方法。本发明定义了用来定量微藻细胞所受氮胁迫程度的氮胁迫指数(Nitrogen Stress Index，NSI)，为微藻培养过程中精确控制氮胁迫成度提供控制指标，并通过建立基于叶绿素荧光参数的氮胁迫程度的原位在线表征方法，实现了基于叶绿素荧光参数指导的反馈控制微藻细胞氮胁迫程度，保证微藻细胞受到适当胁迫。

权利要求

1.一种基于反馈控制的微藻氮营养胁迫培养过程的调节方法，其特征在于：是在微藻培养过程中，通过使用微藻光合叶绿素荧光参数作为氮胁迫程度的在线表征参数，实时监测细胞所受氮营养胁迫程度，反馈指导培养体系内氮营养元素的加入，实现培养过程微藻细胞所受氮胁迫的精确控制；

所述调节方法，具体来说，

（1）所述氮胁迫指在微藻细胞正常生长的培养环境中，控制培养体系中不含氮营养元素时，微藻细胞在生长过程中所受到的胁迫；

（2）基于上述所定义的氮胁迫指数（Nitrogen Stress Index，NSI）表征细胞所受营养胁迫程度，NSI按式NSIi= (Nmax‑ Ni)/(Nmax‑ Nmin)计算；其中Nmax指在微藻细胞正常生长的培养环境中营养充足条件下胞内最大氮质量含量，Nmin指氮胁迫条件下细胞维持存活时最低的胞内氮质量含量，Ni指氮胁迫培养条件下某一时刻的胞内氮质量含量；

（3）建立微藻光合叶绿素荧光参数与NSI的对应关系曲线或函数；具体而言，在培养体系中氮营养元素为0 mg/L时刻起到细胞达到稳定期阶段，等时间间隔取样测定不少于3个培养时刻细胞的胞内氮含量计算NSI值以及相应时刻的微藻光合叶绿素荧光参数，通过相关性分析建立微藻光合叶绿素荧光参数与NSI的对应关系曲线或函数；

（4）在培养过程中，当出现氮胁迫后，即培养体系中氮营养元素为0 mg/L后，监测微藻光合叶绿素荧光参数变化，利用（2）所建立关联曲线或函数计算当时NSI，当与设定NSI处于同一水平时，向培养体系内补加氮营养元素直至微藻光合叶绿素荧光参数再次达到设定值；

此过程中，单位体积或质量培养体系氮营养元素的补加量根据单位培养体系需要获得的细胞干重增加量A与设定NSI水平所对应的胞内氮含量B确定，即为A*B。

2.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：步骤（1）所述微藻细胞正常生长的培养环境包括满足微藻细胞正常生长和增殖过程的温度、光强、pH以及培养体系营养元素；

营养元素包括氮、磷、硫、铁、铜、钼、锌、硅、锰、钴以及微生物、生物素；

培养过程中24h连续光照，或以一定的光暗循环进行光照，光暗循环比的范围8h:16h~

16h:8h；光暗指光照和黑暗；

氮胁迫指在上述培养体系中仅仅不含氮营养元素时，微藻细胞在生长过程中所受到的胁迫。

3.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：步骤（3）在整个培养过程中，培养体系中除氮营养之外其他各营养元素包括磷、硫、铁、铜、钼、锌、硅、锰、钴以及微生物、生物素；

若以光暗循环模式进行光照，则取样时间应选在光照至少1h后。

4.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：步骤（4）单位体积或质量培养体系氮营养元素的补加量根据单位培养体系需要获得的细胞干重增加量A与设定NSI水平所对应的胞内氮含量B确定，即为A*B；如培养需要获得的细胞干重增加量1.0 g/L，设定NSI对应的胞内氮含量为4.0 %wt，则需要补加的氮含量为(1.0×4.0 %) g/L，即为40 mg/L；

需要注意的是，需要获得的细胞干重增加量应符合微藻培养实际情况，不高于培养体系中微藻细胞达到稳定期时所能获得的最大细胞干重。

5.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：其中N含量测定可使用元素分析仪或凯式定氮法测定，但不限定于上述方法；

