一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用

摘要

本发明提供了一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用，涉及微生物诱变育种领域。以经过空间诱变筛选的菌株为出发菌，对其进行了常压室温等离子诱变，经多重抗性筛选、高通量筛选以及逐级放大验证筛选，得到了一种高产辅酶Q10类球红细菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.16625。本发明获得的类球红细菌突变株，经20m3发酵生产验证，其平均效价可达2694μg/mL，辅酶Q10的产量显著提高，另外，该菌株还具有四重抗性，其应用前景广阔。

权利要求

1.一种高产辅酶Q10类球红细菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.16625。

2.权利要求1所述的类球红细菌在发酵生产辅酶Q10中的应用。

说明书

一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物诱变育种领域，具体涉及一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用。

背景技术

[0002] 辅酶Q10(CoenzymeQ10，CoQ10)又称泛醌，化学名称为2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯苯醌，是一种类维生素物质，以极低的含量存在于动物、植物、微生物等细胞内，并能在所有的有机体组织中合成。辅酶Q10是生成ATP的必需辅酶和天然的抗氧化剂，参与细胞代谢活动，能够激活改善人体细胞，增强人体免疫系统功能，已广泛应用于保健品、食品、化妆品等行业。

[0003] 生产辅酶Q10原料的方法主要有生物提取法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生物活性高、原料成本低并可通过规模放大提高生产能力，被公认为是最具优势和潜力的一种技术工艺。自然界中生产辅酶Q10的菌株主要有红螺菌属(Rhodospirillum Molisch)、土壤杆菌属(Agrobacterium Conn)、副球菌属(Paracoccus Davis)、假单胞菌属(Pseudomonasaeruginosa)、假丝酵母属(Candida)等，其中类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是目前用来大规模发酵生产辅酶Q10的主要生产菌株之一。类球红细菌在通过循环光合磷酸化过程获得生长繁殖能量的同时，需要大量积累的辅酶Q10来消减光合作用产生的自由基。通常野生型微生物辅酶Q10的积累量只有(0.8-3.3)mg/g DCW，发酵水平(30-130)mg/L，无法满足工业大规模发酵生产的要求。目前，一般是通过高产菌种的选育与改造和发酵条件与过程控制的优化两种途径提高辅酶Q10的微生物发酵水平，获得辅酶Q10高产菌株的主要方法还是利用传统的物理或化学方法进行诱变育种，物理诱变具有方法简单、安全性高、成本低以及收获大等优点。

[0004] 常压室温等离子体(ARTP)被称为除气体、液体、固体以外物质的第四态，通过改变激发方式和发生器结构可以产生不同热力学状态的等离子体。等离子体具有臭氧浓度及紫外辐射强度均极低，安全性高、环境友好、诱变快速等特点，常压室温等离子体诱变操作简单，条件温和，菌株突变率高、突变点位和跨度广泛。ARTP工作气源种类、流量、放电功率、处理时间等条件均可控，通过改变仪器操作条件，可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量，结合压力筛选和高通量筛选技术，ARTP已经成为高效进化育种的新方法。ARTP诱变一般以致死率作为筛选诱变条件等的指标，致死率不宜过高或过低，有研究表明，致死率越接近90％，诱变效果越好，此时的诱变条件越佳。目前，中国专利公布CN105505915A公开了一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株的方法，诱变条件为电源功率115W，工作气流量10L/min，等离子体发射源与菌株之间的距离2mm，操作温度23.0-35.0℃，诱变处理时间0.5-3min。

[0005] 近些年来空间诱变育种被广泛应用于微生物育种，并取得了一定的成果，党磊等(2010)公开了一种利用空间诱变选育辅酶Q10高产菌的方法，利用空间搭载技术对类球红细菌进行空间诱变选育，最终得到名为Shenzhou6的突变株，产量可达(0.8±0.02)g/L。虽然类红球菌经多次空间搭载，进行空间诱变，菌种性能有了大幅提升。但由于同一诱变方式主要引起菌种某些基因固定位点的变化，经过多次搭载后菌株已经具有一定抗性，选育菌种性能提升不明显，出现了“疲劳现象”，制约了辅酶Q10菌种发酵水平的进一步提高。因此，在空间搭载诱变育种的基础上采用一种新型诱变方式对其进行再次诱变，增加诱变位点，筛选高性能突变株是非常必要的。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用。在空间诱变育种的基础上进行ARTP诱变，克服了现有技术中的问题，提高了辅酶Q10的产量。

