结合人Claudin 18.2的抗体及其用途

摘要

本发明提供一种与人Claudin 18.2特异结合的分离的单克隆抗体。还提供编码该抗体的核酸分子，以及用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供包含该抗体的免疫交联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本发明抗体的诊断或治疗方法。

权利要求

1.一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中该重链CDR1区、CDR2区和CDR3区以及轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如(1)SEQ ID NOs：2、4、8、11、13和16；

(2)SEQ ID NOs：2、4、9、10、14和16；

(3)SEQ ID NOs：2、5、9、12、13和16；或

(4)SEQ ID NOs：3、6、8、10、15和16所示，

其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含的序列与轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的序列分别为(1)SEQ ID NOs：18和11、13、16；

(2)SEQ ID NOs：19和10、14、16；(3)SEQ ID NOs：20和12、13、16；(4)SEQ ID NOs：21和10、

15、16；(5)SEQ ID NOs：22和11、13、16；(6)SEQ ID NOs：23和11、13、16；(7)SEQ ID NOs：24和11、13、16；(8)SEQ ID NOs：25和11、13、16；(9)SEQ ID NOs：26和11、13、16；(10)SEQ ID NOs：27和11、13、16；(11)SEQ ID NOs：28和11、13、16；(12)SEQ ID NOs：29和10、14、16；(13)SEQ ID NOs：30和10、14、16；(14)SEQ ID NOs：31和10、14、16；(15)SEQ ID NOs：32和10、14、

16；(16)SEQ ID NOs：33和10、14、16；(17)SEQ ID NOs：34和10、14、16；(18)SEQ ID NOs：35和10、14、16；(19)SEQ ID NOs：36和12、13、16；(20)SEQ ID NOs：37和12、13、16；(21)SEQ ID NOs：38和12、13、16；(22)SEQ ID NOs：39和12、13、16；(23)SEQ ID NOs：40和12、13、16；(24)SEQ ID NOs：41和12、13、16；(25)SEQ ID NOs：42和12、13、16；(26)SEQ ID NOs：43和10、15、

16；(27)SEQ ID NOs：44和10、15、16；(28)SEQ ID NOs：45和10、15、16；(29)SEQ ID NOs：46和10、15、16；(30)SEQ ID NOs：47和10、15、16；(31)SEQ ID NOs：48和10、15、16；或(32)SEQ ID NOs：49和10、15、16所示的序列。

3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的序列以及所述轻链可变区包含的序列分别为(1)SEQ ID NOs：2、4、8和51；(2)SEQ ID NOs：2、4、9和52；(3)SEQ ID NOs：2、5、9和53；(4)SEQ ID NOs：3、6、8和54；

(5)SEQ ID NOs：2、4、8和55；(6)SEQ ID NOs：2、4、8和56；(7)SEQ ID NOs：2、4、8和57；(8)SEQ ID NOs：2、4、9和58；(9)SEQ ID NOs：2、4、9和59；(10)SEQ ID NOs：2、4、9和60；(11)SEQ ID NOs：2、5、9和61；(12)SEQ ID NOs：2、5、9和62；(13)SEQ ID NOs：2、5、9和63；(14)SEQ ID NOs：3、6、8和64；(15)SEQ ID NOs：3、6、8和65或(16)SEQ ID NOs：3、6、8和66所示的序列。

4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：18和51；(2)SEQ ID NOs：19和52；(3)SEQ ID NOs：20和53；(4)SEQ ID NOs：21和54；(5)SEQ ID NOs：22和55；(6)SEQ ID NOs：23和55；(7)SEQ ID NOs：24和55；(8)SEQ ID NOs：25和55；(9)SEQ ID NOs：26和55；(10)SEQ ID NOs：27和55；(11)SEQ ID NOs：27和56；(12)SEQ ID NOs：27和57；(13)SEQ ID NOs：28和56；(14)SEQ ID NOs：28和57；(15)SEQ ID NOs：29和58；(16)SEQ ID NOs：30和58；(17)SEQ ID NOs：

31和58；(18)SEQ ID NOs：32和58；(19)SEQ ID NOs：33和58；(20)SEQ ID NOs：34和58；(21)SEQ ID NOs：34和59；(22)SEQ ID NOs：34和60；(23)SEQ ID NOs：35和58；(24)SEQ ID NOs：

35和59；(25)SEQ ID NOs：35和60；(26)SEQ ID NOs：36和61；(27)SEQ ID NOs：37和61；(28)SEQ ID NOs：38和61；(29)SEQ ID NOs：39和61；(30)SEQ ID NOs：40和61；(31)SEQ ID NOs：

41和61；(32)SEQ ID NOs：41和62；(33)SEQ ID NOs：41和63；(34)SEQ ID NOs：42和61；(35)SEQ ID NOs：42和62；(36)SEQ ID NOs：42和63；(37)SEQ ID NOs：43和64；(38)SEQ ID NOs：

44和64；(39)SEQ ID NOs：45和64；(40)SEQ ID NOs：46和64；(41)SEQ ID NOs：47和64；(42)SEQ ID NOs：48和64；(43)SEQ ID NOs：48和65；(44)SEQ ID NOs：48和66；(45)SEQ ID NOs：

49和65；或(46)SEQ ID NOs：49和66所示的序列。

5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，还包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：67和68所示，或所述重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：89和90所示。

6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人Claudin 

18.2结合；(b)不与Claudin 18.1结合；(c)诱导对表达人Claudin 18.2的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；和(d)诱导对表达人Claudin 18.2的细胞的补体依赖性细胞毒性。

7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为去岩藻糖化的抗体。

9.一种双特异性分子、免疫交联物、嵌合抗原受体、基因改造T细胞受体、或溶瘤病毒，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

10.一种组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的组合物，还包含化疗剂、γδ  T细胞刺激剂、和/或

Claudin18.2表达稳定剂或表达增加剂。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述化疗剂为表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶。

13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述γδ T细胞刺激剂为唑来膦酸。

14.根据权利要求10所述的组合物，还包含选自PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、TIM-

3抗体、STAT3抗体和ROR1抗体的第二抗体。

15.一种核酸，编码权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

16.一种表达载体，包含权利要求15所述的核酸。

17.一种宿主细胞，包含权利要求15所述的核酸。

18.权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求10所述的组合物在制备诊断或治疗癌症疾病的药物中的用途，其中所述癌症疾病选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌。

说明书

结合人Claudin 18.2的抗体及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种与人Claudin 18.2特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在诊断、预防和治疗与表达Claudin 18.2的细胞相关的疾病中的用途，疾病包括肿瘤，例如胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌。

背景技术

[0002] 癌症和抗体疗法

[0003] 癌症是如今我们社会中的头号致命疾病之一。据2014世界癌症报告称，每年约新发生1410万例癌症，这还不包括除黑色素瘤之外的皮肤癌症。癌症每年约有880万例死亡(GBD 2015 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators，(2016)Lancet 388(10053)：1545-1602)。例如，胃癌是发达国家中癌症相关死亡的第四(对于男性而言)和第五大(对于女性而言)成因。

[0004] 很多癌症，特别是处于晚期的那些，很难治愈。胃食管癌的五年存活率仅为20-25％，尽管当前的标准治疗方法具有进攻性，其本身带来严重的副作用。对于胰腺癌而言，病人通常在晚期才被诊断出来，因此预后很差，中位存活时间少于6个月，且5年存活率低于
5.5％。

[0005] 抗体疗法在多地被批准用于治疗多种癌症，且显著改善患者病情(Komeev et al.，(2017)Cytokine 89：127-135)。一旦结合到癌症抗原，抗体可以引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，激活补体系统，或防止受体与其配体发生作用，所有这些均能引起癌细胞死亡。美国FDA批准的抗体药物包括阿仑单抗(Alemtuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、利妥昔单抗(Rituximab)和德瓦鲁单抗(Durvalumab)等。