所述的微藻光合叶绿素荧光参数包括用于表征微藻光合系统II的最大光量子产率Fv/Fm或用于表征微藻光合系统II的实际光量子产率ΔF/Fm’ 叶绿素荧光参数，其中叶绿素荧光参数用Water‑PAM叶绿素荧光仪（Walz, Germany）进行测定，但不限定于使用上述仪器。

6.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：所述培养体系的培养基内氮营养物质的加入方式包括以连续加入或分批间歇加入；

此外，培养体系的培养基内除氮之外其他营养元素的加入需要控制的包括营养元素的加入量与营养元素的加入时间，确保培养过程中除氮营养之外其他各营养元素充足均可满足微藻细胞生长所需。

7.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：所述的微藻细胞所受氮胁迫的精确控制指通过叶绿素荧光参数的实时监控反馈调节氮的补加使细胞达到设定的NSI，即达到设定的氮胁迫程度。

说明书

一种基于反馈控制的微藻氮营养胁迫培养过程的调节方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于反馈控制的微藻适度营养胁迫调节技术，具体地说是使用微藻叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)实时表征微藻细胞受到的氮胁迫程度，反馈指导培养
过程中营养元素的加入，从而控制微藻处于适当胁迫状态。

背景技术

[0002] 微藻因其具有光合效率高、不与农业竞争土地等优势，在国内外可再生生物质能源战略性研究中受到了高度重视。微藻在营养充足的条件下，其细胞固定的CO2以及吸收的
营养物质主要用来细胞本身生长繁殖。当细胞受到胁迫时(如营养胁迫、环境胁迫等)，微藻
通过光合作用所固定的能量及CO2流向发生转变，其中，氮胁迫是目前微藻培养最常用的胁
迫手段。对于产油微藻而言，在氮胁迫条件下，微藻细胞无法进行正常生长和分裂，而细胞
内多余的还原力就用于油脂的合成。因此细胞生长和油脂积累是相矛盾的，微藻培养过程
中油脂产率最高阶段是一种非稳态过程。因此需要在培养过程中控制细胞所受的胁迫程
度，使其处于适当范围。在此胁迫范围内，既能保证细胞的光合效率维持在一定水平用以细
胞生长，又能刺激细胞积累足够的油脂，从而维持细胞处于油脂产率最高阶段。由于微藻受
营养胁迫(如氮元素胁迫)所带来的细胞全局变化极其复杂，油脂积累机制尚不清晰，因此
建立以油脂积累机制理论为指导的产油微藻高效培养工艺思路可行性低，目前产油微藻的
连续高效可控培养技术一直尚未得到突破，限制了微藻产业的发展，成为微藻研究的热点
与难点之一。

[0003] 目前，控制氮的补加是最常用的控制细胞胁迫程度的方法(AREMU A O et al.Journal of Phycology,2015,51(4):659‑669)；另外，也有研究使用细胞N/C值来实现
胁迫程度的控制(BONNEFOND H et al.Biotechnology for Biofuels,2017,10(1):25)。然
而由于技术限制，尚不能够实现培养过程中胞内氮含量的实时在线监测，从而限制了培养
过程中细胞氮胁迫程度的精确控制。王强等发明的专利CN10437475813利用Fv/Fm与产油微
藻氮胁迫下含油量的关系指导培养收获时间。然而该技术并不能实现控制培养过程中微藻
细胞的氮胁迫程度，指导培养过程中氮营养元素的补加，限制了其在不同培养模式中的应
用，特别是批次补料、半连续或连续培养模式。因此，若能使用新的可在线表征细胞氮胁迫
程度参数，实现反馈控制细胞维持适度营养胁迫，将对氮限制微藻培养具有重要意义，特别
是有助于实现户外大规模培养的稳定控制。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种基于反馈控制的微藻适度氮胁迫调节技术，为了提升微藻培养的可控性，解决目前微藻氮胁迫培养过程中胁迫程度不可在线监测无法实现微藻胁
迫程度精确控制的问题。

