一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂

摘要

本发明公开了一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂，属于洗涤剂领域。本发明提供了一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂，该复合稳定剂以柠檬酸铵钙、APG0810和APG1214组成。相比于硼砂，本发明提供的复合稳定剂能够显著提高液体洗衣液中的蛋白酶在常温以及40℃条件下的酶活保持率。

权利要求

1.一种用于稳定洗衣液中的蛋白酶的复合稳定剂，其特征在于，包含柠檬酸铵钙和烷基糖苷表面活性剂，所述柠檬酸铵钙是由柠檬酸铵与柠檬酸钙按照摩尔比为（25-20）：1的比例复配得到的；

所述复合稳定剂与蛋白酶的质量比例是（0.5-5）:1；

所述蛋白酶是Purafect 4000L时，所述用于稳定洗衣液中的蛋白酶的复合稳定剂包括

2%柠檬酸铵钙、1% APG0810、2% APG1214；

所述蛋白酶是Purafect Prime 4000L时，所述用于稳定洗衣液中的蛋白酶的复合稳定剂，包括2%柠檬酸铵钙、0.5% APG0810、0.5% APG1214。

2.一种洗衣液，其特征在于，含有权利要求1所述的用于稳定洗衣液中的蛋白酶的复合稳定剂。

说明书

一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂，属于洗涤剂领域。

背景技术

[0002] 蛋白酶是洗涤剂工业中应用最广泛的酶制剂，但在洗衣液中的稳定性远远低于其在洗衣粉中的稳定性。硼砂曾经被广泛用于液体加酶洗衣液中，但目前硼砂已被欧洲禁止
在加酶洗涤剂中使用；因此非常需要寻求硼砂的替代品或者通过其它途径提高蛋白酶在洗
衣液中的稳定性。

[0003] 影响蛋白酶在洗衣液中的稳定性的因素，除了洗衣液中的活性成分如一些非离子表面活性剂，最主要的还是蛋白酶本身的酶学性质。目前，帮助蛋白酶在洗涤剂中保持一定
稳定性的途径包括：改造生产蛋白酶菌株的基因、将蛋白酶固定化以及添加稳定剂。改造蛋
白酶基因以及将酶进行固定化，都存在技术复杂和成本较高的问题。加入稳定剂来保持酶
活的方法较为简便，但稳定性能好的稳定剂或复配稳定剂较少。有的稳定剂需要合成而合
成工艺保密；有的稳定剂的效果属于公认较好的如硼砂，又被各种原因限制甚至禁止使用。

[0004] 蛋白酶和粉状洗涤剂即表面活性剂共存或者在极稀水溶液(如洗涤环境)中容易被稳定剂稳定。但一定浓度范围的表面活性剂却容易使酶失活。因此加酶液体洗涤剂如加
酶洗衣液中蛋白酶的稳定剂选取一直是个困扰工业界的问题。学界常常只注意单一表面活
性剂或者低浓度表面活性剂对酶活的影响，或者选取的检测条件是酶的最佳酶活条件而不
是洗衣液(那样硼砂或其它稳定剂的稳定效果都自然会好)；实际上，必须将酶置于洗涤剂
中，在洗涤剂浓度下，以硼砂为阳性对照，选取稳定效果超过或者与硼砂接近的稳定剂，才
能真正有助于选取蛋白酶的稳定剂。

[0005] 从对蛋白质的亲和力分析，可能的稳定剂有二羧酸盐、多元醇、多元酸以及一些无机盐类。无机盐类中，硼酸盐类稳定剂如硼砂的效果相对较好，室温下能一定程度地保持加
酶洗衣液的酶活，曾经被广泛用于液体加酶洗衣液中；但目前硼砂已被欧洲禁止在加酶洗
涤剂中使用。公开号为CN 107815354 A的专利申请中公开了利用多元醇胺、多元醇、卤化
钙、多元酸钠、磺酸盐、柠檬酸配伍得到的活性保持剂能够为蛋白酶提供一个长期稳定的生
存环境；但该专利申请公开的方法同时使用的稳定剂太多，给配方中表面活性剂的配伍带
来了不确定性；而且需要严格控制反应体系的酸碱度才能使得活性保持剂对蛋白酶的作用
发挥到最大。CN201810585252.3公开了一种超浓缩洗衣液及其制备方法，所述超浓缩洗衣
液的各原料及其重量份数配比为：水20-40份、椰油酸钾10-20份、非离子表面活性剂40-70
份、椰油酰胺DE1-5份、丙二醇1-5份、蛋白酶0.1-1份、纤维素酶0.1-1份、EDT0.1-1份、柠檬
酸0.1-1份、防腐剂0.1-1份、香精0.1-1份；没有提及蛋白酶的稳定性。公开号为CN 
105154253 A公开了利用柠檬酸、丙二醇、氢氧化钠为稳定剂来保证多酶的储藏时间并缩短
多酶分解有机物及油污的时间，没有和表面活性剂复配作为洗衣液使用。