[0006] Claudin 18.2

[0007] Claudin，由Shorichiro Tsukita等人在1998年首次报道(Furuse et al.，(1998)J Cell Biol 141(7)：1539-1550)，是一类建立细胞旁屏障并控制细胞间分子流动的细胞表面蛋白家族((Singh et al.，(2010)J Oncol 2010：541957)。Claudin是紧密结合的必需成分，在保持上皮细胞极性、控制细胞旁扩散、以及调控细胞生长分化方面起到重要作用。另两个主要的紧密结合家族蛋白是闭合蛋白和连接粘合分子(JAM)。各Claudin分子跨细胞膜四次，N端和C端均落在细胞质中。

[0008] 现今在哺乳动物中已发现24个claudin成员，其中Claudin 13不存在于人类。不同的成员在不同组织中表达，且其改变的功能与癌症形成相关联。Claudin 1、Claudin 18和Claudin 10的表达水平变化分别与肠癌、胃癌和肝细胞癌相关，因此claudin也成为了有前景的治疗靶点(Swisshelm et al.，(2005)Adv Drug Deliv Rev 57(6)：919-928)。

[0009] Claudin 18，又称CLD18，有两种型。Claudin 18.1选择性地在正常肺和胃上皮中表达。Claudin 18.2在正常组织中的表达也高度受限，仅限于胃上皮的分化短寿细胞中，而不存在于胃干细胞区。

[0010] 然而，Claudin 18.2在大比例的原发胃癌及其转移癌中大量存在，并在其恶变中发挥重要作用。例如，在胰腺、食道、卵巢和肺肿瘤中发现有Claudin 18.2的频繁异位激活((Niimi et al.，(2001)Mol Cell Biol 21(21)：7380-7390；Tanaka et al.(2011)J Histochem Cytochem 59(10)：942-952；Micke et al.，(2014)Int J Cancer 135(9)：2206-2214；Shimobaba et al.(2016)Biochim Biophys Acta 1863(6Pt A)：1170-1178；
Singh et al.，(2017)J Hematol Oncol 10(1)：105；Tokumitsu et al.，(2017)
Cytopathology 28(2)：116-121)。

[0011] Claudin 18.2含有暴露的胞外环，可用于单克隆抗体结合，且CLDN18.2抗体已经被用于治疗癌症的研究中。例如，Claudiximab(IMAB362)，一种由Ganymed开发的Claudin 18.2嵌合IgG1抗体，在治疗胃食道癌晚期的I期和II期临床试验中表现出鼓舞人心的效力((Sahin et al.，(2018)Eur J Cancer 100：17-26)。

[0012] 由于大量恶性肿瘤的未被满足的医学需求，对具有更多可取的药学特征的其他Claudin 18.2抗体存在需求。

发明内容

[0013] 本发明提供一种分离的单克隆抗体，例如，与Claudin 18.2(例如，人Claudin 18.2和猴Claudin 18.2)结合的鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体，其与现有技术抗体相比，具有更高的ADCC活性、CDC活性和/或Claudin 18.2结合稳定性。

[0014] 本发明的抗体可以用于多种应用，包括检测Claudin 18.2蛋白，诊断、治疗或预防Claudin 18.2相关癌症。

[0015] 因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与Claudin 18.2结合，含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区所含的氨基酸序列分别包含(1)SEQ ID NOs：1、4和7；(2)SEQ ID NOs：2、4和8；(3)SEQ ID NOs：2、4和9；(4)SEQ ID NOs：2、5和9；或(5)SEQ ID NOs：3、6和8；或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0016] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其所含的氨基酸序列为SEQ ID NOs：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或49，或与其具有至少80％、85％、
90％、95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0017] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区所含的氨基酸序列分别为(1)SEQ ID NOs：10、13和16；(2)SEQ ID NOs：11、13和16；(3)SEQ ID NOs：10、14和16；(4)SEQ ID NOs：12、13和16；或(5)SEQ ID NOs：10、15和16；或与其具有至少80％、85％、
90％、95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0018] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其所含的氨基酸序列为SEQ ID NOs：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0019] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，各包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区所含的氨基酸序列分别为(1)SEQ ID NOs：1、4、7、10、13和16；(2)SEQ ID NOs：2、4、8、11、13和16；(3)SEQ ID NOs：2、4、9、10、14和16；(4)SEQ ID NOs：
2、5、9、12、13和16；(5)SEQ ID NOs：3、6、8、10、15和16；或与其具有至少80％、85％、90％、
95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0020] 在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区所含的氨基酸序列分别为(1)SEQ ID NOs：17和50；(2)SEQ ID NOs：18和51；(3)SEQ ID NOs：19和52；(4)SEQ ID NOs：20和53；(5)SEQ ID NOs：21和54；(6)SEQ ID NOs：22和55；(7)SEQ ID NOs：23和55；(8)SEQ ID NOs：24和55；(9)SEQ ID NOs：25和55；(10)SEQ ID NOs：26和55；(11)SEQ ID NOs：27和55；(12)SEQ ID NOs：27和56；(13)SEQ ID NOs：27和57；(14)SEQ ID NOs：28和56；(15)SEQ ID NOs：28和57；(16)SEQ ID NOs：29和58；(17)SEQ ID NOs：30和58；(18)SEQ ID NOs：31和58；(19)SEQ ID NOs：
32和58；(20)SEQ ID NOs：33和58；(21)SEQ ID NOs：34和58；(22)SEQ ID NOs：34和59；(23)SEQ ID NOs：34和60；(24)SEQ ID NOs：35和58；(25)SEQ ID NOs：35和59；(26)SEQ ID NOs：
35和60；(27)SEQ ID NOs：36和61；(28)SEQ ID NOs：37和61；(29)SEQ ID NOs：38和61；(30)SEQ ID NOs：39和61；(31)SEQ ID NOs：40和61；(32)SEQ ID NOs：41和61；(33)SEQ ID NOs：
41和62；(34)SEQ ID NOs：41和63；(35)SEQ ID NOs：42和61；(36)SEQ ID NOs：42和62；(37)SEQ ID NOs：42和63；(38)SEQ ID NOs：43和64；(39)SEQ ID NOs：44和64；(40)SEQ ID NOs：
45和64；(41)SEQ ID NOs：46和64；(42)SEQ ID NOs：47和64；(43)SEQ ID NOs：48和64；(44)SEQ ID NOs：48和65；(45)SEQ ID NOs：48和66；(46)SEQ ID NOs：49和65；或(47)SEQ ID NOs：49和66；或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0021] 在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，重链恒定区和轻链恒定区所含的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：67和68、或SEQ ID NOs：89和90，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性，其中该抗体或其抗原结合部分与Claudin 18.2结合。

[0022] 本发明的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是例如IgG1、IgG2或IgG4的全长抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab‘2片段。

[0023] 本发明的抗体或其抗原结合部分与人Claudin 18.2结合，并诱导出针对表达Claudin 18.2的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)。其不与人Claudin 18.1结合，与IMAB362相比结合于不同的的人Claudin 18.2表位。本发明的抗体或其抗原结合部分具有体内抗肿瘤效果。

[0024] 本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的免疫交联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素相连接。本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本发明抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本发明的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。

[0025] 本发明还提供组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、或免疫交联物或双特异性分子等，以及药学上可接受的载体。

[0026] 本发明还包括编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本发明还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备Claudin 18.2抗体的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。

[0027] 在一个方面，本发明提供在受试者中诊断癌症疾病的方法，包括从该受试者中收集目标组织样本，并将该组织样本与本发明的抗体或其抗原结合部分接触。如果检测出一定量的Claudin 18.2，则该受试者可被诊断为患有某种癌症疾病。癌症可以是选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌的实体瘤。

[0028] 在另一个方面，本发明提供在受试者中预防、治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。癌症可以是选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌的实体瘤。在一些实施方式中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码或承载抗体的溶瘤病毒。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂，例如表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本发明的抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

[0029] 在一个方面，本发明提供在受试者中治疗或预防癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分、以及γδT细胞刺激剂。γδT细胞刺激剂可以在本发明抗体或其抗原结合部分施用之前或之后施用，或同时施用。γδT细胞可以是Vγ9Vδ2T细胞。在一个实施方式中，γδT细胞刺激剂是双膦酸盐，特别是含氮双膦酸盐，例如N-双膦酸盐和氨基双膦酸盐。在一个实施方式中，γδT细胞刺激剂是唑来膦酸，优选与白介素-2组合使用。