[0007] 本发明一方面提供了一种高产辅酶Q10类球红细菌，菌株编号为CPF，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.16625。

[0008] 本发明另一方面提供了一种高产辅酶Q10类球红细菌的诱变选育方法，所述的方法包括以下步骤：

[0009] (1)种子菌悬液的制备：活化培养类球红细菌出发菌株CF02，挑取单菌落，32℃，220rpm培养24h，得到种子菌悬液；

[0010] 所述的类球红细菌出发菌株CF02的保藏编号为CGMCC NO.2458，是经过空间诱变筛选得到的；

[0011] (2)菌悬液载片的制备：取种子菌悬液，离心，去上清，以质量比为0.8％的生理盐水重悬菌体沉淀后，用稀释液稀释至OD600＝0.6-0.8，得到菌悬液，将菌悬液均匀涂于金属载片上制得ARTP诱变样品；

[0012] 所述的稀释液是体积比为5％的甘油和质量比为0.8％的生理盐水按照1:5的体积比混合而成；

[0013] (3)ARTP诱变：利用ARTP-II型仪器对ARTP诱变样品进行诱变，以99.99％氦气作为工作气体，电源功率100-120W，诱变距离1-3mm，诱变时间20-30s，保护剂是体积百分浓度为5％-15％的甘油，诱变后，涡旋振荡1-3min，洗脱菌液，得到诱变后的菌悬液；

[0014] 优选地，步骤(3)中所述的电源功率为120W、诱变距离为2mm、诱变时间为20s、保护剂是体积百分浓度为5％的甘油。

[0015] (4)菌株的筛选：对诱变后的菌悬液进行多重抗性筛选、高通量筛选以及逐级放大验证筛选，得到所述的高产辅酶Q10类球红细菌。

[0016] 具体地，步骤(1)所述的种子菌悬液的制备具体操作如下：

[0017] 在培养基A上活化培养类球红细菌出发菌株CF02，32℃培养5d；挑取单菌落，接种于含有培养基B的种子瓶中，32℃，220rpm培养24h，得到种子菌悬液；

[0018] 所述的培养基A包括：酵母粉1.0-10.0g/L，磷酸二氢钾0.1-2.5g/L，硫酸镁1.0-5.0g/L，硫酸亚铁0.1-1.0g/L，氯化钠0-5.0g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，谷氨酸钠0.5-3.0g/L，玉米浆干粉0.5-3.0g/L，葡萄糖5-20g/L，琼脂15-20g/L，pH＝6.5-7.3；

[0019] 所述的培养基B包括：酵母粉1.0-10.0g/L，磷酸二氢钾0.1-2.5g/L，硫酸镁1.0-5.0g/L，硫酸亚铁0.1-1.0g/L，氯化钠0-5.0g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，谷氨酸钠0.5-3.0g/L，玉米浆干粉0.5-3.0g/L，葡萄糖5-20g/L，pH＝6.5-7.3。

[0020] 优选的，所述的培养基A包括：酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.5g/L，硫酸铵2.5g/L，谷氨酸钠
1.0g/L，玉米浆干粉2.5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15-20g/L，pH＝7.16；

[0021] 所述的培养基B包括：酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.5g/L，硫酸铵2.5g/L，谷氨酸钠1.0g/L，玉米浆干粉2.5g/L，葡萄糖10g/L，pH＝7.16。