[0006] 因此，广泛和深入地研究稳定剂、表面活性剂和环境因素对酶活的影响，并且给出切实有效的提高蛋白酶在洗衣液中的稳定性的方案有着重要的实际意义。

发明内容

[0007] [技术问题]

[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂。

[0009] [技术方案]

[0010] 本发明提供了一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂，包括以洗衣液总质量计的0.5％-2％柠檬酸铵钙、0.5％-1％APG0810、0.5％-2％APG1214。所述柠檬酸铵钙是将
柠檬酸铵与柠檬酸钙按照摩尔比为(25-20)：1的比例复配得到的。所述稳定洗衣液蛋白酶，
是指在25～40℃的保存条件下，复合稳定剂能够减少酶活的损失。

[0011] 针对市场上使用较多的洗涤剂用蛋白酶，发明人选择了几种在液体洗涤剂中稳定性较弱的蛋白酶来攻克。

[0012] 发明人在实验中发现柠檬酸铵钙和柠檬酸钙对洗衣液中的蛋白酶的酶活保持率具有显著的促进作用，特定的混合柠檬酸盐比硼砂对几种市售洗涤剂专用蛋白酶的稳定作
用更强，这可能是由于钙离子作为酶的辅基能够与酶的活性中心结合，使蛋白酶活性中的
疏水结构向蛋白酶内部转移，让酶的分子结构变得更为紧密而利于蛋白酶的酶活的提高。
就柠檬酸钙而言，其效果虽好，却难以直接加入；以柠檬酸铵钙的形式来使用则可以解决这
个问题。

[0013] 和其它离子型表面活性剂相比，非离子表面活性剂对酶活的损伤最低。考虑到APG系列作为有一定去污能力的非离子表面活性剂，可同时用于洗衣液中作为去污剂。发明人
将柠檬酸铵钙和广分布的烷基葡萄糖糖苷表面活性剂APG(即不同碳链产品的混合物)复配
后，获得了一种优良的柠檬酸铵钙-APG0810-APG1214三元复合稳定剂，对所示蛋白酶在洗
衣液中有超过柠檬酸铵钙和硼砂的稳定作用。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶是Purafect 4000L时，所述复合稳定剂包括2％柠檬酸铵钙、1％APG0810、2％APG1214。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶是Purafect Prime 4000L时，所述用于洗衣液的蛋白酶复合稳定剂，包括2％柠檬酸铵钙、0.5％APG0810、0.5％APG1214。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述用于稳定洗衣液蛋白酶的复合稳定剂中还可以添加AEO。例如AEO7、AEO9。

[0017] 本发明还提供了使用所述用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂的方法，所述复合稳定剂与酶的质量比例是(0.5-5):1。

[0018] [有益效果]

[0019] 在25～40℃的保存条件下，复合稳定剂能够比公认稳定作用很好的硼砂更好地减少酶活的损失。例如，在pH7和37℃下，用硼砂做稳定剂，Purafect 4000L和Purafect Prime 
4000L的3周酶活保持率分别为2.87％和13.5％；而应用本发明提供的蛋白酶复合稳定剂，
同样条件下的3周酶活保持率分别为47.1％和42.0％。

[0020] 在pH7和25℃下，本发明提供的蛋白酶复合稳定剂可分别使Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的3周酶活保持率达到84.3％和71.5％，仍然高于同样条件下硼砂
所致的65.7％和68.4％。