[0030] 在一个实施方式中，本发明的癌症疾病治疗方法还包括施用Claudin 18.2表达稳定或增加剂。Claudin 18.2的表达优选在癌细胞的细胞表面。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以是奥沙利铂、和/或5-FU。

[0031] 基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

附图说明

[0032] 图1示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的结合亲和力。

[0033] 图2示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的MC38细胞的ADCC活性。

[0034] 图3示出Claudin 18.2抗体的ADCC活性，其中图3A示出抗体对EOF预处理的KATOIII细胞的ADCC活性，图3B示出抗体对NUGC4细胞的ADCC活性。

[0035] 图4示出Claudin 18.2抗体的ADCC活性，其中图4A示出抗体对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的ADCC活性，图4B示出抗体对过表达人Claudin 18.1的HEK293A细胞的ADCC活性。

[0036] 图5示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的MC38细胞的CDC活性。

[0037] 图6示出FACS检测中Claudin 18.2抗体对过表达Claudin 18.2的HEK293A细胞的结合稳定性，其中HEK293A细胞在4℃与Claudin 18.2孵育1小时，并在去除未结合抗体后于37℃再孵育0、3或5小时。

[0038] 图7示出FACS检测中人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.2或人Claudin 18.1的HEK293A细胞的结合亲和力，其中图7A示出抗体18F2-30VH0VL0、18F2-
30VH7VL3和18F2-30，图7B示出抗体18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3和18F2-35，图7C示出抗体18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3和18F2-5。

[0039] 图8示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.2的MC38细胞的CDC活性，其中图8A示出抗体18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-30，图8B示出抗体18F2-
35VH0VL0、18F2-35VH7VL3和18F2-35，图8C示出抗体18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3和18F2-
5。

[0040] 图9示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.2或人Claudin 18.1的MC38细胞的ADCC活性，其中图9A示出抗体18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-30，图9B示出抗体18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3和18F2-35，图9C示出抗体18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3和18F2-5。

[0041] 图10示出人源化Claudin 18.2抗体的ADCC活性，其中图10A示出抗体对EOF预处理的MUGC4的ADCC活性，图10B示出抗体对KATOIII细胞的ADCC活性。

[0042] 图11示出人源化Claudin 18.2抗体的ADCC活性，其中图11A示出对过表达人Claudin18.1的HEK293A细胞的ADCC活性，图11B示出对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的ADCC活性。

[0043] 图12示出人源化Claudin 18.2抗体的CDC活性，其中图12A示出对过表达人Claudin 18.1的HEK293A细胞的CDC活性，图12B示出对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的CDC活性。

[0044] 图13示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的结合稳定性，其中HEK293A细胞在4℃与Claudin 18.2孵育1小时，并在去除未结合抗体后于37℃再孵育0、3或5小时。

[0045] 图14示出人Claudin 18.1与人Claudin 18.2的氨基酸序列比对，其中框表示胞外环1区，箭头表示该区域的氨基酸差异。

[0046] 图15示出Claudin 18.2对过表达突变体14的HEK293A的结合亲和力。

[0047] 图16示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.1、突变体15(Claudin 18.1/S42A/Q45N/Q56E)或突变体16(Claudin 18.1/S42A/Q45N E47Q/Q56E)的HEK293A细胞的结合亲和力，其中图16A示出抗体IMAB362，图16B示出抗体18F2-35VH0VL0，图16C示出抗体18F2-30VH7VL3，图16D示出18F2-30VH0VL0。

[0048] 图17示出人源化Claudin 18.2抗体通过PBMC表现出的ADCC活性，其中图17A示出对MC38细胞的ADCC活性，图17B示出对NUGC-4的ADCC活性。

[0049] 图18示出人源化Claudin 18.2抗体通过Vγ9Vδ2T细胞表现出的ADCC活性，其中图18A示出对MC38细胞的ADCC活性，图18B示出对NUGC-4的ADCC活性。

[0050] 图19示出Claudin 18.2抗体的体内抗肿瘤效果，其中图19A示出肿瘤体积，图19B示出肿瘤重量。

[0051] 图20示出Claudin 18.2抗体与化疗剂结合时的体内抗肿瘤效果。

[0052] 图21示出去岩藻糖化Claudin 18.2抗体对EOF预处理过的NUGC4的ADCC活性，其中图21A示出抗体18F2-30VH0VL0AF，图21B示出抗体18F2-35VH7VL3AF。

[0053] 图22示出去岩藻糖化Claudin 18.2抗体对表达人Claudin 18.2的MC38细胞的CDC活性，其中图22A示出抗体18F2-30VH0VL0AF，图22B示出抗体18F2-35VH7VL3AF。

具体实施方式

[0054] 为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

[0055] 术语“Claudin 18.2”是指2型Claudin 18。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人Claudin 18.2特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的Claudin 18.2蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人Claudin 18.2蛋白特异的抗体可以完全地对人Claudin 18.2蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的Claudin 18.2蛋白交叉反应。

[0056] 术语“人Claudin 18.2”是指具有人氨基酸序列的Claudin 18.2蛋白，例如Genbank登录号为NM_001002026的氨基酸序列。

[0057] 本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

[0058] 本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，Claudin 18.2蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

[0059] 本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与Claudin 18.2蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合Claudin 18.2蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人Claudin 18.2蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的Claudin 18.2蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

[0060] 术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

[0061] 术语“鼠源抗体”是指可变区骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。

[0062] 术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。

[0063] 术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。

[0064] 术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

[0065] 在本文中，“特异结合人Claudin 18.2”的抗体是指与人Claudin 18.2(还可能是其他非人物种的Claudin 18.2)结合但是基本不与非Claudin 18.2蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人Claudin 18.2蛋白，即KD值为1.0x10-8M以下，更优选为5.0x 10-9M以下。

[0066] 术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0x 10-6M以上，更优选1.0x 10-5M以上，更优选1.0x 10-4M以上、1.0x 10-3M以上，更优选1.0x 10-2M以上。

[0067] 术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x 10-6M以下，优选-8 -8 -9 -95.0x 10 M以下，更优选1.0x 10 M以下、5.0x 10 M以下，更优选1.0x 10 M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。

[0068] 术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

[0069] 术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体，例如Claudin 18.2抗体，结合的靶细胞例如癌细胞裂解。

[0070] 术语“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”是指IgG和IgM抗体的效应功能，当与表面抗原结合时引发典型的补体途径，包括形成膜攻击复合体以及靶细胞裂解。本发明的抗体，与Claudin 18.2结合时，引发对癌细胞的CDC。

[0071] 术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

[0072] 术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本发明抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。

[0073] 术语“γδT细胞”是指T细胞受体由一条γ链和一条δ链构成的T细胞。人γδT细胞在感染性疾病、自免疫疾病和癌变引起的肿瘤变化的压力监测反应中发挥重要作用。病变位点处的激活的γδT细胞，与抗原结合时，释放细胞因子和/或趋化因子，以募集其他效应细胞并表现出即刻的效应功能例如ADCC。外周血中的很多γδT细胞表达Vγ9Vδ2T细胞受体并从而被称为Vγ9Vδ2T细胞。

[0074] 术语“γδT细胞刺激剂”是指刺激γδT细胞，特别是Vγ9Vδ2T细胞，的体外和体内发生的化合物，特别是通过诱导γδT细胞的活化和扩张。优选地，该术语涉及体外和/或体内(优选通过抑制甲羟戊酸通路酶法呢基焦磷酸合酶(FPPS))增加哺乳动物细胞中生成的异戊烯焦磷酸(IPP)的化合物。

[0075] 本发明的多个方面在以下更加具体地加以描述。

[0076] Claudin 18.2抗体具有对人Claudin 18.2的结合特异性以及其他有益的功能特征

[0077] 本发明的抗体以高亲和力特异性地结合人Claudin 18.2。具体而言，本发明的抗体以与IMAB362相当的EC50值与人Claudin 18.2结合，且具有比IMAB362更高的ADCC活性、CDC活性和Claudin 18.2结合稳定性。本发明的抗体所结合的表位不同于IMAB362，且不与人Claudin 18.1结合。

