一种纳米复合材料及制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种纳米复合材料及制备方法和应用。纳米复合材料包括磁性介孔纳米粒子以及修饰在磁性介孔纳米粒子表面的氧化铈纳米粒子；所述磁性介孔纳米粒子具有核壳结构，内核为氧化铁纳米粒子，壳为介孔氧化硅。纳米复合材料可以表面修饰抗体，实现特异性靶向磷酸化Tau蛋白并诱导细胞自噬清除。

权利要求

1.一种负载有抗体的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括纳米复合材料以及修饰在纳米复合材料表面的抗体；纳米复合材料包括磁性介孔纳米粒子以及修饰在磁性介孔纳米粒子表面的氧化铈纳米粒子；所述磁性介孔纳米粒子具有核壳结构，内核为氧化铁纳米粒子，壳为介孔氧化硅；

制备方法包括：

1）将十六烷基三甲基溴化铵与氧化铁纳米粒子加入至水中反应，得到十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子；

2）将十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子与氨水加入至水中，升温至60-80 ℃，依次加入硅酸四乙酯和乙酸乙酯进行反应，得到磁性介孔纳米粒子；采用3-氨丙基三乙氧基硅烷进行表面改性，得到氨基化的磁性介孔纳米粒子；

3）合成油胺包覆的氧化铈纳米粒子，利用2-溴代异丁酸进行配体交换，得到配体交换的氧化铈纳米粒子；

4）氨基化的磁性介孔纳米粒子与配体交换的氧化铈纳米粒子反应得到纳米复合材料；

5）纳米复合材料采用COOH-PEG-NH2进行表面修饰，得到末端为羧基的PEG化纳米复合材料，活化后与抗体反应，即得负载有抗体的纳米复合材料。

2.根据权利要求1所述的负载有抗体的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述氧化铁纳米粒子的粒径为10-20 nm；所述磁性介孔纳米粒子的粒径为50-100 nm；所述氧化铈纳米粒子的粒径为1-10 nm。

3.根据权利要求1所述的负载有抗体的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述氨基化的磁性介孔纳米粒子与配体交换的氧化铈纳米粒子的质量比为2-2.5:1。

4.根据权利要求1所述的负载有抗体的纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述抗体选自Anti-AT8抗体、Anti-PHF-1抗体或Anti-Tau抗体。

5.如权利要求1或4所述的制备方法制备得到的负载有抗体的纳米复合材料在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。

6.如权利要求1或4所述的制备方法制备得到的负载有抗体的纳米复合材料在制备核磁共振造 影剂中的应用。

说明书

一种纳米复合材料及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及无机纳米材料的组装制备，具体涉及一种纳米复合材料及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病，临床上表现为记忆障碍、失语、思维方式及脑部功能改变等。如今，每三秒钟世界上将新增一名AD患者。预计到2050年，全球AD患者将会达到1亿3500万，并会带来数以亿计的经济损失。毫无疑问，AD给社会和家庭带来的沉重负担，已成为社会关注的焦点。

[0003] 目前，仅有5种抗AD药物被FDA批准上市。然而，这些药物只能暂时缓解AD的症状，无法有效地从根本上缓解或逆转AD的病理进展。科学家们对AD发病机制的探索已有一百多年的历史，其中淀粉样β蛋白(Aβ)级联假说和Tau蛋白神经纤维缠结假说占主导地位。

[0004] 针对上述两种假说，人们设计制备了多种AD治疗药物。其中以Aβ为靶点的抗AD药物虽能够有效的抑制Aβ的产生或聚集，但无法有效地改善动物的认知水平。相比于Aβ，Tau蛋白病变与脑部认知损伤的关系更为密切，因而Tau蛋白或许是AD治疗的优先靶点。然而，目前，针对Tau蛋白所设计的药物多以抑制其磷酸化或聚集为主，无法同时清除脑部已形成的Tau蛋白纤维丝。