附图说明

[0021] 图1柠檬酸铵钙及其它稳定剂对蛋白酶的稳定作用对比，a：Purafect 4000L，b：EFFECTENZ P150，c：Purafect Prime 4000L。

[0022] 图2表面活性剂对蛋白酶酶活的影响，a：Purafect 4000L，b：Purafect Prime 4000L。

[0023] 图3混合表面活性剂对Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L酶活的影响。

具体实施方式

[0024] 测定蛋白酶酶活的方法：Folin法。具体地，将1％的酪蛋白溶液1mL置于试管中，于40℃恒温水浴中恒温15min，加入1mL稀释一定倍数的酶液。反应15min后，加入2mL三氯乙酸
(0.4mol/L)终止反应。继续放置于水浴中恒温15min，过滤。移取滤液1mL，加入5mL碳酸钠溶
液(0.4mol/L)和稀释好的福林试剂1mL，摇匀后继续置于40℃恒温水槽中20min，恢复至室
温后于紫外分光光度计测定波长660nm处的吸光度。在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪
氨酸所需要的酶量，定义为1个蛋白酶酶活单位。酶活单位为U/mL。

[0025]

[0026] 式中，A，由样品测得的吸光度，与标准曲线比对可得到相应的酪氨酸质量(μg)；4，从4mL反应中取出1mL溶液测定；t，反应时间，min；N，酶稀释倍数。

[0027] 除误差线明确标示的以外，所有数据的相对误差小于5％。

[0028] 加酶洗衣液的制备和测定酶活保持率的方法：

[0029] 典型地(正交实验时见表中数据)，将稳定剂和0.5克蛋白酶(本实施例所用酶均为固体粉末，液体酶可折干计算)依次加入到容量为200mL的样品瓶中，用涡流振荡器将其混
匀，稳定剂与所加酶的质量比例分别为：柠檬酸镁∶酶＝1∶10，柠檬酸钙∶酶＝1∶4000，其它
稳定剂∶酶＝1∶1。之后再将含酶混合物加入液体洗涤剂(洗衣液)中，溶液总质量为100g。搅
拌混匀，测定此时的酶活为初始酶活，并将此溶液置于37℃或25℃下保存，于不同时间取
样，一式两份，稀释后采用Folin法测定此时体系中蛋白酶酶活。实验时间下体系中蛋白酶
酶活与初始体系中蛋白酶酶活的百分比即为相应时间的酶活保持率。

[0030] 洗衣液配方(质量百分数，各组分以干基计)：AES，21.5％；AEO7，2.5％；AEO9，2.5％；柠檬酸三钠，3.5％；聚醚消泡剂，0.05％；柠檬酸，0.1％；NaCl，0.5％；荧光增白剂，
0.14％；开松，0.05％；柠檬香精，0.1％；余量为去离子水。实验用水为去离子水。其中，烷基
糖苷表面活性剂APG0810、烷基糖苷表面活性剂APG1214，购自上海发凯化工有限公司；柠檬
酸(食品级)、脂肪醇聚氧乙烯醚AEO7(有机物质量浓度为99％)、脂肪醇聚氧乙烯醚AEO9(有
机物质量浓度为99％)、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠AES(有机物质量浓度为70％)均购自山东
优索化工科技有限公司。

[0031] 实施例1柠檬酸盐及其它稳定剂对蛋白酶的稳定作用对比

[0032] 稳定剂：柠檬酸镁、柠檬酸钙、柠檬酸铵钙、柠檬酸单甘脂、柠檬酸、柠檬酸铵、EDTA-2Na、山梨醇、APG0810、APG1214、甘油、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、司班20。其中，
柠檬酸铵钙是将柠檬酸铵与柠檬酸钙按照摩尔比为20：1的比例溶于水后，作为储备液使用
或者干燥后备用。

[0033] 对照稳定剂：硼砂。

[0034] 蛋白酶：Purafect 4000L、EFFECTENZ P150或Purafect Prime 4000L。

[0035] 测定上述不同的稳定剂对不同的蛋白酶的酶活保持率的影响。如图1所示，柠檬酸盐尤其是柠檬酸铵钙的稳定效果最好。相比于硼砂，柠檬酸铵钙使得Purafect 4000L、
EFFECTENZ P150和Purafect Prime 4000L的24h酶活保持率分别提高了19.75％，66.09％
和37.91％。