[0078] 优选的本发明抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。

[0079] Claudin 18.2单克隆抗体

[0080] 优选的本发明抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。Claudin 18.2抗体的VH氨基酸序列为SEQ ID NOs：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或49。Claudin 18.2抗体的VL氨基酸序列为SEQ ID NOs：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66。抗体的重链/轻链可变区序列列于以下表1中，一些抗体具有相同的VH或VL。所有抗体的重链恒定区和轻链恒定区分别列于SEQ ID NOs：67和68，或者分别列于SEQ ID NOs：89和90。

[0081]

[0082]

[0083] 与人Claudin 18.2结合的其他Claudin 18.2抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本发明抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。相似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。

[0084] 因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：

[0085] (a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及

[0086] (b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一Claudin 18.2抗体的VL，其中该抗体特异结合人Claudin 18.2。

[0087] 在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：

[0088] (a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及

[0089] (b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一Claudin 18.2抗体的CDR，其中该抗体特异结合人Claudin 18.2。

[0090] 在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括Claudin 18.2抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人Claudin 18.2的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一Claudin 18.2抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。

[0091] 此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：
739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,
925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献军通过引用的方式全部并入本文。

[0092] 在另一实施方式中，本发明的抗体包含Claudin 18.2抗体的重链可变区的CDR2以及至少Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人Claudin 18.2。优选这些抗体(a)竞争结合Claudin 18.2；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本发明Claudin 18.2抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含Claudin 18.2抗体的轻链可变区CDR2，或者另一Claudin 18.2抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人Claudin 18.2。在另一实施方式中，本发明的抗体可以包括Claudin 18.2抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人Claudin 18.2。

[0093] 保守修饰

[0094] 在另一实施方式中，本发明的抗体包含与本发明Claudin 18.2抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)
J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy  et al.，(1998)
Int.Immunol.10：341-6 and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

[0095] 因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：

[0096] (a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

[0097] (b)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

[0098] (c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

[0099] (d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且

[0100] (e)该抗体特异结合人Claudin 18.2。

[0101] 本发明的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人Claudin 18.2的高亲和力，以及引发对Claudin 18.2表达细胞的ADCC或CDC的能力。

[0102] 在多个实施方式中，抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

[0103] 本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本发明抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。

[0104] 基因修饰的抗体

[0105] 本发明的抗体可以以具备本发明Claudin 18.2抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，骨架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。

[0106] 在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

[0107] 因此，本发明的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本发明单克隆抗体的VH和VLCDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。

[0108] 这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

[0109] 通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。

[0110] 用于本发明抗体的优选骨架序列是结构上与本发明抗体所用的骨架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

[0111] 另一类的可变区修饰是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。

[0112] 此外，在另一实施方式中，本发明提供分离的Claudin 18.2单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。

[0113] 本发明的基因改造抗体包括在VH和/或VL的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。

[0114] 另一类的骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

[0115] 此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本发明的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。

[0116] 在一个实施方式中，CH1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。

[0117] 在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

[0118] 在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

[0119] 此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：
26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

[0120] 本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本发明的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。

[0121] 抗体的物理特性

[0122] 本发明的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。

[0123] 例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选Claudin 18.2抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。

[0124] 在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。

[0125] 各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选Claudin 18.2抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。

[0126] 编码本发明抗体的核酸分子

[0127] 在另一方面，本发明提供编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本发明的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

[0128] 本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。

[0129] 优选的本发明核酸分子包括编码Claudin 18.2单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。

[0130] 编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。

[0131] 编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。

[0132] 为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature 348：552-554)。

[0133] 本发明单克隆抗体的制备

[0134] 本发明的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。

[0135] 制备本发明单克隆抗体的转染瘤的生成

[0136] 本发明的抗体还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。

[0137] 术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。

[0138] 抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而VH与载体中的CH可操作地连接，VL与载体中的CL可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

[0139] 除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

[0140] 对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。

[0141] 优选的用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。

[0142] 免疫交联物

[0143] 本发明的抗体可以与治疗剂交联，形成免疫交联物，例如抗体-药物交联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。

[0144] 在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/
103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。

[0145] 双特异性分子

[0146] 另一方面，本发明涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本发明抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。

[0147] 在实施方式中，除Fc结合特异性和Claudin 18.2结合特异性外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以是针对增强因子(EF)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合并从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，增强因子抗体可以与细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)或其他免疫细胞结合，引起增强的针对靶细胞的免疫应答。

[0148] 双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，cited supra；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-
397(2000)。

[0149] 编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒

[0150] 溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本发明的抗体与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本发明抗体的溶瘤病毒可以引入人体中。

[0151] 药物组合物

[0152] 在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗体、化疗剂、γδT细胞刺激剂、或Claudin 18.2表达稳定或增加剂。本发明的药学组合物可以在与例如另一抗癌剂、另一抗炎剂或疫苗的联合疗法中进行施用。

[0153] 药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。

[0154] 优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本发明的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。

[0155] 药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。

[0156] 与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。

[0157] 给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。

[0158] 对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案涉及每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。本发明Claudin 18.2的优选给药方案包括静脉内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以以下给药时间表中的一个进行给药：(i)每四周给药六次，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后1mg/kg体重每三周一次。在一些方法中，剂量调整成实现约1-1000μg/ml的血药浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

[0159] “治疗有效量”的本发明Claudin 18.2抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加、或对感病性引起的损伤或无能的预防能力。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。

[0160] 药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、透皮贴剂、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

[0161] 药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。

[0162] 在某些实施方式中，本发明的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本发明的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：
9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

[0163] 本发明的用途和方法

[0164] 本发明的抗体(组合物、双特异性分子和免疫交联物)具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症的诊断、治疗和/或预防。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。在癌症的诊断中，可以收集目标组织样本，并与本发明抗体接触，其中，如果在某些区域或细胞类中检测到一定量的Claudin 18.2，则该受试者可以诊断为癌症，且Claudin 18.2表达的增加/减少表示癌症发展/减轻。

[0165] 考虑到本发明Claudin 18.2抗体的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本发明提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本发明的抗体，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本发明抗体治疗的肿瘤的非限制性离子包括但不限于胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌，原发或转移的。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本发明的抗体抑制。

[0166] 本发明的这些和其他方法在以下进一步讨论。

[0167] 联合疗法

[0168] 本发明提供本发明Claudin 18.2抗体或其抗原结合部分与一种或多种其他抗体一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本发明提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用Claudin 18.2抗体以及一种或多种其他抗体，例如LAG-3抗体、PD-1抗体和/或CTLA-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本发明提供癌症治疗方法，其中本发明的Claudin 18.2抗体或其抗原结合部分与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。例如，表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-FU可以施用给接受Claudin 18.2抗体疗法的患者。奥沙利铂、和5-FU被认为能稳定或增加Claudin 18.2的表达。

[0169] 本发明还提供一种抑制受试者中肿瘤生长的方法，包括向受试者施用Claudin 18.2抗体和γδT细胞刺激剂，特别是Vγ9Vδ2T细胞刺激剂。γδT细胞刺激剂可以是双膦酸盐，特别是含氮双膦酸盐，例如N-双膦酸盐和氨基双膦酸盐。数据表明唑来膦酸(ZA)，特别是与白介素-2组合时，能够刺激Vγ9Vδ2T细胞生成，并从而增强Claudin 18.2抗体的ADCC活性(WO2013174509)。

