一种抗肿瘤新化合物、及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了化合物I及其药学上可用的盐在制备肿瘤抑制药物中的新用途。

权利要求

1.式Ⅰ化合物及其在药学上可用的盐在制备胶质母细胞瘤抑制剂中的用途

说明书

一种抗肿瘤新化合物、及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明公开了一种从中药一口钟中分离得到的化合物及其药学上可用的盐在制备中枢神经系统肿瘤抑制剂方面的用途，特别是作为脑肿瘤抑制剂、脊髓肿瘤抑制剂、胶质瘤抑制剂方面的用途。

背景技术

[0002] 下面关于与本发明相关的背景介绍用于帮助对本发明的理解，但不应被认为是本发明的已有技术。所有引用的出版物都被全文参考。

[0003] 中枢神经系统肿瘤是神经系统疾病中一类具有特殊临床意义的病种，致残、致死率很高，是除脑血管病及颅脑损伤外最常见的中枢神经系统疾患。根据国内流行病学资料统计，颅脑肿瘤的每年发病率约为(7～9)/10万人，而脊髓肿瘤的年发病率在(0.9～2.5)/10万。最常见的颅内良性肿瘤是脑膜瘤；星形细胞瘤包括胶质母细胞瘤是最常见的颅内恶性肿瘤。颅脑恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的1.5％～2.0％，并可导致大量患者死亡。即使是良性肿瘤，如果不能全切或者放化疗，在封闭的颅腔内，随着肿瘤的渐进性生长可导致患者死亡。

[0004] 胶质瘤(glioma)是人类最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，约占原发性脑肿瘤的70％。胶质母细胞瘤(glioblastoma)是最常见的恶性胶质瘤(malignant gliomas)，其主要发生于中老年，中位发病年龄约64岁。由于胶质瘤生长部位的特殊，易发生浸润性生长，手术

[0005] 难以完全切除，化疗和放疗效果也不佳，故复发率高、致残率高、死亡率高，严重影响人类的健康。尽管近年来手术切除范围及放化疗方案不断优化，但患者预后仍无明显改善，中位生存期(median survival)仍不到2年，5年生存率仅5％。

[0006] 化疗作为手术切除胶质瘤之后诸多治疗环节中至关重要的一环，其成败对病人的生活质量和预后影响重大，目前却尚无行之有效的药物用于临床治疗胶质瘤，这主要是由于血脑屏障穿透能力和不良反应多等制约而引起的。面对这一现状，临床上迫切需要新型的抗癌药物治疗胶质瘤。

[0007] 一口钟为桃金娘科桉属植物蓝桉(Eucalyptus globμlus Labill.)的果实，是我国南方传统民间中草药，果子成熟模型象“钟”故称为“一口钟”。其性平,味微苦,具有祛风利湿、降脂降压通络舒筋、等多种功效。用于预防流行性感冒、流行性脑脊髓膜炎,治疗上呼吸道感染、咽喉炎、支气管炎、肺炎,外用治烧烫伤、蜂窝组织炎等。一口钟富含多种化学成分，其中包括挥发性成分单萜、倍半萜等，还有非挥发性成分萜-酚加合物类、五环三萜、黄酮类和鞣质类等化合物。国内外许多学者通过现代药理学与毒理学研究阐明一口钟具有多种生物活性，如：抗菌、抗病毒、杀虫、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药理作用。

[0008] 化合物I(eucalyptal A)为从一口钟中分离得到的Euglobal型萜-酚加合物类成分,

[0009]

[0010] 关于化合物研究较少，特别是肿瘤活性方面的研究，也没有对其具有中枢神经系统肿瘤抑制活性的报道。

发明内容

[0011] 本发明旨在针对现有技术的不足，提出了化合物I(eucalyptal A)及其药学上可用的盐，作为中枢神经系统肿瘤抑制药物方面的用途，特别是作为制备脑肿瘤抑制、脊髓肿瘤抑制、胶质瘤抑制药物方面的用途。

[0012] 一种由式I表示的化合物：

[0013]