[0022] 具体地，步骤(4)中所述的多重抗性筛选包括如下步骤：

[0023] 取步骤(3)得到的诱变后的菌悬液复壮，接种于筛选培养基1中培养，得到抗辅酶Q10结构类似物的单重抗性菌株统称为R1；

[0024] 以R1为出发菌株进行ARTP诱变，复壮，接种于筛选培养基2中培养，在R1抗性基础上得到抗呼吸链泛醌抑制剂的双重抗性菌株统称为R2；

[0025] 以R2为出发菌株进行ARTP诱变，复壮，接种于筛选培养基3中培养，在R2抗性基础上得到抗细胞毒性物质的三重抗性菌株统称为R3；

[0026] 以R3为出发菌株进行ARTP诱变，复壮，接种于筛选培养基4中培养，在R3抗性基础上得到抗辅酶Q10前体类似物的四重抗性菌株统称为R4；

[0027] 所述的筛选培养基1为在培养基A中加入了辅酶Q10结构类似物；

[0028] 所述的筛选培养基2为在培养基A中加入了呼吸链泛醌抑制剂；

[0029] 所述的筛选培养基3为在培养基A中加入了细胞毒性物质；

[0030] 所述的筛选培养基4为在培养基A中加入了辅酶Q10前体类似物；

[0031] 所述的筛选培养：每种抗性物质重复筛选3次，32℃培养5d；

[0032] 所述的诱变后菌株复壮方法为：取1mL诱变后获得的菌悬液于培养基B中，32℃，220rpm复苏2h，稀释至OD600＝0.6-0.8后，取100μl稀释液涂布抗性平板，用于后续抗性平板筛选。将筛选后的较优菌株进行保藏，构建菌株突变库。

[0033] 所述的菌株保藏方法为：挑选的单菌落于50mL/250mL种子液培养基中，32℃，220rpm培养24h得到种子液，按种子液:50％甘油＝1:1的体积比，存放于-80℃冰箱进行低温保存。

[0034] 优选的，所述的辅酶Q10结构类似物为5mg/L维生素K3或55.6mg/L阿霉素；

[0035] 所述的呼吸链泛醌抑制剂为1.25mg/L Na3N或566mg/L Na2S；

[0036] 所述的细胞毒性物质为3.25mg/L放线菌素D；

[0037] 所述的辅酶Q10前体类似物为250mg/L苯甲酸或150mg/L对羟基苯甲酸。

[0038] 具体的，步骤(4)中所述的高通量筛选具体步骤如下：

[0039] 取上述的R4于含有培养基B的深孔板中，220rmp，32℃培养24h得到种子液；将种子液接种于培养基C中进行发酵培养，接种量为2％、装液系数为70％、摇床转速为220rpm，32℃培养72h，液相检测发酵液效价，筛选辅酶Q10相对产率在6.4％以上的菌株作为高通量筛选菌；

[0040] 所述的培养基C包括：玉米浆干粉2.0g/L，谷氨酸钠2.5g/L，硫酸铵3.0g/L，硫化钠1.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁5.0g/L，碳酸钙5.0g/L，葡萄糖20g/L，pH＝7.10-7.20；

[0041] 所述的液相检测条件为：波长＝275nm，进样量10μl，4.6mm*150mm C18反向柱，柱温32℃，流速1mL/min，运行时间20min。

[0042] 具体的，所述深孔板发酵液效价检测方法：将培养好的突变株发酵液经孔板离心机，4500rmp离心10min，去除发酵液中的水相，取300μl上清液，经真空孔板过滤器(0.45μm滤膜)过滤三次，最终获得1mL滤液，将其移入灭菌干燥的离心管，向管内加入30％过氧化氢0.1mL和0.1M盐酸0.1mL，用乙醇定容至10mL，吸液时，冲洗孔内壁的挂壁菌丝，反复吹打，混匀发酵液，移液时，反复吹打，将枪头内挂壁发酵液转到离心管中，颠倒混匀后，放入超声波清洗器中，超声1h，从超声波清洗器中取出离心管，颠倒混匀，静置15min，取上层样品液300μl，加入到96孔过滤器中，滤液经0.45μm有机相过滤膜过滤，吸取滤液1mL于液相进样瓶中，用液相进行检测。

[0043] 具体的，步骤(4)中所述的逐级放大验证筛选步骤包括：取权利要求5得到的高通量筛选菌经摇瓶筛选，2L四联罐发酵，一级种子罐培养，二级种子罐培养，再转移至20m3发酵罐中发酵培养，筛选得到高产辅酶Q10类球红细菌。

[0044] 更具体的，步骤(4)中所述的逐级放大验证筛选步骤包括：

[0045] 摇瓶筛选：取高通量筛选菌经培养基A平板培养，培养基B种子培养，再接种含到有培养基C的摇瓶中，32℃，220rpm培养3天，进行液相检测，筛选出发酵效价在528μg/mL以上的菌株，统称为菌株A；

[0046] 2L四联罐发酵：将摇瓶筛选得到的菌株A经培养基A平板培养，培养基B种子培养，再接种到含有培养基C的2L四联罐中，32℃培养90h，期间补充补料1三次，进行液相检测，筛选出发酵效价在2010μg/mL以上的菌株，统称为菌株B；

[0047] 20m3发酵罐筛选：将2L四联罐发酵得到的菌株B经培养基A平板培养，培养基B种子培养，培养基D的一级种子罐中培养24h，培养基E的二级种子罐中培养16h，再转移至含有培养基F的20m3发酵罐中发酵培养，期间补充补料2三次，培养90h，进行液相检测，筛选得到高产辅酶Q10类球红细菌。