[0005] 一种基于反馈控制的微藻氮营养胁迫培养过程的调节方法，是在微藻培养过程中，通过使用微藻光合叶绿素荧光参数作为氮胁迫程度的在线表征参数，实时监测细胞所
受氮营养胁迫程度，反馈指导培养体系内氮营养元素的加入，实现培养过程微藻细胞所受
氮胁迫的精确控制。

[0006] 具体来说，

[0007] (1)所述氮胁迫指在微藻细胞正常生长的培养环境中，控制培养体系中不含氮营养元素时，微藻细胞在生长过程中所受到的胁迫；

[0008] (2)基于上述所定义的的氮胁迫指数(Nitrogen Stress Index，NSI)表征细胞所受营养胁迫程度，NSI按式NSIi＝(Nmax‑Ni)/(Nmax‑Nmin)计算；其中Nmax指在微藻细胞正常生长
的培养环境中营养充足条件下胞内最大氮质量含量，Nmin指氮胁迫条件下细胞维持存活时
最低的胞内氮质量含量，Ni指氮胁迫培养条件下某一时刻的胞内氮质量含量；

[0009] (3)建立微藻光合叶绿素荧光参数与NSI的对应关系曲线或函数；具体而言，在培养体系中氮营养元素为0mg/L时刻起到细胞达到稳定期阶段，等时间间隔取样测定不少于3
个培养时刻细胞的胞内氮含量计算NSI值以及相应时刻的微藻光合叶绿素荧光参数，通过
相关性分析建立微藻光合叶绿素荧光参数与NSI的对应关系曲线或函数；

[0010] (4)在培养过程中，当出现氮胁迫后，即培养体系中氮营养元素为0mg/L后，监测微藻光合叶绿素荧光参数变化，利用(2)所建立关联曲线或函数计算当时NSI，当与设定NSI处
于同一水平时(偏差范围在NSI±0.3之内)，向培养体系内补加氮营养元素直至微藻光合叶
绿素荧光参数再次达到设定值；

[0011] 此过程中，单位(体积或质量)培养体系氮营养元素的补加量根据单位培养体系需要获得的细胞干重增加量A与设定NSI水平所对应的胞内氮含量B确定，即为A*B。

[0012] 步骤(1)所述微藻细胞正常生长的培养环境包括满足微藻细胞正常生长和增殖过程的温度、光强、pH以及培养体系营养元素；

[0013] 营养元素包括氮、磷、硫、铁、铜、钼、锌、硅、锰、钴以及微生物、生物素可满足微藻细胞正常生长；

[0014] 培养过程中可以24h连续光照，或也可以以一定的光暗循环进行光照，光暗循环比的范围8h:16h～16h:8h(光照：黑暗)；

[0015] 氮胁迫指在上述培养体系中仅仅不含氮营养元素时，微藻细胞在生长过程中所受到的胁迫。

[0016] 步骤(3)在整个培养过程中，培养体系中除氮营养之外其他各营养元素包括磷、硫、铁、铜、钼、锌、硅、锰、钴等以及微生物、生物素等均可满足微藻细胞生长所需；

[0017] 若以光暗循环模式进行光照，则取样时间应选在光照至少1h后。

[0018] 步骤(4)单位(体积或质量)培养体系氮营养元素的补加量根据单位培养体系需要获得的细胞干重增加量A与设定NSI水平所对应的胞内氮含量B确定，即为A*B；如培养需要
获得的细胞干重增加量1.0g/L，设定NSI对应的胞内氮含量为4.0％wt，则需要补加的氮含
量为(1.0×4.0％)g/L，即为40mg/L；