[0014] 同时，本发明提供了上述化合物或其药学上可用的盐、上述药物组合物在制备肿瘤抑制剂药物中的应用，包括但不限于预防、治疗以及肿瘤辅助用药；

[0015] 重要的，以上肿瘤抑制剂为中枢神经系统肿瘤抑制剂；以上肿瘤抑制剂包括脑肿瘤抑制剂、脊髓肿瘤抑制剂；特别的，以上肿瘤抑制剂为胶质瘤抑制剂。

附图说明

[0016] 图1：化合物I和替莫唑胺对U87MG的MTS细胞增殖检测结果；

[0017] 图2：化合物I和替莫唑胺对LN229的MTS细胞增殖检测结果；

[0018] 图3：各实验组第7、14、21、28天小动物活体成像图；

[0019] 图4：各实验组第7、14、21、28天小动物生物发光检测结果；

[0020] 图5：各组荷瘤裸鼠体重的比较图；

[0021] 图6：各组荷瘤裸鼠生存期的比较；

[0022] 图7：化合物I的1H-NMR in pyridine-d5谱图；

[0023] 图8：化合物I的13C-NMR in pyridine-d5谱图.

具体实施方式

[0024] 本发明中的化合物及制备可以通过下面的实例更好地说明。这些实例不应被解读为本发明的局限，现在已知的或将来开发的这些化合物的变化体也应被认为属于本发明的范畴并申请保护。

[0025] 以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在一下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

[0026] 除有定义外，以下实施例中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

[0027] 样品来源：市售、自制。

[0028] 实施例1化合物I的制备

[0029] 将一口钟药材粉碎，95％乙醇浸渍，每次浸渍3天，一共浸渍5次，将浸渍液合并后减压浓缩，得到乙醇提取物浸膏。乙醇提取物依次经过石油醚萃取3次，减压浓缩，最终得到石油醚层萃取物。

[0030] 取石油醚层萃取物，进行硅胶柱色谱初步分离；再用半制备HPLC进行纯化，得到化合物I，浅黄色固体,m.p.208-209℃。ESI-MS m/z:[M+H]+483。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz)δH:2.15(1H,m,H-2a),2.45(1H,m,H-2b),1.35(1H,m,H-3a),1.96(1H,m,H-3b),4.30(1H,d,J＝12.0Hz,H-5),2.85(1H,dd,J＝11.6Hz,2.7Hz,H-6),3.56(1H,br d,J＝11.9Hz,H-7),2.00(1H,m,H-8a),1.75(1H,m,H-8b),2.94(1H,m,9a),2.38(1H,br d,J＝13.5,H-9b),4.83(1H,s,H-12a),4.92(1H,s,H-12b),1.90(3H,s,H-13),5.05(1H,s,H-14a),5.11(1H,s,H-
14b),1.04(3H,s,H-15),10.32(1H,s,H-7′),10.12(1H,s,H-8′),2.61(1H,dd,J＝7.2Hz,
2.8Hz,H-9′),1.25(1H,m,H-10′a),1.54(1H,m,H-10′b),1.80(1H,m,H-11′),0.99(3H,d,J＝6.6Hz,H-12′),1.12(3H,d,J＝6.5Hz,H-13′)；13C-NMR(pyridine-d5,100MHz)δC:73.1(C-
1),33.3(C-2),30.5(C-3),36.5(C-4),76.2(C-5),46.3(C-6),41.0(C-7),24.7(C-8),33.1(C-9),149.0(C-10),150.6(C-11),108.0(C-12),22.9(C-13),110.2(C-14),19.6(C-15),
191.9(C-7′),195.5(C-8′),38.4(C-9′),43.6(C-10′),29.1(C-11′),23.9(C-12′),22.6(C-13′)。即为本发明化合物I。

[0031] 具体NMR图谱请见说明书附图7、附图8.