[0005] 研究发现，自噬与神经退行性疾病有着密切的联系。易引起神经退行性疾病的大多数相关蛋白已被证实为自噬基质，包括突变的亨廷顿蛋白、α-突触核蛋白和tau蛋白。自噬的诱导能够降低AD动物模型中可溶性聚合物的水平，并可产生有益于疾病治疗的效果。因而，在神经退行性疾病的治疗中，自噬相比于其他治疗策略显得更有前景。已有研究表明，小分子药物如雷帕霉素等能够有效地诱导自噬并清除聚集Tau蛋白，对于AD的治疗有一定的积极作用，但缺乏精准的靶向作用。因而，利用自噬途径有效地靶向清除与认知行为密切相关的Tau蛋白神经纤维缠结对于AD治疗的至关重要。

[0006] 由于同时具有靶向性及自噬诱导能力的药物难以在同一体系实现，目前上述策略至今未被报道。近些年，纳米技术得到迅速发展。其中，无机纳米粒子由于其具有较好的稳定性、易修饰性及独特的光、电、磁等特殊性能，被广泛应用于生物医药领域。因此，将纳米载体与特异靶向AD病理靶点的生物药物整合于一体，激活异常蛋白的自我清除能力将是未来AD诊疗的研究趋势。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种纳米复合材料，可以表面修饰抗体，实现特异性靶向磷酸化Tau蛋白并诱导细胞自噬清除。

[0008] 本发明所提供的技术方案为：

[0009] 一种纳米复合材料，包括磁性介孔纳米粒子以及修饰在磁性介孔纳米粒子表面的氧化铈纳米粒子；所述磁性介孔纳米粒子具有核壳结构，内核为氧化铁纳米粒子，壳为介孔氧化硅。

[0010] 本发明中的纳米复合材料可以表面修饰抗体，表面修饰的抗体能够特异性识别并结合具有神经毒性的Tau蛋白纤维丝，使Tau蛋白纤维丝附着在纳米复合材料表面。同时，纳米复合材料中的氧化铈纳米粒子能够高效地诱导细胞自噬，实现靶向清除Tau蛋白纤维丝的治疗效果。

[0011] 本发明中所述氧化铁纳米粒子的粒径为10-20nm。作为优选，所述氧化铁纳米粒子的粒径为15-17nm。氧化铁纳米粒子为纳米复合材料提供磁性。

[0012] 本发明中所述磁性介孔纳米粒子的粒径为50-100nm。磁性介孔纳米粒子具有核壳结构，内核为一个氧化铁纳米粒子，壳为介孔氧化硅。作为优选，所述磁性介孔氧化硅纳米粒子的粒径为50-70nm。

[0013] 本发明中所述氧化铈纳米粒子的粒径为1-10nm。氧化铈纳米粒子能够提高细胞的自噬水平，从而降解大脑中聚集的神经毒性蛋白。

[0014] 本发明还提供一种如上述的纳米复合材料的制备方法，包括：

[0015] 1)将十六烷基三甲基溴化铵与氧化铁纳米粒子加入至水中反应，得到十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子；

[0016] 2)将十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子与氨水加入至水中，升温至60-80℃，依次加入硅酸四乙酯和乙酸乙酯进行反应，得到磁性介孔纳米粒子；采用3-氨丙基三乙氧基硅烷进行表面改性，得到氨基化的磁性介孔纳米粒子；

[0017] 3)合成油胺包覆的氧化铈纳米粒子，利用2-溴代异丁酸进行配体交换，得到配体交换的氧化铈纳米粒子；

[0018] 4)氨基化的磁性介孔纳米粒子与配体交换的氧化铈纳米粒子反应得到纳米复合材料。

[0019] 所述步骤1)中氧化铁纳米粒子的制备方法：将油酸铁和油酸加入至二十烷中加热反应，得到氧化铁纳米粒子。由于产物表面包覆有油酸，因此采用十六烷基三甲基溴化铵与其反应，使其油相转水相。作为优选，所述油酸铁、油酸和二十烷的质量比为6-7:1:35-40。作为优选，将油酸铁和油酸加入至二十烷中，在340-360℃下反应25-30min，冷却、沉淀、洗涤，得到油酸包覆的氧化铁纳米粒子并分散于氯仿中。