[0048] 具体的，所述的培养基D包括：葡萄糖4g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁1g/L，碳酸钙35g/L，消泡剂0.3g/L，玉米浆干粉0.5g/L，谷氨酸钠0.5g/L，硫酸锰0.03g/L，氯化钴0.001g/L，酵母粉1.0g/L，pH＝7.10-
7.20；

[0049] 所述的培养基E包括：葡萄糖12.6g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸氢二钾0.63g/L，磷酸二氢钾0.63g/L，硫酸镁2.9g/L，硫酸亚铁0.15g/L，消泡剂0.17g/L，玉米浆干粉0.84g/L，谷氨酸钠0.63g/L，硫酸锰0.04g/L，氯化钴0.013g/L，酵母粉2.1g/L，pH＝7.10-7.20；

[0050] 所述的培养基F包括：硫酸铵3.4g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硫酸镁10.4g/L，硫酸亚铁1.12g/L，氯化钠2.1g/L，消泡剂0.13g/L，二水氯化钙0.06g/L，玉米浆7.5g/L，谷氨酸钠2.4g/L，硫酸锰0.05g/L，pH＝7.10-7.20；

[0051] 所述的补料1中的料1包括：玉米浆干粉6.21g/L，谷氨酸钠1.55g/L，硫酸铵1.55g/L，磷酸二氢钾0.62g/L，硫酸镁5.43g/L，硫酸亚铁0.47g/L，氯化钠1.24g/L，硫酸锰0.02g/L，氯化钙0.03g/L，消泡剂0.15g/L，pH＝7.10-7.20；

[0052] 所述的补料2中的料2包括：硫酸铵5.3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁23g/L，硫酸亚铁2.1g/L，氯化钠5.1g/L，消泡剂1g/L，二水氯化钙0.12g/L，玉米浆干粉1.0g/L，谷氨酸钠6.0g/L，硫酸锰0.12g/L，pH＝7.10-7.20。

[0053] 以上培养基的灭菌条件均为121℃灭菌30min；补糖灭菌条件：60％液糖使用115.5±0.5℃灭菌25min；液磷灭菌条件：0.08g/L磷酸二氢钾121±1℃灭菌30min。

[0054] 本发明还提供了一种高产辅酶Q10类球红细菌在发酵生产辅酶Q10中的应用；

[0055] 与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

[0056] 1、本发明以经过空间诱变筛选的菌株为基础，对其进行了常压室温等离子(ARTP)诱变，经多重抗性筛选、高通量筛选以及逐级放大验证筛选，得到了一种高产辅酶Q10类球红细菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.16625。该菌株，经20m3发酵生产验证，其平均效价可达2694μg/mL，出发菌菌株CF02的发酵水平提高了9.8％，辅酶Q10的产量显著提高，另外，该菌株还具有四重抗性，具有广阔的应用前景。

[0057] 2、本发明提供的诱变筛选方法，优化了ARTP诱变的条件，更适合类球红细菌的诱变，拓展了ARTP诱变育种范围；增加了多重抗性菌株的筛选，使菌株获得了多重抗性；采用了24孔深孔板、孔板离心及真空板过滤等装置，显著降低了筛选物料成本，提高工作效率和筛选通量；经摇瓶、2L四联罐、20m3发酵罐逐级放大验证对菌株进行复筛，全面系统的完成了菌株的筛选，得到的菌株遗传稳定性好，具有具有重要的经济价值和社会意义。

附图说明

[0058] 图1为实施例4中高通量筛选结果图；

[0059] 图2为实施例5中摇瓶发酵的发酵效价柱状图；

[0060] 图3为实施例5中2L四联罐和20m3发酵罐的发酵效价柱状图；

[0061] 图4为实施例5中突变菌株CPF和出发菌株CF02在20m3发酵罐中发酵过程的效价对比图。

具体实施方式

[0062] 以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。

[0063] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

[0064] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

[0065] 具体实施例中用到的培养基配方如下：

[0066] 培养基A：酵母粉5.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.5g/L，硫酸铵2.5g/L，谷氨酸钠1.0g/L，玉米浆干粉
2.5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15-20g/L，pH＝7.16。