[0032] 实施例2药理实验方法及准备

[0033] (一)细胞系：人胶质母细胞瘤细胞系U87MG，LN229购自美国ATCC细胞库。

[0034] (二)细胞复苏：

[0035] 1)从液氮罐中取出冻存细胞，迅速放入事先预热的37℃水浴锅中不断震荡，使其均匀受热在1min内融化，将融化后的冻存液迅速转入装有事先配制好的3ml培养液中，室温下低速离心5min(800r/min)；

[0036] 2)离心后将上层冻存液弃去，只留下底部沉淀物，加入少量培养液，吹打细胞使其均匀分散在培养液中形成细胞悬液，移入25ml培养瓶中并补充培养液至5ml；

[0037] 3)置于37℃，5％CO2孵箱中培养24小时，弃去旧培养液，加入新的培养液，继续培养。

[0038] (三)细胞传代：

[0039] 应用倒置显微镜观察细胞，待细胞生长铺满瓶底达到90％时，对细胞进行传代以保持细胞活力，具体步骤如下：

[0040] 1)倒掉细胞培养液，用PBS冲洗细胞2遍，加入0.25％胰酶-EDTA消化液1ml(25ml培养瓶)后，在37℃培养箱中孵育1～3min，直至在镜下观察细胞形态变圆、间隙变大，向其中加入含有10％FBS的细胞培养液终止细胞消化；

[0041] 2)用弯头滴管吹打细胞，直至细胞全部从壁上被吹打下来并均匀分散在细胞培养液中形成细胞悬液后，转移到离心管中室温下离心5min(800r/min)；

[0042] 3)离心后弃去上清液，加入细胞培养液，吹打离心管底部的细胞沉淀，使细胞再一次均匀分散在培养液中形成细胞悬液后将细胞分瓶，在细胞培养箱中继续培养。

[0043] (四)细胞冻存：

[0044] 1)应用倒置显微镜观察细胞，待细胞生长融合直至铺满瓶底达到90％时；倒掉细胞培养液，用PBS冲洗细胞2遍，加入0.25％胰酶-EDTA消化液1ml，在37℃培养箱中孵育1～3min至镜下观察细胞形态变圆、间隙变大时，向其中加入含有10％FBS的细胞培养液终止消化；

[0045] 2)用弯头滴管吹打细胞至细胞全部从壁上被吹打下来形成细胞悬液后，再转移到15ml离心管中，室温下低速离心5min(800r/min)；

[0046] 3)离心后弃去上清液，加入细胞冻存液(含有5％DMSO的FBS溶液)1.5ml，吹打离心管底部的细胞沉淀，使细胞均匀分散在冻存液中形成细胞悬液后再移入冻存管中，标好名称；

[0047] 4)先将冻存管放入4℃冰箱约40min，接着置于-20℃冰箱中约30～60min，之后再放进-80℃立式超低温保存箱中过夜，最后于液氮罐中长期保存。

[0048] (五)细胞计数：

[0049] 1)用无水酒精清洁计数板和盖玻片，医用无菌棉擦拭干净待用；

[0050] 2)将细胞用0.25％胰酶-EDTA消化液消化后制成细胞悬浮液；

[0051] 3)用微量移液器吸取20μl的细胞悬液，从计数板盖玻片的一侧轻轻加入到计数板上；

[0052] 4)应用倒置显微镜的物镜观察并采用计数器计数板上四个角大方格中的细胞数(细胞若压中线，则记为左上方细胞，成团的细胞只记为一个细胞)。计算公式为：

[0053]

[0054] 实施例3体外抗癌细胞增殖实验(MTS实验)

[0055] 1)培养U87MG和LN229细胞，直至在倒置显微镜下观察细胞生长到对数期时，分别用胰酶消化并制成浓度为1×105cell/ml的细胞悬液。

[0056] 2)将上述两种细胞悬液轻轻混匀，用多道微量移液器按每孔100μl分别加入到96孔板中，每孔细胞数为1×104个。每种细胞接种到三块96孔板中，并设立不加入细胞、培养液和药物的孔，作为实验中的调零组。将96孔板放入细胞培养箱中过夜培养，直至形成单层细胞铺满孔底。