[0020] 作为优选，所述步骤1)中十六烷基三甲基溴化铵与氧化铁纳米粒子的质量比为1：40-60。

[0021] 作为优选，所述步骤1)中将溶于氯仿中的氧化铁纳米粒子与十六烷基三甲基溴化铵加入至去离子水中，超声0.5-2h后，在50-70℃下剧烈搅拌出去残余的氯仿，最终得到水溶性的氧化铁纳米粒子，即为十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子。

[0022] 作为优选，所述步骤2)中表面改性包括：将磁性介孔纳米粒子和3-氨丙基三乙氧基硅烷加入至无水乙醇中，在60-65℃下反应3-4h，得到氨基化的磁性介孔纳米粒子。

[0023] 作为优选，所述步骤2)中十六烷基三甲基溴化铵包覆氧化铁纳米粒子、硅酸四乙酯、乙酸乙酯、氨水的投料比为：3-5mg：0.3-0.5mL：3-3.5mL：0.2-0.3mL。

[0024] 作为优选，所述步骤3)中合成油胺包覆的氧化铈纳米粒子包括：将醋酸铈水合物和油胺加入到二甲苯中，常温搅拌形成络合物，随后在惰性气体保护下，85-95℃下反应3-6h，冷却、沉淀、洗涤，得到氧化铈纳米粒子。作为优选，醋酸铈水合物与油胺的质量比为1：
7-8。

[0025] 作为优选，所述步骤3)中配体交换包括：将得到的氧化铈纳米粒子、2-溴代异丁酸和柠檬酸依次加入到氯仿和N-N二甲基甲酰胺的混合溶剂中搅拌1-24h。配体交换是为了将氧化铈纳米粒子以稳定的共价键的形式接到磁性介孔纳米粒子表面和为之后PEG的修饰提供溴基。

[0026] 作为优选，所述步骤4)中将氨基化的磁性介孔纳米粒子、配体交换的氧化铈纳米粒子和戊二酸酐加入至N,N-二甲基甲酰胺反应3-20h，即可得到纳米复合材料。作为优选，所述氨基化的磁性介孔纳米粒子与配体交换的氧化铈纳米粒子的质量比为2-2.5:1。

[0027] 本发明还提供一种负载有抗体的纳米复合材料，包括如上述的纳米复合材料以及修饰在纳米复合材料表面的抗体。纳米复合材料由于经过2-溴代异丁酸的配体交换，表面具有溴基，然后与COOH-PEG-NH2反应表面接上了羧基，活化后即可以与抗体进行偶联。

[0028] 作为优选，所述抗体选自Anti-AT8抗体、Anti-PHF-1抗体或Anti-Tau抗体。抗体可以选择已知的抗体，优选为抗AT8抗体，其特异性靶向Tau蛋白磷酸化位点Ser202和Thr205。

[0029] 本发明还提供一种如上述的负载有抗体的纳米复合材料的制备方法，包括：

[0030] 1)将十六烷基三甲基溴化铵与氧化铁纳米粒子加入至水中反应，得到十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子；

[0031] 2)将十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子与氨水加入至水中，升温至60-80℃，依次加入硅酸四乙酯和乙酸乙酯进行反应，得到磁性介孔纳米粒子；采用3-氨丙基三乙氧基硅烷进行表面改性，得到氨基化的磁性介孔纳米粒子；