[0036] 实施例2利用柠檬酸铵钙-APG0810-APG1214复合稳定剂提高蛋白酶在洗衣液中的稳定性

[0037] Purafect 4000L和EFFECTENZ P150这2种蛋白酶的基础性质比较接近，故选择其一用于举例实施。

[0038] 为加速酶的失活，采用较高温度(40℃)试验。在不同时间点下，通过正交实验选取pH7，40℃保存条件下的最佳稳定剂的配比。以硼砂为对照稳定剂。

[0039] 选取L934正交表，以蛋白酶的酶活保持率为指标，4个因素分别为柠檬酸铵钙含量(w/w)、APG0810含量(w/w)、APG1214含量(w/w)和蛋白酶含量(w/w)。正交试验的因素和水平
(表1中百分含量指以洗衣液的总质量计)见表1，不同时间点下正交实验的试验结果见表2
和3。

[0040] 表1正交实验的因素和水平(40℃)

[0041]

[0042] 表2 Purafect 4000L酶活稳定性正交试验结果(40℃)*

[0043]

[0044] *所有数据的相对误差均小于5％。“-”表示酶活保持率低于60％，因而没有提供相应数据。

[0045] 表3 Purafect Prime 4000L酶活稳定性正交试验结果(40℃)*

[0046]

[0047] *所有数据的相对误差均小于5％。“-”表示酶活保持率低于60％，因而没有提供相应数据。

[0048] 由表2和表3可知，复合稳定剂体系中，Purafect 4000L的96h酶活保持率均优于单独使用硼砂或单一柠檬酸铵钙体系的。虽然，在复合体系中，Purafect Prime 4000L的酶活
保持率均劣于单独使用柠檬酸铵钙体系的，但实验号为5和9的实验组的7d酶活保持率与柠
檬酸铵钙体系的接近，并且，考虑到APG的属性和可以减少柠檬酸铵钙的使用，复合体系应
该是个较好的选择。

[0049] 由表2和表3可知，酶活保持率的最优配方分别为：2％柠檬酸铵钙、1％APG0810、2％APG1214和0.5％Purafect 4000L；或者，2％柠檬酸铵钙、0.5％APG0810、0.5％APG1214
和0.5％Purafect Prime 4000L。此外，40℃下实验号为5和9的实验组存放4周后，Purafect 
4000L酶活仍保持约42.3％。

[0050] 以硼砂为阳性对照，将使用上述2个复合稳定剂稳定的洗衣液分别放置于不同温度下保存，实验结果如表4所示。

[0051] 表4硼砂为阳性对照下复合稳定剂对蛋白酶酶活稳定性*

[0052]

[0053] 由表4可知，所用复合稳定剂大幅提高了Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的热稳定性。在pH7，25℃下，Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的复合稳定剂
体系的3周酶活保持率分别可达到84.3％和71.5％；而相应地，硼砂体系的3周酶活保持率
分别为2.87％和13.5％。与表2中相应数据对比表明，即便在硼砂的稳定下，这2种酶在40℃
时的洗衣液中的稳定性会急剧下降。

[0054] 实施例3表面活性剂对Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的酶活影响

[0055] 本发明选取的洗衣液配方的主表面活性剂AES，AEO7和AEO9是目前常用的阴、非离子表面活性剂。3种表面活性剂在其cmc(其25℃下以质量浓度表达的cmc分别为：AES 
1.065g/L，AEO7 0.048g/L，AEO9 0.056g/L)及更低质量浓度下对酶活的影响见图2和图3。其
中，图3的试验溶液为AEO和AES的混合表面活性剂溶液，且AEO的质量浓度为4g/L(m(AEO7)：m
(AEO9)＝1:1)。

[0056] 图2和图3表明，阴离子表面活性剂AES对酶活影响较大，而非离子表面活性剂AEO7和AEO9的影响相对于AES较小。对于混合表面活性剂体系，AEO和AES的混合并不能降低AES
对酶活的损伤。因此将来可以考虑在液体加酶洗涤剂中增加APG和AEO的使用。

[0057] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。