[0019] 需要注意的是，需要获得的细胞干重增加量应符合微藻培养实际情况，不高于培养体系中微藻细胞达到稳定期时所能获得的最大细胞干重。

[0020] 其中N含量测定可使用元素分析仪或凯式定氮法测定，但不限定于上述方法；

[0021] 所述的微藻光合叶绿素荧光参数包括用于表征微藻光合系统II的最大光量子产率Fv/Fm或用于表征微藻光合系统II的实际光量子产率ΔF/Fm’等叶绿素荧光参数。其中叶
绿素荧光参数可以用Water‑PAM叶绿素荧光仪(Walz,Germany)进行测定，但不限定于使用
上述仪器。

[0022] 所述培养体系的培养基内氮营养物质的加入方式包括以连续加入或分批间歇加入；

[0023] 此外，培养体系的培养基内除氮之外其他营养元素的加入需要控制的包括营养元素的加入量与营养元素的加入时间，确保培养过程中除氮营养之外其他各营养元素充足均
可满足微藻细胞生长所需。8.根据权利要求1所述调节方法，其特征在于：所述的微藻细胞
所受氮胁迫的精确控制指通过叶绿素荧光参数的实时监控反馈调节氮的补加使细胞达到
设定的NSI，即达到设定的氮胁迫程度。

[0024] 本发明为精确量化细胞的氮胁迫程度，首先定义了细胞的氮胁迫指数(Nitrogen stress index，NSI)。NSI按式NSIi＝(Nmax‑Ni)/(Nmax‑Nmin)计算。其中Nmax指在营养充足条件
下胞内最大氮含量，Nmin指氮胁迫条件下细胞维持存活时最低的胞内氮含量，Ni指氮胁迫条
件下某一时刻的胞内氮含量。因此，NSI的变化范围为0～1，其值越大表明细胞所受胁迫程
度越强。以微拟球藻为例，正常培养状态下其胞内最大氮含量为8.10％wt，氮胁迫下维持存
活的胞内最低氮含量为2.10％wt，当胞内氮含量为为3.76％wt时，其NSI为0.72。

[0025] 基于上述定义的NSI，在氮胁迫培养过程中，分析建立NSI与微藻叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)的相关性，利用微藻叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)实时表征微藻细胞
受到的氮胁迫程度。利用可在线原位监测的微藻叶绿素荧光参数代替不可实时在线测定的
胞内氮含量间接表征细胞氮胁迫程度。最后利用上述建立的NSI与微藻叶绿素荧光参数
(Fv/Fm或ΔF/Fm’)对应关系，使用微藻叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)作为氮胁迫培养过
程中的氮胁迫程度表征参数，反馈指导培养过程中营养元素的加入，实现微藻适度营养胁
迫调节。具体而言，当设定需要控制的NSI水平后，即确定了相应的微藻叶绿素荧光参数
(Fv/Fm或ΔF/Fm’)监测点。当细胞叶绿素荧光达到监测点后，根据不同的培养方式和要求向
培养体系在补加氮营养元素。补氮后，微藻叶绿素荧光(Fv/Fm或ΔF/Fm’)回升，根据预先设
定的氮回补的叶绿素荧光(Fv/Fm或ΔF/Fm’)上限，实时监测微藻叶绿素荧光(Fv/Fm或ΔF/
Fm’)的变化，通过控制氮的补加，使其达到预设的回升范围，从而实现NSI的不断重复控制。
具体流程示意图如图1。

[0026] 本发明建立的基于反馈控制的微藻适度营养胁迫调节技术，使用可在线原位监测的微藻叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)作为氮胁迫程度的实时表征参数，解决了胞内氮
含量不能实时测量用来评估氮胁迫程度的限制。为微藻可控氮胁迫培养提供了新的控制策
略。

附图说明

[0027] 本发明附图5幅，其中：

[0028] 图1氮胁迫培养下，利用微藻叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)作为氮胁迫程度实时表征参数反馈指导氮营养元素补加流程示意图。