[0032] 3)合成油胺包覆的氧化铈纳米粒子，利用2-溴代异丁酸进行配体交换，得到配体交换的氧化铈纳米粒子；

[0033] 4)氨基化的磁性介孔纳米粒子与配体交换的氧化铈纳米粒子反应得到纳米复合材料；

[0034] 5)纳米复合材料采用COOH-PEG-NH2进行表面修饰，得到末端为羧基的PEG化纳米复合材料，活化后与抗体反应，即得负载有抗体的纳米复合材料。

[0035] 作为优选，所述步骤5)中采用COOH-PEG-NH2进行表面修饰包括：将纳米复合材料与COOH-PEG-NH2加入至N,N-二甲基甲酰胺，搅拌12-24h，得到末端为羧基的PEG化纳米复合材料。进行PEG修饰一方面是为了提高纳米复合材料的稳定性及分散性，另一方面为之后的抗体偶联提供羧基。纳米复合材料与COOH-PEG-NH2的质量比为3：40-60。进一步优选为3：45-55。

[0036] 作为优选，所述步骤5)中活化包括：将末端为羧基的PEG化纳米复合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺加入至吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，在室温条件下搅拌1-2h，停止反应，离心洗涤后得到羧基活化的纳米复合材料。末端为羧基的PEG化纳米复合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：10-15：8-10。

[0037] 作为优选，所述步骤5)中与抗体反应包括：将所得的羧基活化的纳米复合材料溶于吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，加入抗体，在室温条件下搅拌30-60min，3-5℃冷冻过夜孵育，停止反应，离心、洗涤，得到负载有抗体的纳米复合材料。作为优选，所述纳米复合材料与抗体的质量比为800-1000。

[0038] 本发明还提供一种如上述的负载有抗体的纳米复合材料在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。

[0039] 本发明还提供一种如上述的负载有抗体的纳米复合材料在制备核磁共振对影剂中的应用。

[0040] 同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

[0041] (1)本发明中的纳米复合材料可以表面修饰抗体，表面修饰的抗体能够特异性识别并结合具有神经毒性的Tau蛋白纤维丝，使Tau蛋白纤维丝附着在纳米复合材料表面。同时，纳米复合材料中的氧化铈纳米粒子能够高效地诱导细胞自噬，实现靶向清除Tau蛋白纤维丝的治疗效果。

[0042] (2)本发明中的纳米复合材料具有核磁共振对影剂的功能，可实现治疗的实时监测。

[0043] (3)本发明所提供的制备方法的反应条件温和可控，产物尺寸均一，形貌良好；由于所选取的无机纳米粒子及抗体本身无毒或低毒，所制备的纳米复合材料具有良好的生物相容性。

附图说明

[0044] 图1为实施例1中制备的氧化铁纳米粒子的TEM照片；

[0045] 图2为实施例2中制备的氨基化磁性介孔纳米粒子的TEM照片；

[0046] 图3为实施例3中制备的配体交换的氧化铈纳米粒子的TEM照片；

[0047] 图4为实施例5中制备的负载有抗体的纳米复合材料的TEM照片；

[0048] 图5为不同浓度的负载有抗体的纳米复合材料对SH-SY5Y细胞生物相容性的CCK-8细胞活性定量分析结果图；

[0049] 图6为不同浓度的负载有抗体的纳米复合材料的T1/T2加权像图和纵向/横向弛豫率图；

[0050] 图7为负载有抗体的纳米复合材料诱导SH-SY5Y细胞自噬的生物TEM照片。

具体实施方式

[0051] 下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。

[0052] 实施例1：氧化铁纳米粒子的制备及转相

[0053] 将0.9g油酸铁、0.14g油酸和5.0g二十烷加入至100mL三颈烧瓶中，在80℃下脱气2h后，通入氩气，以3.3℃/min的恒定加热速率从80℃加热到350℃，反应30min，终止反应，用石油醚将含有纳米颗粒的反应溶液迅速冷却至室温，丙酮沉淀，乙醇洗涤三次，得到油酸包覆的氧化铁纳米粒子，最终产物分散于10mL三氯甲烷中。