[0057] 3)次日上午，待细胞单层铺满孔底后，分别将细胞培养液、替莫唑胺(10nM)、替莫唑胺(100nM)、替莫唑胺(1μM)、替莫唑胺(50μM)、化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)加入到96孔板中，体积为100μl/孔，分别作为空白组、对照组和实验组，其中每种细胞每个剂量均设5个复孔，之后将平板重新放入细胞培养箱中继续培养。

[0058] 4)对于每种细胞的三个培养板，分别在给药后的24h，48h和72h时取出，弃培养基，每孔加100μl培养基和10μl CellTiter AQueous One Solution Reagent(先配混合体系)，培养箱继续孵育2.5个小时。

[0059] 5)使用酶联免疫检测仪在OD 490nm下测量各孔的吸光度值(Abs)。空白组的吸光度视为100％细胞活力，实验组和对照组的细胞增长抑制率按照空白组的百分比进行计算，具体公式为：

[0060]

[0061] 实施例4动物体内实验

[0062] 实验所用的6周龄BALB/C无胸腺裸鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，体重均在15～18g区间内，严格按每日12h白昼、12h黑夜的周期分笼饲养在中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)的屏障区内，温度为22±2℃，相对湿度为30～70％，每小时至少通风10次，锯末垫料，自由食水和食物。饮水经过滤，污染物和特殊微生物常规检验。整个动物实验的操作过程均符合实验动物饲养和使用指导原则。从给小鼠种植瘤当天开始算起，记为0天。

[0063] (六)裸鼠原位移植瘤模型

[0064] 1)细胞准备：常规培养细胞，计数收集(5×105个cell/只，3μl/只)于PBS，离心后静置于冰上备用。

[0065] 2)建立裸鼠原位移植瘤模型：

[0066] (1)实验器械在使用前进行高温高压灭菌并烘干，紫外照射实验区域及器械30min，造模期间应注意无菌操作；

[0067] (2)小鼠腹腔麻醉：麻醉剂为10％水合氯醛，根据小鼠体重计算麻醉剂的用量【麻醉剂体积(μl)＝小鼠体重(g)×3+10】，麻醉后注意维持小鼠体温；

[0068] (3)观察麻醉成功后，用酒精棉球对手术部位(小鼠顶枕部正中区域)及附近区域进行消毒，切口长度约为1cm，充分暴露前后囟，在前后囟中点向右旁开1mm处用10ml注射器针头钻孔，有突破感即可；

[0069] (4)将小鼠固定于立体定向仪上；

[0070] (5)用微量进样器吸取3μl细胞悬液(吸前应混匀)，并固定在立体定向仪上，调整位置至颅骨开孔处，进针深度为进3mm、退1mm即停止；

[0071] (6)调整注射细胞速度为0.5μl/min，注射完成后停留1min，再缓慢退出进样器，以减少细胞悬液回流；

[0072] (7)取下小鼠，消毒手术伤口，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，注意对合切口；

[0073] (8)注意为小鼠保暖，观察小鼠活动状态、切口情况，4天后拆线。

[0074] 3)小鼠活体成像

[0075] (1)麻醉：方法、剂量计算如上，计时5min后注射发光底物100μl，计时10min后，将小鼠放入机器进行检测；

[0076] (2)造模日记为0天，自造模后一天起，每7天进行一次肿瘤体外成像，实时监测肿瘤的生长曲线。

[0077] 4)小鼠给药

[0078] (1)将实验按肿瘤大小随机分为A、B、C和D四组，每组5只，分别记为小鼠对照组、小鼠替莫唑胺组、小鼠化合物I尾静脉注射组和小鼠化合物I灌胃组。小鼠替莫唑胺组按照40mg/10ml/Kg的给药剂量灌胃(用5％CMC溶解)，每周给5次，直到实验结束；小鼠化合物I尾静脉注射组按照1mg/5ml/Kg的给药剂量注射(用含有1‰DMSO的PBS溶解，微孔滤膜过滤灭菌)，每5天给2次，直到实验结束；小鼠化合物I灌胃组按照10mg/10ml/Kg的给药剂量灌胃(用5％CMC溶解)，每5天给3次，直到实验结束。空白组则按照每周2次静脉注射等体积含有
1‰DMSO的PBS或每周5次灌胃给予5％CMC。