[0029] 图2柱状光生物反应器微藻培养系统。

[0030] 图3限氮培养模式下微拟球藻ΔF/Fm'和胞内氮含量变化。

[0031] 图4实施例1培养条件下，控制NSI为0.81时微拟球藻ΔF/Fm'和胞内氮含量变化。

[0032] 图5实施例2培养条件下，半连续培养模式控制NSI为0.73时微拟球藻ΔF/Fm'和胞内氮含量变化。

具体实施方式

[0033] 本发明首先提供一种基于反馈控制的微藻适度营养胁迫调节技术，即在氮限制微藻培养过程中通过反馈控制手段调节微藻细胞所受的胁迫程度，实现适度营养胁迫。

[0034] 首先营养充足条件下进行微藻培养，待微藻生长至稳定期后，收集微藻，使用元素分析仪测定微藻干粉的胞内氮含量，即Nmax。其中测定胞内氮含量的方法不限定于使用元素
分析仪，其他可测定胞内氮含量的方法如凯试定氮法等均适用。

[0035] 在氮限制培养过程中，定时取样测定活细胞叶绿素荧光参数(Fv/Fm或ΔF/Fm’)，直至细胞死亡，确定此时胞内氮含量Nmin。考察叶绿素荧光参数与胞内氮含量的回归关系，择
优选择Fv/Fm或ΔF/Fm’作为氮胁迫程度的表征参数，即选择相关性高的一项。其中叶绿素荧
光参数可以用Water‑PAM叶绿素荧光仪(Walz,Germany)进行测定，测定方法可参照YAO等使
用的方法(YAO C et al.Bioresource Technology,2016,212:26‑34.)。需要指出，微藻叶
绿素荧光参数的测定不限定于使用上述仪器和方法，其他可测定微藻叶绿素荧光参数的仪
器和方法均适用。

[0036] 随后，在氮限制培养条件下，确定营养胁迫的程度，通过上述建立的叶绿素荧光参数与胞内氮含量的关系确定基于叶绿素荧光参数反馈控制的控制范围，指导培养过程中营
养元素氮的补加。

[0037] 下面通过具体实施例对本发明方法和结果进行说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本
领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要
求书所限定的范围。

[0038] 实施例1：

[0039] 以500mL柱状玻璃鼓泡反应器(图2)中微拟球藻培养为例，反应条件分别为培养温–2 –1 –1
度25±2℃，光照强度140μmol m s ，空气的CO2通气量为100mL min ，仅在光照时通入CO2，
CO2的通入量为通入空气的2％，光暗比14h:10h，每天光照时间为8:00～20:00。海水培养，
使用改良的F/2营养盐，其母液各营养盐终浓度为(每升)：75.00g NaNO3，5.00g NaH2PO4，
3.15g FeCl3·6H2O，4.36g Na2EDTA，9.80mg CuSO4·5H2O，6.30mg Na2MoO4·2H2O，22.00mg 
ZnSO4·7H2O，10.00mg CoCl2·6H2O，0.18g MnCl2·4H2O，1.00mg维生素B12，0.20g维生素
B1，1.10mg生物素。体系中氮营养浓度以氮元素终浓度表示。

[0040] 本实施例中进行4种培养条件的微藻细胞培养。4种培养过程中体系中除氮营养之外其他各营养元素包括磷、硫、铁、铜、钼、锌、硅、锰、钴等以及微生物、生物素等均可满足微
藻细胞生长所需；光强、温度和通气量维持不变。每种培养条件下初始接种时，培养体系内
细胞干重均为0.18g/L。

[0041] 培养条件1，培养过程中营养充足，能满足微藻细胞正常生长，培养至稳定期，利用元素分析仪测定其胞内最大氮含量Nmax为8.10％wt。具体的营养元素补加如下：接种时向培
养基中加入F/2母液，每升培养体系加入5mL F/2营养盐母液，此时体系内氮元素水平在
‑1
63mg L (可表示为5×F/2水平)；培养过程中监测体系内氮浓度，培养至第3天时，体系内氮
‑1
被消耗至10mg L 时(即1×F/2水平)，此时向培养基中补加4mL F/2营养盐母液至氮元素浓
‑1
度达60mg L (再次达到约5×F/2水平)，培养至第6天时，再次补加4mL F/2营养盐母液，继
续培养至10天，收获微藻测定胞内氮含量。