[0067] 培养基B：不添加琼脂，其他与平板培养基配方一致。

[0068] 培养基C：玉米浆干粉2.0g/L，谷氨酸钠2.5g/L，硫酸铵3.0g/L，硫化钠1.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁5.0g/L，碳酸钙5.0g/L，葡萄糖20g/L，pH＝7.10-7.20。

[0069] 补料1中的料1：玉米浆干粉6.21g/L，谷氨酸钠1.55g/L，硫酸铵1.55g/L，磷酸二氢钾0.62g/L，硫酸镁5.43g/L，硫酸亚铁0.47g/L，氯化钠1.24g/L，硫酸锰0.02g/L，氯化钙0.03g/L，消泡剂0.15g/L，pH＝7.10-7.20。

[0070] 培养基D：葡萄糖4g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁1g/L，碳酸钙35g/L，消泡剂0.3g/L，玉米浆干粉0.5g/L，谷氨酸钠0.5g/L，硫酸锰0.03g/L，氯化钴0.001g/L，酵母粉1.0g/L，pH＝7.10-7.20。

[0071] 培养基E：葡萄糖12.6g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸氢二钾0.63g/L，磷酸二氢钾0.63g/L，硫酸镁2.9g/L，硫酸亚铁0.15g/L，消泡剂0.17g/L，玉米浆干粉0.84g/L，谷氨酸钠0.63g/L，硫酸锰0.04g/L，氯化钴0.013g/L，酵母粉2.1g/L，pH＝7.10-7.20。

[0072] 培养基F：硫酸铵3.4g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硫酸镁10.4g/L，硫酸亚铁1.12g/L，氯化钠2.1g/L，消泡剂0.13g/L，二水氯化钙0.06g/L，玉米浆7.5g/L，谷氨酸钠2.4g/L，硫酸锰0.05g/L，pH＝7.10-7.20。

[0073] 补料2中的料2：硫酸铵5.3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁23g/L，硫酸亚铁2.1g/L，氯化钠5.1g/L，消泡剂1g/L，二水氯化钙0.12g/L，玉米浆干粉1.0g/L，谷氨酸钠6.0g/L，硫酸锰0.12g/L，pH＝7.10-7.20。

[0074] 以上培养基的灭菌条件均为121℃灭菌30min。

[0075] 补糖灭菌条件：60％液糖使用115.5±0.5℃灭菌25min。

[0076] 液磷灭菌条件：0.08g/L磷酸二氢钾121±1℃灭菌30min。

[0077] 实施例1类球红细菌的ARTP诱变

[0078] (1)菌株种子菌悬液的制备：

[0079] 取-80℃甘油管保存的类球红细菌出发菌CF02(保藏编号为CGMCC NO.2458)菌液100μl，均匀涂布于培养基A上，32℃培养5d。待菌落长出后使用接种铲取6个单菌落，接种到含有培养基B的50mL/250mL种子瓶中，使用棉塞和2层纱布封口，32℃，220rpm培养24h，得到种子菌悬液。

[0080] (2)菌悬液载片的制备：

[0081] 在超净台内将金属载片 置于酒精灯外焰灼烧30s，待冷却后放入一次性培养皿或己灭菌的玻璃培养皿中。取上述培养好的种子菌悬液2mL，4000rpm离心2min，去上清，加入质量比为0.8％的生理盐水中混均，用稀释液稀释至OD600＝0.6-0.8(约8倍)，稀释液是体积比为5％的甘油和质量比为0.8％的生理盐水按照1:5的体积比混合而成，制成菌悬液。取10μl菌悬液分别均匀涂于6个载片上制备样品，注意使菌悬液在载片表面均匀铺开，每次做6个平行。

[0082] (3)菌悬液的诱变：

[0083] 将装有样品载片的培养皿移至ARTP诱变仪操作室，用无菌摄子将6个载片放入对应的孔位，关闭操作室门。设置诱变条件：诱变功率120W、诱变时间20s、诱变距离2mm、保护剂是体积百分浓度为5％的甘油。点击开始处理按钮，对CF02种子菌悬液的6个样品依次进行ARTP诱变。样品诱变完毕后，用无菌镊子将载片放入装有1mL0.8％生理盐水的1.5mL离心管中，涡旋振荡混均1-3min，把附着在载片上的菌液彻底洗脱至生理盐水中，得到诱变后的菌悬液。