[0170] 本发明还提供抑制受试者中肿瘤生长的方法，包括向受试者施用Claudin 18.2抗体以及Claudin 18.2表达稳定或增加剂。该Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以是细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以包括选自蒽环类药物、铂类化合物、核苷类似物、紫杉烷、喜树碱类似物或其前药、及其组合的药剂。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以包含选自表阿霉素、奥沙利铂、顺铂、和5-FU的药剂。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以包含奥沙利铂与5-FU或其前药的组合，顺铂与5-FU或其前药的组合，至少一种紫杉烷与奥沙利铂的组合，至少一种紫杉烷与5-FU或其前药的组合，至少一种喜树碱类似物与5-FU或其前药的组合。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以是引发免疫细胞死亡的药剂。引发免疫细胞死亡的药剂可以包括选自蒽环类药物、奥沙利铂及其组合的药剂。引发免疫细胞死亡的药剂可以包括表阿霉素与奥沙利铂的组合。在一个实施方式中，本发明的方法包括施用至少一种蒽环类药物、至少一种铂类化合物、和/或至少一种5-FU和其前药中的至少一种。蒽环类药物可以选自表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星和戊柔比星。优选地，蒽环类药物是表阿霉素。铂类化合物选自奥沙利铂和顺铂。核苷类似物可以选自5-FU及其前药。紫杉烷可以选自多西他赛和紫杉醇。喜树碱类似物可以选自伊立替康和托泊替康。在一个实施方式中，本发明的方法包括施用(i)表阿霉素、奥沙利铂和5-FU；(ii)表阿霉素、奥沙利铂和卡培他滨；(iii)表阿霉素、顺铂和5-FU；(iv)表阿霉素、顺铂和卡培他滨；或(v)亚叶酸、奥沙利铂和5-FU。

[0171] 其他可以与Claudin 18.2抗体联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。

[0172] 本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。

[0173] 此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。

[0174] 本发明还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。

[0175] 实施例

[0176] 实施例1稳定表达人Claudin 18.1或Claudin 18.2的HEK193A细胞株的构建

[0177] 合成编码人Claudin 18.1(SEQ ID NO：70)和Claudin 18.2(SEQ ID NO：72)的cDNA序列(SEQ ID NOs：69和71)，通过EcoRI和BamHI双酶切将上述两个基因的编码序列分别克隆到pLV-sfGFP(2A)puro质粒中。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.1或pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.2与psPAX2以及pMD2.G共转染至HEK-293T细胞(Cobioer，China)，生成慢病毒。得到的慢病毒转染至HEK-293A细胞(Cobioer，China)，以生成过表达人Claudin 18.1或Claudin 18.2的稳定细胞株。该细胞株培养在添加有10％FBS(Cat：
FND500，Excell)和0.2μg/ml嘌呤霉素(Cat：A11138-03，Gibco)的DMEM培养基(Cat：
SH30022.01，Gibco)中，培养时间为7天以上。

[0178] Claudin 18.1和Claudin 18.2的表达经荧光激活细胞分类术(FACS)检测。具体而言，100,000个转染细胞在96孔板的各孔中铺板，并在之后加入市售CLDN18抗体(兔抗Claudin-18，Cat#：388100，Life Technology)。4℃孵育1小时后，板用PBST洗涤3遍，再加入PE耦联的驴抗兔IgG二抗(1∶500，PE驴抗兔IgG抗体，Cat#：406421，Biolegend)。4℃孵育1小时后，板用PBS洗涤3遍，之后使用FACS仪器(BD)监测细胞荧光度。

[0179] 实施例2 Claudin 18.2单克隆抗体的生成和筛选

[0180] 用实施例1中稳定表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞免疫6周龄BALB/c小鼠，细胞经皮下注射，每只小鼠注射2×107个细胞。在初次免疫之后，每四周进行一次加强免疫，共三次。血样中的抗体效价通过FACS使用表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞进行确定。当动物达到合适的抗体效价后，用处于PBS中的5×107/mL细胞进行最后一次免疫加强。三天后，处死小鼠，并放血，收集脾脏，供mRNA提取和噬菌体展示库构建用。

[0181] 为构建scFv噬菌体展示库，小鼠的脾脏总RNA用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取，并使用反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。使用上述cDNA为模板，通过PCR进行基因扩增，scFv噬菌体库通过专用噬菌粒pTGS进行构建。简单而言，轻链可变区通过PCR扩增，用Qiagen PCR/纯化试剂盒纯化，用限制性内切酶NheI和NotI(NEB)切割，并于16℃连入噬菌粒pTGS的(用相同限制性内切酶消化并用琼脂糖凝胶纯化的)NheI/NotI限制性位点。在连接后，沉淀、洗涤重组DNA，并将其溶解于蒸馏水。重组DNA之后经电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。之后，细胞混悬在10ml SOC培养基中，37℃轻摇培养1小时。细胞培养物在2YT琼脂/氨苄上铺板，数出氨苄抗性菌落的数量。对于重链可变片段的克隆，将PCR产物用NcoI和XhoI酶切，并连入轻链可变区库，并转化到大肠杆菌TG1中。从大板中刮出库，并接种到2YTAG液体培养基中。将约1012pfu(噬菌斑形成蛋白)的辅助噬菌体加入含有scFv基因库的TG1样本中，并在震摇中于37℃孵育1小时。加入70μg/ml的卡那霉素，且培养物于30℃震摇过夜。细胞于4℃以4000rpm离心15分钟，所得的上清液与5ml 20％PEG 8000/2.5M NaCl混合，并在冰上孵育30分钟。之后噬菌体于4℃以8000rpm离心20分钟进行沉淀。噬菌体混悬于
1.5ml含1％BSA的PBS，于涡旋混合器上震动，并以13000rpm离心5分钟，得到成团的碎片。上清液于4℃保存，或直接用于以下的生物筛选。

[0182] 针对人Claudin 18.2而非Claudin 18.1的抗体使用稳定表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞进行生物筛选。简单而言，首先将1×107HEK293A/人Claudin18.1细胞加入含1013噬菌体的15ml管中。细胞/噬菌体混合物在摇床上室温孵育90分钟，然后静置30分钟。细胞混悬液以1000g室温离心5分钟，上清液转移到含有1×
107HEK293A/人Claudin18.2的管中。细胞培养物在摇床上室温孵育2小时。未结合的噬菌体用PBS洗掉，0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.2)用于洗脱抗原结合的噬菌体。洗脱的噬菌体使用1.5M Tris-HC1(pH 8.8)中和至pH 7.0。上述中和的噬菌体用于侵染10ml的TG1，其于37℃培养直至OD达到0.6。细菌培养物通过离心成团，且团状物重新混悬在培养基中，并包被于2YTAG板，用于下轮筛选。总共进行三轮这样的富集和筛选。

[0183] 三轮生物筛选后，收集与Claudin 18.2结合的噬菌体，并用于侵染细菌。挑取单细胞菌落，并使其在96孔板中生长。使用表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞，以细胞ELISA来识别高结合力的克隆。选出在噬菌体ELISA中显示出对人Claudin 18.2而非Claudin 18.1的高特异性结合力的克隆，用于DNA测序，并从高结合克隆中鉴定出38个可读scFv序列，并从中选出10个scFv抗体用于进一步表征。

[0184] 实施例3全长Claudin 18.2单克隆抗体的表达、纯化和表征

[0185] 将上述10个选出的scFv抗体以全长单克隆抗体的形式表达在HEK293F细胞(Cobioer，China)中，进行进一步表征。简单而言，将各自的重链/轻链可变区分别加上人IgG1/κ恒定区(SEQ ID Nos.：67和68)克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，USA)的EcoRI/BamHI限制性内切酶位点中，构建表达载体。

[0186] 根据生产商的说明，使用PEI转染，在HEK-293F细胞中瞬时表达嵌合人Claudin 18.2抗体。简单而言，使用聚乙烯亚胺(PEI)，用所得的载体转染HEK293F细胞，DNA∶PEI比为
1∶3。用于转染的总DNA为1.5μg/ml。转染的HEK293F细胞在37℃、5％CO2的培养箱中以
120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，用0.22μm胶囊过滤除去细胞残骸，以纯化抗体。之后，抗体使用预平衡的Protein-A(GE；USA；Cat#：17040501；
Lot#：10252250)进行纯化，并用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)洗脱。在缓冲液交换外，抗体保存在PBS缓冲液中(pH 7.0)，其浓度通过NanoDrop仪确定。纯化的单克隆抗体进行进一步表征。

[0187] 使用表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞，通过FACS检测10个全长抗体的结合亲和力和特异性。如图1所示，大部分全长抗体特异地结合人Claudin 18.2而非Claudin 18.1。基于结合亲和力的评分，选择克隆18F2进行进一步检测。