[0079] 自造模算起整个实验持续35天。从0天起，每天记录死亡小鼠的生存时间，在实验结束后计算每天小鼠的存活率，即每天存活小鼠数量占实验开始时小鼠数量的百分率，并按照实验天数对小鼠的存活率作图。从造模成功(第7天)开始，每隔4天对小鼠进行称重，每隔一周对小鼠的肿瘤进行成像，记录肿瘤体积大小。

[0080] (七)统计学方法

[0081] 实验数据中的计量资料以均数±标准差 表示。采用SPSS21.0统计学软件对实验数据进行统计学分析：多组间均数比较采用单因素方差分析(Tukey post-hoc或者Dunn's post-hoc)；生存分析采用log-rank法。统计推断的检验水准为0.05。

[0082] 实施例5化合物I对U87MG的MTS细胞增殖抑制效果

[0083] U87MG为Uppsala 87恶性胶质瘤的缩写，为人类原发性胶质母细胞瘤细胞系，常用于中枢神经系统肿瘤，包括脑肿瘤、脊髓肿瘤、胶质瘤的研究。

[0084] 基于实施例2-4的试验方法及具体实验：

[0085] MTS实验结果中，实验组(给予化合物I)和对照组(给予替莫唑胺)的细胞生长率均为与空白组对照得到的百分比，空白组细胞的吸光度值被视为100％细胞活力。实验中得到的数据均为三组平行样本的平均值，所有实验结果按照 表示。

[0086] 其中，各浓度的化合物I与U87MG细胞共培养24h、48h和72h后的细胞增殖抑制率如图1所示均高于相同浓度的替莫唑胺组，72h时化合物I(50μM)组的抑制率达到98.55％为替莫唑胺组2.5倍。经2-wayANOVA分析，24h的化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)组，48h的化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)组和72h的化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)组与相同作用时间和剂量的替莫唑胺组比较，均高于替莫唑胺组，且具有统计学意义(***P<0.001)。同时，随着化合物I的浓度升高和作用时间的增加，化合物I的抑制率上升，抑制U87MG细胞增殖的能力升高。

[0087] 根据MTS实验结果，化合物I和MTS对U87MG作用24h、48h和72h的IC50列在表1中，其中化合物I对U87MG的IC50分别是5.594μM(24h)、2.635μM(48h)和0.206μM(72h)，分别仅为替莫唑胺组的1/124(24h)、1/169(48h)和1/1803(72h)。

[0088] 说明书附图1记载了化合物I和替莫唑胺对U87MG的MTS细胞增殖检测结果(两组相比；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝5)；

[0089] 表1化合物I和替莫唑胺对U87MG的IC50

[0090]

[0091] 以上结果证明化合物I其抗癌作用相比于临床上使用的替莫唑胺，更强，具有多个数量级差异，可以有效抑制U87MG的增殖，具有制备治疗中枢神经系统肿瘤，如脑肿瘤药物、脊髓肿瘤药物、胶质瘤药物的潜力。

[0092] 实施例6化合物I对LN229的MTS细胞增殖抑制效果

[0093] 基于实施例2-4的试验方法及具体实验：

[0094] MTS实验结果中，实验组(给予化合物I)和对照组(给予替莫唑胺)的细胞生长率均为与空白组对照得到的百分比，空白组细胞的吸光度值被视为100％细胞活力。实验中得到的数据均为三组平行样本的平均值，所有实验结果按照 表示。

[0095] 化合物I与LN229细胞共培养24h、48h和72h后的细胞增殖抑制率如图2所示均高于相同浓度的替莫唑胺组，72h时化合物I(50μM)组的抑制率达到99.29％为替莫唑胺组2.3倍。经2-way ANOVA分析，24h的化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)组，48h的化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)组和72h的化合物I(10nM)、化合物I(100nM)、化合物I(1μM)和化合物I(50μM)组与相同作用时间和剂量的替莫唑胺组比较，均高于替莫唑胺组，且具有统计学意义(***P<0.001)。同时，随着化合物I的浓度升高和作用时间的增加，化合物I的抑制率上升，抑制LN229细胞增殖的能力升高。