[0084] 实施例2ARTP最佳诱变条件的筛选

[0085] 对诱变功率、诱变时间、诱变距离和保护剂浓度4个参数设计试验，以菌株致死率为指标确定ARTP诱变类球红细菌的最佳诱变条件。当致死率为85％-95％时，其诱变条件较佳，可进行下一步的筛选，致死率越接近90％，诱变条件越佳。

[0086] (1)不同诱变功率对致死率的影响：诱变时间为20s、诱变距离为2mm、保护剂是体积百分浓度为5％的甘油，分别在诱变功率为100W、110W、120W、130W、140W下进行诱变，结果见表1；

[0087] (2)不同诱变时间对致死率的影响：诱变功率为120W、诱变距离为2mm、保保护剂是体积百分浓度为5％的甘油，分别在诱变时间为10s、15s、20s、25s、30s下进行诱变，结果见表1；

[0088] (3)不同诱变距离对致死率的影响：诱变功率为120W、诱变时间为20s、保护剂是体积百分浓度为5％的甘油，分别在诱变距离为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm下进行诱变，结果见表1；

[0089] (4)不同保护剂浓度对致死率的影响：诱变功率为120W、诱变时间为20s、诱变距离为2mm，分别在保护剂是体积百分浓度为3％、5％、7％、10％、15％的甘油下进行诱变，结果见表1。

[0090] 表1：不同因素对致死率的影响

[0091]

[0092] 由表1可以看出，当诱变条件为：电源功率100-120W，诱变距离1-3mm，诱变时间20-30s，保护剂是体积百分浓度为5％-15％的甘油时，致死率为85％-95％，因此，该范围下的诱变条件较佳；

[0093] 当诱变功率为120W、诱变时间20s、诱变距离2mm、保护剂是体积百分浓度为5％的甘油时，类球红细菌的致死率为90.4％，表明此诱变条件最佳。

[0094] 实施例3多重抗性菌株的筛选

[0095] (1)不同抗性物质最佳抑制浓度的确定

[0096] 为了克服诱变选育的盲目性和不定向性，提高筛选效率，因此，通过抗性初筛去除大部分不符合生产性状的菌株。验证4大类共10种抗生素对出发菌株的抑制效果，确定不同抗生素的最小抑制浓度。

[0097] 所用抗生素为甲基萘醌、卡那霉素、罗红霉素、维生素K3、阿霉素、Na3N、Na2S、放线菌素D、苯甲酸、对羟基苯甲酸。

[0098] 以出发菌株CF02为试验对象，设定10种抗性物质的不同浓度梯度，待培养基A冷却至55-60℃时，分别将不同浓度的抗生素加入固体培养基中，混均，倒平板。抗性筛选物质不同浓度梯度设置见表2。取0.1mL稀释至10-6倍的种子液，涂于含有不同浓度的抗性物质平板上，每个浓度重复3次，以未加抗性物质的固体培养基作为对照，32℃培养5d，以没有长出菌落的最低浓度作为该抗性物质的最小抑制浓度。

[0099] 表2：抗性筛选物质不同浓度梯度

[0100]

[0101] 结果表明，甲基萘醌、卡那霉素和罗红霉素随溶剂浓度增加，出发菌株生长未受到影响，故后期试验不选用；最终确定其他几种抗生素的最小抑制浓度分别为：维生素K3为5mg/L、阿霉素56.6mg/L、Na3N 1.25mg/L、Na2S 566mg/L、放线菌素D 3.25mg/L、苯甲酸
250mg/L、对羟基苯甲酸150mg/L。

[0102] (2)多重抗性菌株的筛选

[0103] 取1mL诱变后获得的菌悬液于100mL/500mL种子液培养基中，32℃，220rpm复苏2h，稀释至OD600＝0.6-0.8后，取100μl稀释液首先涂布于含有辅酶Q10结构类似物(5mg/L维生素K3或55.6mg/L阿霉素)的筛选平板上，每种抗性物质做3个平行，32℃培养5d，通过菌落形态观察，从中挑取1颗墨绿色、饱满凸起、直径约2mm的菌落作为抗性菌株统称为R1。以R1为出发菌株诱变复苏后的菌悬液涂布于添加有呼吸链泛醌抑制剂(1.25mg/L Na3N或566mg/L Na2S)的筛选平板上，每种抗性物质重复3次，32℃培养5d，按相同方法筛选得到具有双重抗性的菌株统称为R2。按照相同方法以R2菌株为出发菌株诱变复苏后的菌悬液涂布于添加有细胞毒性物质(3.25mg/L放线菌素D)的筛选平板上，重复做3个平行，32℃培养5d，筛得3重抗性菌株统称为R3。再以R3为出发菌株诱变复苏后的菌悬液涂布于添加有辅酶Q10前体类似物(250mg/L苯甲酸、150mg/L对羟基苯甲酸)的筛选平板上，每种抗性物质做3个平行，32℃培养5d，筛得四重抗性菌株统称为R4。