[0188] 实施例4通过噬菌体展示对18F2进行亲和力成熟改造

[0189] 为进一步改善结合亲和力，克隆18F2选择通过噬菌体展示技术进行亲和力成熟改造。简单而言，进行3D结构建模模拟来识别克隆18F2的重链和轻链CDR中可能对结合亲和力重要的残基。识别出的CDR残基通过PCR进行突变，使用针对点突变特别设计的引物和标准方法步骤。构建出噬菌体展示库，并如上所述，使用稳定过表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞，进行生物筛选。在3轮生物筛选后，选出高结合力克隆，收集并侵染细菌细胞。挑取细菌菌落并在96孔板上生长，然后使用细胞ELISA来识别高结合力克隆，并进行测序。识别出重链和轻链CDR中的有益突变，并结合到新的噬菌体展示库中，再进行3轮生物筛选和测序证明。识别出20多种与母克隆18F2相比包含单或多突变且呈现高结合力的克隆，并选出12个在HEK293F细胞中以全长嵌合人IgG/κ抗体表达。全长抗体的结合亲和力通过FACS使用表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞进行检测。简单而言，将
100,000个细胞在96孔板的各孔中铺板，并向板中加入梯度稀释的Claudin 18.2抗体。于4℃孵育1小时后，板用PBST洗涤3遍。之后，加入RPE耦合的山羊抗人IgG二抗(1∶500，Thermo Cat#：PAI-86078)。在4℃孵育1小时后，板用PBS洗涤3遍，之后使用FACS仪(BD)监测细胞荧光。基于结合亲和力和特异性，选出4个克隆进行进一步研究，即18D2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66，这些克隆与母克隆18F2相比呈现更高的结合亲和力。4个所选克隆的EC50值显示在表2中，这些EC50值与IMAB362差不多，其中IMAB362是根据专利申请WO2014/146672 A1中公开的氨基酸序列合成的Claudin 18.2对照抗体。

[0190] 表2.Claudin 18.2抗体的结合亲和力EC50

[0191]

[0192] 实施例5 Claudin 18.2抗体的ADCC活性

[0193] 对纯化的抗体进一步检测其引导对稳定过表达人Claudin 18.2的MC38细胞(Cober，China)(MC38/hClaudin18.2)的抗体依赖细胞毒性(ADCC)活性。简单而言，MC38/hClaudin18.2细胞如实施例1所示般通过慢病毒转染系统而生成。

[0194] MC38/hClaudin18.2细胞和效应细胞NK92MI-CD16a(Huabo Bio)均以1200rpm离心5分钟。这些细胞随后混悬在ADCC检测培养基中(MEM培养基，Gibco，Cat#：12561-056；1％FBS，EX-cell，Cat#：FND500；1％BSA，VETEC，Cat#：V900933-1KG)，根据细胞计数看，细胞活力为约90％。调整MC38/hClaudin18.2的细胞密度为4x105/ml，NK92MI-CD16a的细胞密度调整为2x106/ml，两种细胞各加50μl到96孔板的各孔中(效靶比是5∶1)。将待测抗体分别稀释成不同浓度加入各孔，使抗体终浓度分别为32000ng/ml、6400ng/ml、1280ng/ml、256ng/ml、
51.2ng/ml、10.24ng/ml、2.048ng/ml。样本在37℃孵育4小时，然后以100μl/孔的浓度加入LDH显色液(细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)，Roche，Cat#：04744926001)。混合物避光常温放置20分钟后，板在MD SpectraMax i3上进行读数。HEL同型对照抗体(LifeTein，LLC，Cat.#：LT12031)作为阴性对照，IMAB362作为阳性抗体对照。如图2所示，所选的嵌合抗体
18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66都能显著诱导NK92MI-CD16a对MC38/hClaudin18.2细胞的杀伤。

[0195] 还对Claudin 18.2抗体测试其针对KATO-III细胞(Cobioer，China)和NUGC-4细胞(Cobioer，China)的ADCC活性，这两种细胞内源性地高表达人Claudin18.2。首先，靶细胞预先用EOF组合(10ng/ml表阿霉素(Apexbio，Cat#.A2451-100mg)、500ng/ml奥沙利铂(Ark pharm，Cat#.Ak-72813)和10ng/ml 5-FU(Acros，Cat#.Un12811))化疗药物处理72小时，将药物清除后用常规培养基(DMEM+10％FBS)继续培养24小时。处理后的靶细胞按照上述方法步骤进行ADCC检测。2×105NK92MI-CD16a细胞和2×104KATO-III细胞或者NUGC-4细胞(效靶比是10∶1)用在测试中。如图3A和3B所示，四个单克隆抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66均能显著诱导NK92MI-CD16a细胞对KATOIII细胞和NUGC-4细胞的杀伤功能。

[0196] 为进一步了解Claudin 18.2抗体是否特异性地引起对Claudin 18.2+细胞的ADCC效应，检测这些抗体针对过表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞引起ADCC的能力。1×105NK92MI-CD16a和2×104过表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞(效靶比5∶1)用在测试中。如图4A和4B所示，4种检测的抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66均能特异性地引发对过表达Claudin18.2的HEK-293细胞的ADCC效应，而在过表达Claudin18.1的HEK-293细胞上没有观察到细胞毒性效果。

[0197] 实施例6 Claudin 18.2抗体的CDC活性

[0198] 使用细胞毒性检测试剂盒(Roche，Cat#：04744926001)，检测Claudin18.2抗体针对实施例5中的MC38/hClaudin18.2细胞引发CDC效应的能力。靶细胞MC38/hClaudin18.2于1200rpm离心4分钟，然后用DMEM培养基+1％FBS重悬。将靶细胞的密度调整到3x105细胞/ml，在96孔板的各孔内加入100μl细胞悬液。抗体稀释成不同浓度加入检测孔，使其最终浓度为20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml，0.0064μg/ml和0.00128μg/ml。加入终浓度为5％的正常人血清补体(Quidel，Cat#：A113)，获得的混合物于37℃孵育2小时。
LDH显色液以100μl/孔的浓度添加，之后样品避光常温孵育20分钟。用MD SpectraMax i3读板。

[0199] IMAB362抗体作为阳性对照，HEL抗体作为阴性对照。如图5所示，所有检测抗体，18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66，均能以剂量依赖方式诱导强CDC效应

[0200] 实施例7 Claudin18.2抗体对人Claudin18.2的结合稳定性

[0201] 对纯化的Claudin 18.2抗体进一步FACS检测其对HEK293A/hClaudin18.2细胞的结合稳定性。具体地，105个HEK293A/hClaudin18.2细胞铺至96孔板的各孔中，并加入10μg/ml Claudin18.2抗体。4℃孵育1小时后，板用PBST清洗3遍，细胞重悬于细胞培养基(DMEM)，继续在37℃孵育0小时、3小时或者5小时。向板加入RPE耦合的山羊抗人IgG二抗(1∶500，Thermo，Cat#：PAI-86078)。4℃孵育1小时后，板用PBS清洗3遍，然后上FACS仪(BD)监控细胞荧光。

[0202] 如图6所示，所有4个抗体，18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66，表现出比IMAB362更高的结合稳定性，该结果与其更高的ADCC和CDC活性对应，说明更高的ADCC和CDC活性可能是由更高的结合稳定性带来的。

[0203] 实施例8 Claudin18.2抗体的人源化改造

[0204] 基于上述相关功能试验，挑选四个嵌合抗体分子18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66进行人源化设计和进一步研究。通过将CDR移植到人种系框架上使抗体
Claudin18.2人源化。具体方法如下：

[0205] 为筛选用于人源化嵌合抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66的受体骨架，将这些嵌合抗体的轻链和重链可变区序列与NCBI人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对，以确定同源度的人种系IGVH和IGVK，作为人源化的受体。对于上述4个抗体抗体，所选择的人轻链受体是IGKV4-1*01，所选择的人重链受体是IGHV1-46*01。