[0096] 根据MTS实验结果，化合物I和MTS对LN229作用24h、48h和72h的IC50列在表2中，其中化合物I对LN229的IC50分别是3.698μM(24h)、1.664μM(48h)和0.103μM(72h)，分别仅为替莫唑胺组的1/118(24h)、1/165(48h)和1/1688(72h)。

[0097] 说明书附图2记载了化合物I和替莫唑胺对LN229的MTS细胞增殖检测结果(两组相比；*P<0.05，***P<0.001，n＝5)。

[0098] 表2化合物I和替莫唑胺对LN229的IC50

[0099]

[0100] 以上结果证明化合物I其抗癌作用相比于临床上使用的替莫唑胺更强，呈多个数量级差异，可以有效抑制胶质母细胞瘤细胞系LN229的增殖，具有用于制备治疗胶质瘤药物的潜力。

[0101] 实施例6体内实验——化合物I抑制U87MG荷瘤裸鼠模型

[0102] 基于实施例2-4的试验方法及具体实验：

[0103] (一)活体成像与生物发光检测

[0104] 说明书附图3记载了各实验组第7、14、21、28天小动物活体成像图；说明书附图4记载了各实验组第7、14、21、28天小动物生物发光检测结果；(***：与化合物I尾静脉注射组比较P<0.001；###：与化合物I灌胃比较P<0.001.)

[0105] 肿瘤利用U87MG细胞系建立裸鼠原位移植瘤模型后，从第7天开始(造模成功)给予各组小鼠药物，并在第7、14、21、28d用小动物活体成像系统检测小鼠颅内移植瘤荧光信号。结果显示，移植后7d，各组小鼠颅内移植瘤荧光信号的面积和荧光强度无明显差异，此后各组荧光信号均逐渐增强。从第14d开始，小鼠化合物I尾静脉注射组和小鼠化合物I灌胃组的荧光面积和荧光强度值明显低于小鼠对照组和小鼠替莫唑胺组，差异有统计学意义(P<
0.001，见图3和图4)；小鼠化合物I尾静脉注射组和小鼠化合物I灌胃组的荧光面积和荧光强度值无明显差异，两组差异无统计学意义(见图3和图4)。此后至移植后第28d，各组荧光信号强度之间的差异逐渐增大。上述结果证实，在体内条件下，化合物I尾静脉注射组或灌胃组可明显抑制裸鼠颅内移植性胶质瘤的增长。

[0106] (二)体重实验

[0107] 说明书附图5记载了各组荷瘤裸鼠体重的比较图(**，***：与化合物I尾静脉注射组比较P<0.01，P<0.001；#，##，###：与化合物I灌胃比较P<0.05，P<0.01，P<0.001.)[0108] 自肿瘤移植后8d开始，化合物I灌胃组小鼠的体重明显高于小鼠对照组和小鼠替莫唑胺组，差异有统计学意义(P<0.05～0.01，见图5)；自肿瘤移植后12d开始，化合物I尾静脉注射组小鼠的体重明显高于小鼠对照组和小鼠替莫唑胺组，差异有统计学意义(P<0.01～0.001，见图5)。但是，在16d，化合物I尾静脉注射组小鼠的体重明显高于化合物I灌胃组小鼠的体重，差异有统计学意义(P<0.001，见图5)；除以上一天以外，化合物I尾静脉注射组小鼠的体重与化合物I灌胃组小鼠的体重相比无明显变化，差异没有统计学意义。以上结果提示，对荷瘤小鼠，相比于替莫唑胺，化合物I可以有效改善小鼠的生活质量，维持小鼠的体重。

[0109] (三)生存期

[0110] 如说明书附图6所示，化合物I灌胃组和化合物I尾静脉注射组小鼠的生存期明显长于其余两组，差异有统计学意义(P<0.05)，以上结果提示，对荷瘤小鼠，相比于替莫唑胺，化合物I可以有效延长患癌小鼠的生存时间，提高患癌小鼠的存活率。