[0104] (3)抗性初筛菌株的保藏

[0105] 以筛选的4重抗性菌株为主，包括其他阶段筛选的较优菌株单菌落于50mL/250mL种子液培养基中，32℃，220rpm培养24h，按种子液:50％甘油管＝1:1的体积比，存放于-80℃冰箱进行低温保存。

[0106] 得到的四重抗性菌株R4包括以下命名的菌株：

[0107] CF02-AF3-1，CF02-AF3-19，CF02-AF3-33，CF02-AF3-60，CF02-AF3-66，CF02-AF3-85，CF02-AF3-103，CF02-AF3-110，CF02-AF3-119，CF02-AF3-126，CF02-AF3-128，CF02-AF3-
154，CF02-AF3-157，CF02-AF3-169，CF02-AF3-171，CF02-AF3-176，CF02-AF3-189，CF02-AF3-195，CF02-AF3-198，CF02-AF3-199，CF02-AF3-201，CF02-AF3-202，CF02-AF3-230，CF02-AF3-251，CF02-AF3-253，CF02-AF3-266，CF02-AF3-269，CF02-AF3-272，CF02-AF3-
289，CF02-AF3-292，CF02-AF3-293，CF02-AF3-303，CF02-AF3-312，CF02-AF3-313，CF02-AF3-315，CF02-AF3-320，CF02-AF3-346，CF02-AF3-389，CF02-AF3-394，CF02-AF3-401，CF02-AF3-403，CF02-AF3-407，CF02-AF3-429，CF02-AF3-436，CF02-AF3-457，CF02-AF3-
513，CF02-AF3-531，CF02-AF3-537，CF02-AF3-538，CF02-AF3-543，CF02-AF3-544，CF02-AF3-562，CF02-AF3-587，CF02-AF3-597，CF02-AF3-609，CF02-AF3-610，CF02-AF3-629，CF02-AF3-635，CF02-AF3-637，CF02-AF3-639，CF02-AF3-645，CF02-AF3-658，CF02-AF3-
661，CF02-AF3-662，CF02-AF3-668，CF02-AF3-674，CF02-AF3-685，CF02-AF3-702，CF02-AF3-707，CF02-AF3-708，CF02-AF3-718，CF02-AF3-751，CF02-AF3-752，CF02-AF3-770，CF02-AF3-793，CF02-AF3-801，CF02-AF3-802，CF02-AF3-822，CF02-AF3-840，CF02-AF3-
848，CF02-AF3-853，CF02-AF3-864，CF02-AF3-865，CF02-AF3-877，CF02-AF3-882，CF02-AF3-894，CF02-AF3-917，CF02-AF3-937

[0108] 实施例4突变菌株的高通量筛选

[0109] (1)深孔板发酵培养

[0110] 将实施例3得到的有四重抗性的突变菌株R4接种于含有培养基B的深孔板中，220rmp，32℃培养24h得到种子液；取种子液到含有2.7mL培养基C的24孔深孔板中，32℃培养72h，每个突变菌株做3个平行，以出发菌株CF02为对照，接种量为2％、装液系数为70％、摇床转速为220rpm。

[0111] (2)发酵液的处理

[0112] 将上述培养好的突变株发酵液经孔板离心机，4500rmp离心10min，去除发酵液中的水相。取300μl上清液，经真空孔板过滤器(0.45μm滤膜)过滤，每个样品过滤三次，最终获得1mL滤液，将其移入15mL灭菌干燥的离心管，向管内加入30％过氧化氢0.1mL和0.1M盐酸0.1mL，用乙醇定容至10mL。吸液时，冲洗孔内壁的挂壁菌丝，反复吹打，混匀发酵液。移液时，反复吹打，将枪头内挂壁发酵液转到离心管中。拧紧离心管盖，颠倒混匀后，放入超声波清洗器中，保证离心管外水位没过管内乙醇液位，超声1h。从超声波清洗器中取出离心管，颠倒混匀，静置约15min，取上层样品液3mL，一一对应的加入96孔过滤器中，滤液经0.45μm有机相过滤膜过滤后吸取滤液1mL于液相进样瓶中，用液相检测辅酶Q10的含量，即发酵效价，以出发菌株CF02为对照，计算辅酶Q10的相对产率，筛选辅酶Q10相对产率在6.4％以上的菌株作为高通量筛选菌。