[0206] 对上述4个抗体的可变结构域进行3D结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构而言重要的关键骨架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。所选结构模板与18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66有同类的典型L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3环状结构。利用所选择的结构模板，用人种系重链和轻链骨架代替小鼠的骨架从而构建结构模型。随后进行3D结构建模，以鉴定出可能对维持CDR环状结构或重链和轻链接合较为重要的关键框架氨基酸残基。当鼠源抗体和人受体骨架在骨架某一位点上拥有相同的氨基酸残基时，保留人种系氨基酸残基。另一方面，当鼠源抗体和人种系受体骨架在骨架某一位点上拥有不同的氨基酸残基时，通过结构建模来评价该残基的重要性。如果发现鼠源抗体骨架的某一氨基酸残基与CDR残基相互作用并产生影响，那么该残基则回复突变为鼠源残基。表3总结了用于抗体结构模拟的模板信息。

[0207] 表3.抗体结构模拟中使用的结构模板

[0208]

[0209] 在上述结构建模的基础上，对于抗体重链鉴定出11个潜在的回复突变(R38K、A40R、M48I、R67K、M70L、R72V、T74K、T76S、V79A、R87T、A97T)，对于轻链鉴定出6个潜在的回复突变(D9S、A12T、R18K、N22S、V89L、Q106S)。

[0210] 如以下表4所示，对于各个亲和力成熟改造的Claudin 18.2抗体，共涉及出7个人源化重链可变区和3个轻链可变区。

[0211] 表4.设计用于Claudin 18.2抗体的回复突变

[0212]

[0213] 化学合成编码人源化全长抗体的DNA序列(各重链/轻链可变区(总结在表1中)+人IgG1/κ恒定区(SEQ ID Nos.：67和68))，并分别利用EcoR I和Xho I、Cla I和Hind III酶切位点克隆到表达载体pCDNA3(Invitrogen)中。所有的表达构建体通过DNA测序证实。这42个人源化Claudin 18.2抗体(18F2-5为10个，18F2-30为11个，18F2-35为11个，18F2-66为10个)用实施例3中的方法步骤瞬时表达，并纯化。纯化的人源化抗体进一步进行表征研究。

[0214] 实施例9人源化Claudin 18.2抗体与HEK293A细胞上表达的Claudin 18.2结合

[0215] 对上述40个人源化抗体进一步检测与分别表达于HEK293A/hClaudin18.2细胞或HEK293A/hClaudin18.1细胞上的人Claudin 18.2或人Claudin 18.1的结合力。FACS操作同实施例4。

[0216] 代表性人源化Claudin 18.2抗体的结合亲和力显示在图7A-7C中。人源化抗体的结合亲和力与母抗体近似，且没有一个表现出对人Claudin 18.1的结合亲和性，表明它们对于人Claudin 18.2的高特异结合性。基于该结合亲和性，其中的6个抗体(18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3、18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3、18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3)选出进行进一步研究。

[0217] 实施例10人源化Claudin18.2抗体的CDC活性

[0218] 对人源化抗体进一步检测其引发对表达人Claudin18.2的MC38细胞的CDC效应的能力。根据实施例6的方法步骤进行CDC检测。IMAB362作为阳性对照抗体，HEL抗体作为阴性对照抗体。

[0219] 实验结果如图8A-8C所示，所有测试的人源化抗体均表现出较强的CDC效应。

[0220] 实施例11人源化Claudin18.2抗体的ADCC活性

[0221] 使用NK92MI-CD16a细胞为效应细胞，检测人源化抗体引发ADCC杀伤效应的能力。根据实施例5的方法步骤进行ADCC检测。

[0222] 首先检测人源化抗体对MC38/hClaudin18.2细胞的ADCC诱发能力。如图9A-9C所示，在所有人源化抗体中18F2-35VH0VL0、18F2-5VH0VL0和18F2-30VH7VL3表现出较强的ADCC效应。

[0223] 基于该结果，进一步检测人源化抗体对EOF预处理的KATO-III细胞和NUGC-4细胞的ADCC诱导效应，以上两种细胞均被认为具有内源性Claudin 18.2的高表达。KATO-III细胞和NUGC-4细胞用10ng/ml表阿霉素(Apexbio，Cat#.A2451-100mg)、500ng/ml奥沙利铂(Ark pharm，Cat#.Ak-72813)和10ng/ml 5-FU(Acros，Cat#.Un12811)(EOF)处理72小时，除去药物后，细胞在正常培养基(DMEM+10％FBS)中再培养24小时。按照实施例5的方法步骤进行ADCC检测。

[0224] 如图10A和10B所示，与对照抗体IMAB362相比，所有6种测试的人源化Claudin18.2抗体对KATO-III或NUGC-4靶细胞均显示出较强的ADCC活性。

[0225] 实施例12人源化Claudin18.2抗体ADCC和CDC诱导效应的特异性

[0226] 为确定Claudin18.2抗体对表达Claudin 18.2的靶细胞而非表达Claudin 18.1的细胞特异性地表现出ADCC或CDC效应，使用表达人Claudin 18.1或人Claudin 18.2的HEK293A细胞(HEK293A/hClaudin18.1细胞HEK293A/hClaudin18.2细胞)作为靶细胞，根据实施例5和6中的方法步骤，进行ADCC和CDC检测。如图11A、11B(ADCC检测)和图12A、12B(CDC检测)所示，所有测试的Claudin 18.2抗体仅对表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞而非表达人Claudin 18.1的HEK293A细胞表现出ADCC效应和CDC效应，表明由Claudin18.2抗体引起的ADCC和CDC效应对于人Claudin18.2表达细胞是高度特异的。

[0227] 实施例13人源化Claudin18.2抗体对人Claudin18.2的结合稳定性

[0228] 选择10个人源化Claudin18.2抗体，根据实施例7的方法步骤，通过FACS检测其与稳定过表达人Claudin18.2的HEK293A细胞(HEK293A/hClaudin18.2)的结合稳定性。IMAB362抗体作为阳性对照，HEL抗体为阴性对照。

[0229] 如图13所示，这些人源化抗体具有不同的结合稳定性，且结合稳定性趋于与ADCC和CDC检测结果一致。

[0230] 实施例14人源化Claudin18.2抗体的结合表位分析

[0231] 为确定各人源化Claudin18.2抗体的结合表位，构建了表达胞外环1中有突变的人Claudin 18.2或Claudin 18.1突变体的16个HEK293A细胞株，其突变体的氨基酸序列列于表5。具体而言，设计出8个人Claudin 18.2突变体，其中胞外环1中的单氨基酸残基用Claudin 18.1胞外环的对应氨基酸残基替换。稳定过表达Claudin 18.2或Claudin 18.1突变体的HEK293A细胞株通过实施例1中的方法步骤经慢病毒侵染而构建。此外，进行FACS检测来研究Claudin 18.2抗体对各突变体的结合亲和力，结合力从强到弱依次分表示为+++、++、+、-。

[0232] 表5.人Claudin 18.1和人Claudin 18.2突变体的氨基酸SEQ ID NO.以及抗体对突变体的结合能力

[0233]

[0234] 如表5所示，所有检测抗体，包括IMAB362抗体，均不结合表达突变体6(带有E56Q突变)的细胞，表明E56对于抗体-Claudin 18.2相互作用是必要的氨基酸残基。此外，数据表明，带有A42S(突变体3)或N45Q(突变体4)突变的Claudin 18.2完全丧失了IMAB362的结合，并部分丧失了人源化抗体18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0的结合。以上这些表明，与IMAB362相比，抗体18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0与人Claudin 18.2胞外环1中的不同表位结合。

[0235] 基于上述结果，设计了另外5个具有双点或多点突变的Claudin 18.2突变体。如表5所示，IMAB362对这5个突变体没有结合性，而所有人源化抗体表现出对突变体9、10和11的完全或部分结合亲和性，表明人Claudin 18.2的A42和N45对于IMAB362的结合亲和性是必要的，而对于18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0不是必要的。

[0236] 为进一步证实该结论，制备了3个过表达Claduin18.1突变体的细胞株。与上述结果一致，除IMAB362外的所有抗体均可以与表达突变体14的细胞结合，表明本发明人源化抗体与IMAB362之间的不同的结合图谱，参见图15。此外，从图16A-16D中可以看出，E47Q回复突变并没有改善IMAB362对Claudin 18.2的结合亲和性，但是增强了18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0的结合亲和性，表明人Claudin 18.2/Q47对于18F2-30VH0VL0、
18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0的Claudin 18.2结合是重要的氨基酸残基。