[0054] 将合成得到的含有5mg氧化铁纳米粒子的300μL三氯甲烷和十六烷基三甲基溴化铵0.1mg加入至5mL去离子水中，超声1-2h，在60℃下保温10min除去残余的氯仿，得到十六烷基三甲基溴化铵包覆的氧化铁纳米粒子，即为水溶性的氧化铁纳米粒子。

[0055] 对氧化铁纳米粒子用透射电镜进行形貌表征，如图1所示，粒径约为15nm。

[0056] 实施例2：氨基化磁性介孔氧化硅纳米粒子的制备

[0057] 将上述合成得到的水溶性氧化铁纳米粒子5mg和氨水0.2ml(2M)加入至45mL去离子水中，机械搅拌混匀，将温度升至70℃后依次加入硅酸四乙酯0.5mL和乙酸乙酯3mL，反应3h，停止反应，冷却至室温。无水乙醇离心，洗涤三次，用氯化钠甲醇溶液再次洗涤产物，去除多余的十六烷基三甲基溴化铵，得到磁性介孔纳米粒子，最终产物分散于10mL无水乙醇中。

[0058] 将所合成的磁性介孔纳米粒子5mL和3-氨丙基三乙氧基硅烷200μL加入至45mL无水乙醇中，在65℃下反应4h，离心，无水乙醇洗涤3次，得到氨基化的磁性介孔纳米粒子，将最终产物分在至4mL N,N-二甲基甲酰胺中。

[0059] 对氨基化磁性介孔纳米粒子用透射电镜进行形貌表征，如图2所示，粒径约为65nm。

[0060] 实施例3：氧化铈纳米粒子的制备及配体交换

[0061] 将0.43g醋酸铈水合物和3.25g油胺加入到15mL二甲苯中，室温搅拌12h，以形成络合物；以3.3℃/min的升温速度升至90℃；将1mL去离子水注射到惰性气体保护反应体系中，保温3h，丙酮沉淀，离心得到氧化铈纳米粒子分散于10mL氯仿中。

[0062] 将合成得到的氧化铈纳米粒子1mL、2-溴代异丁酸0.55g和柠檬酸0.055g依次加入到6.5mL氯仿和7.5mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，搅拌1.5h，停止反应，无水乙醚沉淀离心，得到配体交换的氧化铈纳米粒子，最终产物分散于5ml N,N-二甲基甲酰胺中。

[0063] 对配体交换的氧化铈纳米粒子用透射电镜进行形貌表征，如图3所示，粒径约为3nm。

[0064] 实施例4：PEG修饰的磁性介孔纳米复合材料的制备

[0065] 将2mL浓度为0.75mg/mL的氨基化的磁性介孔纳米粒子、0.5mL浓度为1.5mg/mL的配体交换氧化铈纳米粒子及50mg戊二酸酐加入至10mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温机械搅拌3-12h，停止反应，离心、去离子水洗涤3次，得到纳米复合材料，将最终产物分散于5ml N,N-二甲基甲酰胺中。

[0066] 将3mg纳米复合材料和50mg的COOH-PEG-NH2加入至5mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌12-24h，停止反应，离心、去离子水洗涤三次，将最终产物分散于去离子水中，得到末端为羧基的PEG化纳米复合材料。

[0067] 实施例5：负载有抗体的纳米复合材料的制备

[0068] 将3mg末端为羧基的PEG化纳米复合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐45mg和N-羟基琥珀酰亚胺30mg溶于5mL吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，在室温条件下搅拌1-2h，停止反应，离心、去离子水洗涤三次去除多余的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到羧基活化的磁性介孔纳米复合材料。

[0069] 将所得的羧基活化的磁性介孔纳米复合材料溶于1mL吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，加入20μL浓度为0.2mg/mL Anti-AT8抗体(赛默飞世尔，MN1020，鼠源，批次号：
TI2611431)，在室温条件下搅拌30-60min，移至4℃冰箱过夜孵育，停止反应，离心、去离子水洗涤三次，得到负载有抗体的纳米复合材料，将最终产物分散于去离子水中。