[0042] 培养条件2，在氮胁迫培养条件下，初始接种时体系内不添加氮营养元素，其他营养元素的加入同培养条件1，培养10天后，收获微藻测定胞内氮含量，确定维持细胞存活的
胞内最低氮含量Nmin为2.10％wt。

[0043] 培养条件3，在氮限制培养条件下培养，初始接种时向体系内单独加入F/2营养盐母液中NaNO3，使体系中氮浓度为24.0mg/L，除氮外其他营养元素的加入同培养条件1，培养
过程中不再补氮营养元素。每天下午15:00取样，测定叶绿素荧光参数ΔF/Fm’以及胞内氮
‑1
含量，具体变化如图3所示。培养至3天，体系内氮浓度为0mg L ，细胞处于氮胁迫状态。氮胁
2
迫下，ΔF/Fm’与NSI具有高度相关性，回归曲线为y＝‑1.4945x+1.5228，R＝0.9713(y为
NSI，x为ΔF/Fm’)。通过相关性分析确定使用ΔF/Fm’作为氮胁迫程度的在线表征参数。

[0044] 培养条件4用以实现NSI的控制。当将NSI控制在0.81时(胞内氮含量为3.23％wt)，此时细胞的ΔF/Fm’值0.470即为当前氮胁迫程度的在线表征参数值。具体而言，在培养3条
件下进行微藻培养，培养5天后，细胞ΔF/Fm’为0.460达到，此时微藻细胞NSI为0.81，达到
控制NSI控制点。随后向培养体系中补加氮至体系氮浓度为24.5mg/L(当培养需要获得的细
胞干重增加量为0.75g/L，胞内氮含量为3.23％wt时，需要补加至体系内氮浓度为24mg/L)，
其余营养元素补充至5×F/2水平，此时重新记为0天，培养过程中不再补充营养元素。培养
过程监测ΔF/Fm’，胞内氮含量和ΔF/Fm’变化如图4。从图中可见，当补氮后再培养5天，ΔF/
Fm’达到0.477，此时胞内氮含量为3.27％wt，NSI为0.81，即实现了氮胁迫程度的稳定控制。

[0045] 实施例2：

[0046] 本实施例中进行4种培养条件的微藻细胞培养，除培养条件4外，其余3种培养同实施例1。培养条件4采用半连续培养，即当细胞胁迫程度达到设定值时，按设定的稀释率进行
稀释，补加营养盐(具体补加方式同实施例1中培养条件4)，开始新的循环。其中，稀释率是
指在半连续培养过程中，重新稀释时补加的新鲜培养基体积占总培养体积的比例。具体而
言，本实施例培养条件4中，NSI控制在0.73胞内氮含量为3.73％wt，此时当前氮胁迫程度的
在线表征参数ΔF/Fm’值为0.503。图5为基于ΔF/Fm’反馈控制细胞氮胁迫程度的半连续培
养结果，操作稀释率为0.6。从图中可见，培养4天后，ΔF/Fm’达到0.503，此时胞内氮含量为
3.73％wt，NSI为0.73，此时按0.6稀释率重新稀释培养体系并补加氮营养元素使体系内氮
含量维持在24.0mg/L左右，继续培养，培养8天后，ΔF/Fm’达到0.504，按上述步骤重新稀释
再培养；培养12天时，ΔF/Fm’达0.514时，可继续按上述步骤补加营养元素再培养。本实施
例培养条件4仅培养12天。从图5可见，本实施例中，通过监测氮胁迫程度的在线表征参数Δ
F/Fm’；培养4天、8天和12天时，胞内氮含量分别为3.73％wt、3.56％wt和3.67％wt，对应NSI
分别为0.73、0.75和0.74，实现了NSI的重复稳定控制。此结果表明细胞氮胁迫程度可以通
过使用ΔF/Fm’作为细胞氮胁迫程度表征参数实现细胞氮胁迫程度的反馈控制。