[0237] 综上，与对照抗体IMAB362相比，人源化抗体18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0与人Claudin 18.2胞外环1中的不同表位结合。

[0238] 实施例15人源化抗Claudin18.2抗体经PBMC和Vγ9Vδ2T细胞表现ADCC效应

[0239] 对人源化Claudin 18.2抗体进一步分析其经人PBMC引发对实施例5中制备的MC38/hClaudin 18.2细胞或EOF预处理的NUGC-4细胞的ADCC效应，其中，MC38/hClaudin 
18.2细胞通过表达GFP蛋白的pLV-EGFP(2A)-Puro载体的侵染而得到。人PBMC使用淋巴分离液通过密度梯度离心而获得，并在培养基(RIPM1640+10％FBS+300IU IL-2)中培养过夜。

[0240] ADCC效应检测通过LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher，USA，Cat#：L34964)进行。靶细胞和效应细胞PBMC 1200rpm离心5分钟。细胞用ADCC实验培养基(RIPM1640培养基+1％FBS)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约90％。靶细胞密度调整成4x105/ml，PBMC细胞密度调整成8x106/ml。各取50μl(效靶比20：1)加入各孔。在样品检测孔中加入稀释好的各种检测抗体，以MC38/hClaudin18.2为靶细胞的抗体终浓度分别为
800ng/ml，32ng/ml和6.4ng/ml，以NUGC-4为靶细胞的抗体终浓度为4000ng/ml，160ng/ml，
64ng/ml和2.5ng/ml。然后样本于37℃孵育12小时。混合物用PBS洗3遍，然后与LIVE/DEAD可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用PBS洗3遍，用FACS进行检测。计算出GFP阳性细胞(MC38/hClaudin18.2细胞)的细胞死亡率。

[0241] 针对NUGC-4细胞的检测，将NUGC-4细胞预先用10ng/ml表阿霉素(Apexbio，Cat#.A2451-100mg)、500ng/ml奥沙利铂(Ark pharm，Cat#.Ak-72813)和10ng/ml 5-FU(Acros，Cat#.Un12811)(EOF)处理72小时，然后除去药物。细胞在正常培养基继续(DMEM+10％FBS)中继续培养24小时。根据制造商的说明书，NUGC-4细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯CSFE(Invitrogen，USA，Cat#：C34554)标记。ADCC检测按照上述方法步骤进行，除效靶比调整为50∶1外。

[0242] 之前的研究表明，Vγ9Vδ2T细胞对于Claudin 18.2抗体的ADCC活性很重要。在本实施例中，在人PBMC中富集培养Vγ9Vδ2T细胞。具体而言，收集PBMC细胞，并培养在诱导Vγ9Vδ2T细胞的DMEM培养基中(含10％FBS+300IU IL-2+1μM唑来膦酸(ZA))。经过14天的富集诱导，收集细胞，用作ADCC检测中的效应细胞。以MC38/hClaudin 18.2细胞为靶细胞时，效靶比是20∶1；以EOF预处理的NUGC-4细胞为靶细胞时，效靶比是50∶1。ADCC方法步骤与上述一致。

[0243] 如图17A、17B(PBMC为效应细胞)和图18A、18B(Vγ9Vδ2T细胞为效应细胞)的结果来看，所有的Claudin18.2抗体都能以剂量依赖方式诱导PBMC和Vγ9Vδ2T细胞对靶细胞的ADCC效应。Vγ9Vδ2T细胞介导的ADCC效应强于PBMC细胞，与之前的研究一致。

[0244] 实施例16 Claudin18.2抗体的体内抗肿瘤效果

[0245] 选择6个Claudin18.2抗体(18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3、18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3、18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3)，测试其在带有小鼠结肠腺癌的C57小鼠中的体内抗肿瘤效果。为更好地体现抗体在动物模型中的ADCC效应，抗体的可变区与小鼠IgG 2a/κ恒定区融合来制备全长抗体，其中小鼠IgG 2a和κ恒定区氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs.：89和90中。

[0246] 在第0天，用1×106过表达人Claudin18.2的MC38细胞(MC38/hClaudin18.2)皮下3
注射小鼠一边侧腹。待肿瘤长到约80mm时随机分组(n＝8)，在第5、7、10、12、14、17和19天，腹腔注射其中一种抗体，10mg/kg。随时间推移监测肿瘤生长，肿瘤在第5、7、10、12、14、17和
19天测量。肿瘤用游标卡尺测量长和宽，并通过公式TV＝(长×宽2)/2计算肿瘤体积。当肿瘤达到3cm3时停止实验。

[0247] 如图19A和19B所示，所有测试的抗体都能抑制肿瘤生长，具有18F2-30VH0VL0可变区的抗体展示出最佳的抗肿瘤效果。

[0248] 实施例17 Claudin 18.2抗体与化疗结合的抗肿瘤效果

[0249] 在第0天，用1×106过表达人Claudin18.2的MC38细胞(MC38/hClaudin18.2)皮下注射小鼠一边侧腹。待肿瘤长到约80mm3时随机分组(n＝10)。在第5和12天的时候，小鼠腹腔注射EOF(表柔比星(1.25mg/kg)、奥沙利铂(3.25mg/kg)和5-FU(56.25mg/kg))或对照载体。在第6、8、11、13、15和18天，小鼠腹腔注射18F2-30-VH0VL0、18F2-5-VH0VL0、18F2-35-VH7VL3(三种抗体的恒定区为小鼠IgG 2a/κ恒定区，其中小鼠IgG 2a和κ恒定区氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs.：89和90中)或对照剂，10mg/kg。随时间推移监测肿瘤生长，肿瘤在第5、7、10、12、14、17和19天测量。肿瘤用游标卡尺测量长和宽，并通过公式TV＝(长×宽2)/2计算肿瘤体积。当肿瘤达到3cm3时停止实验。

[0250] 如图20所示，所有抗体与EOF联合治疗都存在协同抑制肿瘤的效果，具有18F2-30VH0VL0可变区的抗体展示出最佳的协同抗肿瘤效果.

[0251] 实施例18去岩藻糖化Claudin18.2抗体的ADCC和CDC效应

[0252] SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞由天广实公司构建，具体构建方法参见US2018/0022820 A1。由该细胞系表达的蛋白是基本上没有岩藻糖化修饰的。

[0253] 通过将18F2-30VH0VL0和18F2-35VH7VL3重链/轻链可变区加上人IgG1/κ恒定区(SEQ ID Nos.：67and 68)克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，USA)中构建表达载体，之后转染到SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞中。

[0254] 两种去岩藻糖化的Claudin18.2抗体18F2-30VH0VL0和18F2-35VH7VL3在CHO-K1-AF细胞中瞬时表达并进行纯化，抗体命名为18F2-30VH0VL0AF和18F2-35VH7VL3AF。抗体表达和纯化的具体实验步骤参照实施例3。

[0255] 使用NK92MI-CD16a细胞为效应细胞，使用EOF预处理的NUGC-4细胞作为靶细胞，检测去岩藻糖化抗体引发ADCC杀伤效应的能力。根据实施例5的方法步骤进行ADCC检测。

[0256] 对去岩藻糖化抗体进一步检测其引发对表达人Claudin18.2的MC38细胞的CDC效应的能力。根据实施例6的方法步骤进行CDC检测。IMAB362作为阳性对照抗体，HEL抗体作为阴性对照抗体。

[0257] 结果如图21A和21B所示，去岩藻糖化抗体18F2-30VH0VL0AF和18F2-35VH7VL3AF比它们相应的亲本18F2-30VH0VL0和18F2-35VH7VL3具有更强的ADCC效应。同时如图22A和22B所示，去岩藻糖化的抗体18F2-30VH0VL0AF和18F2-35VH7VL3AF具有与它们的亲本抗体18F2-30VH0VL0和18F2-35VH7VL3相当的CDC活性。

[0258] 尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。