[0113] (3)高效液相色谱测定发酵效价

[0114] 液相检测条件：流动相配制方法为将350mL无水乙醇与650mL甲醇混均装于流动相瓶内，超声20min排气泡。工作条件为HPLC选择紫外检测器(波长＝275nm)检测，进样量10μl，4.6mm*150mm C18反向柱，柱温32℃，1mL/min的流速进行检测，运行时间约20min。检测结果见图1。

[0115] 由图1可知，筛选到了菌株CF02-AF3-303、CF02-AF3-315、CF02-AF3-394、CF02-AF3-407、CF02-AF3-429、CF02-AF3-436、CF02-AF3-531、CF02-AF3-544、CF02-AF3-587和CF02-AF3-674共10株具有四重抗性的突变菌株，作为高通量筛选菌，其相对产率较高，在6.4％以上，其中菌株CF02-AF3-674的相对产率最大，达到了15.80％。

[0116] 实施例5突变株的逐级放大验证筛选

[0117] (1)摇瓶筛选

[0118] 取实施例4得到的高通量筛选菌经培养基A平板32℃培养24h，接种到含有培养基B中32℃，220rpm培养24h，得到种子液，取5mL种子液于装有60mL发酵培养基C的500mL三角瓶中，用8层纱布封口，每个样品的种子液接种3个平行发酵瓶，32℃，220rpm培养3d后，取样进行液相检测，统计分析，筛选出发酵效价在528μg/mL以上的菌株，记为菌株A，用于后续扩大发酵试验。结果见图2。

[0119] (2)2L四联罐发酵

[0120] 将摇瓶筛选得到的菌株A经培养基A平板32℃培养24h，接种到含有培养基B中32℃，220rpm培养24h，得到种子液；照60％发酵装料系数配置发酵液，121℃灭菌30min；待罐温下降至34℃后，接种10％的种子液，32℃培养90h，所用培养基为培养基C，期间加入补料1补料3次。消后和0h(种后)取样检测pH、OD、湿菌体含量、溶解磷含量、单糖含量；从0h开始每4h取样检测各项指标及镜检；取样进行液相检测发酵效价，筛选出发酵效价在2010μg/mL以上的菌株，记为菌株B；结果见图3。发酵过程工艺参数控制见表2。

[0121] 表2：2L四联罐发酵工艺参数控制

[0122]

[0123] (3)20m3发酵罐培养

[0124] 将2L四联罐发酵得到的菌株B经培养基A平板32℃培养24h，接种到含有培养基B中32℃，220rpm培养24h，转移至含有培养基D的一级种子罐中32℃，220rpm培养24h，在转移至含有培养基E的二级种子罐中32℃，220rpm培养16h，得到菌液；将菌液移种至20m3发酵罐，所用培养基为培养基F，期间加入补料2补料3次，培养90h。发酵罐主料用纯化水溶解，搅拌均匀定容至6600L灭菌后用氨水调pH至6.6±0.05，接种量为2000L，接种后体积约为10m3。

[0125] 发酵后每隔4h检测一次pH、OD600、糖、湿菌体、磷，40h后每8h检测一次效价，结果见图3和图4。发酵过程工艺参数控制见表3。

[0126] 表3：20m3发酵罐工艺参数控制

[0127]

[0128] 由图2可以看出，经过摇瓶培养初筛，从高通量筛选获得的10株突变菌中筛选到了CF02-AF3-544和CF02-AF3-674两株发酵效价较高的突变菌株，其发酵效价在528.1μg/mL以上，将其用于后续的扩大发酵试验。

[0129] 由图3和图4可知，经过2L四联罐发酵和20m3发酵罐发酵培养，CF02-AF3-544和CF02-AF3-674两株突变菌的发酵效价明显高于原出发菌CF02，其中CF02-AF3-674在20m3发酵罐发酵培养之后的发酵效价最大，即辅酶Q10的含量最大，达到了2694μg/mL，比出发菌株CF02的发酵水平提高了9.8％。

[0130] 将CF02-AF3-674类球红细菌突变菌株命名为CPF，已于2018年10月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：10010，保藏编号为CGMCC No.16625。

[0131] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。