[0070] 对负载有抗体的纳米复合材料用透射电镜进行形貌表征，如图4所示，粒径约为70nm。

[0071] 实施例6：负载有抗体的纳米复合材料的制备

[0072] 将3mg末端为羧基的PEG化纳米复合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐45mg和N-羟基琥珀酰亚胺30mg溶于5mL吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，在室温条件下搅拌1-2h，停止反应，离心、去离子水洗涤三次去除多余的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到羧基活化的磁性介孔纳米复合材料。

[0073] 将所得的羧基活化的磁性介孔纳米复合材料溶于1mL吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，加入10μL浓度为0.2mg/mL Anti-AT8抗体(赛默飞世尔，MN1020，鼠源，批次号：
TI2611431)，在室温条件下搅拌30-60min，移至4℃冰箱过夜孵育，停止反应，离心、去离子水洗涤三次，得到负载有抗体的纳米复合材料，将最终产物分散于去离子水中。

[0074] 实施例7：负载有抗体的纳米复合材料的制备

[0075] 将3mg末端为羧基的PEG化纳米复合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐45mg和N-羟基琥珀酰亚胺30mg溶于5mL吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，在室温条件下搅拌1-2h，停止反应，离心、去离子水洗涤三次去除多余的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到羧基活化的磁性介孔纳米复合材料。

[0076] 将所得的羧基活化的磁性介孔纳米复合材料溶于1mL吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0-6.0)中，加入20μL浓度为0.2mg/mL Anti-PHF-1抗体(Abcam，兔源，克隆编号：
EPR14222，批次号：ab184951)，在室温条件下搅拌30-60min，移至4℃冰箱过夜孵育，停止反应，离心、去离子水洗涤三次，得到负载有抗体的纳米复合材料，将最终产物分散于去离子水中。

[0077] 性能试验

[0078] (1)体外生物相容性评价

[0079] 不同浓度的负载有抗体的纳米复合材料的制备：选用实施例5制备得到的10mg产物用不同体积的灭菌PBS溶液分散成不同浓度，分别为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、100μg/ml和200μg/ml。

[0080] 选择人骨髓神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)考察不同浓度的负载有抗体的纳米复合材料的体外生物相容性。

[0081] CCK-8细胞活性定量分析结果如图5所示，Control组表示只用细胞培养液进行孵育，不同药物浓度组细胞成活率均在90％以上，表明负载有抗体的纳米复合材料具有良好的体外生物相容性。

[0082] (2)负载有抗体的纳米复合材料的弛豫率测定

[0083] 不同浓度的负载有抗体的纳米复合材料的制备：选用实施例5制备得到的10mg产物用不同体积的灭菌PBS溶液分散到不同浓度，最终得到的浓度为0.5mM、0.25mM、0.125mM、0.0625mM、0.0325mM的两组溶液。

[0084] 负载有抗体的纳米复合材料的弛豫率测定结果如图6所示，r2/r1的值为147.6，说明其T2造影效果好。

[0085] (3)负载有抗体的纳米复合材料提升细胞自噬水平

[0086] 细胞模型建立：将SH-SY5Y细胞预先和冈田酸(okadaic acid，OA)共同孵育12h。

[0087] 实验组：OA预处理的细胞给予负载有抗体的纳米复合材料(实施例5制备)。

[0088] 对照组：OA预处理的细胞给予等体积的新鲜细胞培养液。

[0089] 24小时后，将细胞离心、洗涤、戊二醛固定后制备生物电镜样品，对其用透射电镜表征，如图7所示，负载有抗体的纳米复合材料组(p-Tau TNC)相比于对照组(OA)，自噬泡明显增多，证明其具有提升细胞自噬水平的作用。

[0090] 以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。