一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法

摘要

本发明公开了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，具体为：先设计p73基因位点特异性sgRNA序列，克隆进质粒PX459；整合p73基因同源重组序列以及绿色荧光蛋白DNA片段(EGFP)，将上述质粒和整合片段共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；筛选的EGFP表达细胞系通过PCR鉴定及免疫印迹验证阳性p73报告基因细胞系。该大肠癌细胞系p73基因和EGFP共同表达，其EGFP表达水平和p73基因具有高度一致性，故通过检测EGFP表达水平变化可以准确判断p73基因表达水平。本发明建立细胞系方法简单、易行、高效和精准定位基因位点。

权利要求

1.一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：步骤1：p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估；

步骤2：构建pX459/p73-sgRNA质粒；

步骤3：整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段；

步骤4：将上述质粒pX459/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；

步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；

步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73报告基因细胞系；

其中，所述步骤1中，设计并筛选出p73-sgRNA序列，所述p73-sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述步骤2中，构建pX459/p73-sgRNA质粒的方法如下：根据所述p73-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/p73-sgRNA；步骤3中，整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据p73基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R；所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法制备获得的细胞系。

3.权利要求2所述的细胞系在下述(1)-(4)中任一的应用：(1)在肿瘤细胞发生、发展或能量代谢研究中的应用；

(2)在细胞模型中的应用

(3)在研究p73基因中的应用；或

(4)在药物筛选中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述肿瘤为大肠癌；所述细胞模型为肿瘤细胞模型；所述药物为抗癌药物。

5.根据权利要求3或4所述的应用，所述细胞模型为大肠癌细胞模型。

说明书

一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大肠癌p73报告基因细胞系及其建立方法。

背景技术

[0002] 报告基因是分子生物学研究领域中一种重要的工具，经常被用做标记所要研究的目标基因，使得报告基因的表达水平与目标基因的表达水平相一致，从而可以通过对报告基因的表达来观察目标基因的表达调控。报告基因具有便捷、可靠、灵敏度高和高通量检测等优点。目前常用到的报告基因有β-半乳糖苷酶、荧光素酶和荧光蛋白等。作为无毒无害的检测工具，荧光素酶和荧光蛋白在检测细胞基因表达方面占据着主导地位。

[0003] CRISPR-Cas是一种细菌及古细菌的成簇规律间隔短回文重复序列组成的适应性免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵。Cas蛋白有若干种，具有内切核酸酶活性。CRISPR-Cas系统拥有三种类别，其中CRISPR-Cas9是目前研究最深入、应用最成熟的一种类别；其具有操作简便，作用位点选择灵活性强，活性高等优势。在人为设计的sgRNA的指导下，表达的具有核酸内切酶活性的Cas蛋白会向基因靶点位置移动，最终结合于基因靶点处发挥作用，当细胞基因组完整性被Cas蛋白酶破坏，细胞自身的自我修复系统便会被激活，在带有基因组同源片段的外源目标基因存在的情况下，细胞则会以一定概率的同源重组方式对自身基因组进行修复，从而实现外源基因的插入。

[0004] p73基因(Homo sapiens tumor protein p73，TP73，GenBank ID：NG_017035.2)是p53转录因子家族的一员，p53基因家族还包括p53基因和p63基因。p73基因是Kaghad等研究者于1997年筛选胰岛素介导的细胞信号转导因子时，在用对应IRS-1连接区的简并寡核苷酸探针对COS细胞的cDNA文库进行杂交筛选，偶然发现了1个假阳性的cDNA克隆，序列与p53基因有高度的同源性(Nature，1997.389:191-194.)。p73基因与p53基因所编码的蛋白质结构与功能上差异不大，p73基因能以P53基因同样的方式激活p53的靶基因、诱导细胞凋亡并抑制细胞生长(Clinical Cancer Research，2002.8(1)：165-170.)。许多研究者均提示p73基因可能通过其静止基因的激活或过度表达参与部分肿瘤的形成(Cell Biology，2007.178:283-296.)。近年来相关研究表明，p73基因表达水平相关于肿瘤分化，癌细胞分化越低，该基因的表达越高(Molecular Cancer Research，2016.14(1)：56-65.)。综上所述，p73基因的检测对肿瘤的诊断、分期及预后判断有重要的参考意义。

[0005] 本研究关于大肠癌p73报告基因领域，利用CRISPR-Cas9技术构建了带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的大肠癌p73报告基因的细胞系，为p73基因及其信号通路的研究、相关疾病致病机理的研究、药物筛选与评价工作提供了有利工具。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一在于提供一种大肠癌p73报告基因细胞系，其特征在于，所述细胞系的p73基因与下游报告基因通过2A肽连接实现共表达。

[0007] 优选地，所述大肠癌细胞为HCT116、Caco-2、SW480、SW620、LOVO、HT29或DLD-1，进一步优选为HCT116。

[0008] 优选地，所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。

[0009] 本发明的目的之二在于提供了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：

[0010] 步骤1：p73基因下游位点特异性p73-sgRNA序列设计及评估；

[0011] 步骤2：构建pX459/p73-sgRNA质粒；

[0012] 步骤3：整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段；

[0013] 步骤4：将上述质粒pX459/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；

[0014] 步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；

[0015] 步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73报告基因细胞系。

[0016] 优选地，步骤1中，设计并筛选出p73-sgRNA序列，所述p73-sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

[0017] 优选地，步骤2中，构建pX459/p73-sgRNA质粒的方法如下：根据所述p73-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/p73-sgRNA。

[0018] 优选地，步骤3中，整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据p73基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R。

[0019] 优选地，所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.2所示。

[0020] 本发明的目的之三在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在肿瘤细胞发生、发展或能量代谢研究中的应用。

[0021] 优选地，所述肿瘤为大肠癌。

[0022] 本发明的目的之四在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在细胞模型中的应用。

[0023] 优选地，所述细胞模型为肿瘤细胞模型，进一步优选为大肠癌细胞模型。

[0024] 本发明的目的之五在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在研究p73基因中的应用。

[0025] 本发明的目的之六在于提供了一种所述大肠癌p73报告基因细胞系在筛选调控p73基因变化的分子或药物中的应用。

[0026] 优选地，所述药物为抗癌药物，优选地所述药物为抗大肠癌药物。

[0027] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

[0028] 非另有具体的说明，本发明中所使用的技术和科学术语具有与本领域的技术人员所理解的意义相同。本发明中使用的命名法和描述的实验方法是广泛所知的，并在本领域中常用到的。

[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0030] (1)本发明经过层层筛选确定能够高效地靶向结合目标位点的p73-sgRNA，并直接将构建好的质粒pX459/p73-sgRNA与EGFP整合片段按一定比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116中，确保了可以后续快速检测具EGFP表达的大肠癌p73报告基因细胞及建立稳定细胞系的目的。

[0031] (2)本发明所述方法简单易行且高效，通过精心设计筛选的报告基因插入位点，利用sgRNA精准定位基因位点快速获得目标基因插入的稳定细胞系，具有耗时少、成功率高的优点。结果显示，EGFP敲进效率达到7-8％，本实验每96孔板可筛选7-10株，比本领域通常1％的敲进效率有显著提高，而且该细胞系稳定传代30代后测序显示，基因敲进序列依然保持遗传稳定。

[0032] (3)p73基因与报告基因EGFP通过自剪切肽2A肽连接，构建为一个操纵子，通过2A肽的自我剪切功能保证了p73基因与EGFP的在细胞中能够共表达，互不干扰，实现了报告基因对p73基因的示踪作用。

[0033] (4)本发明所述细胞系可进行实时监测，简易直观，将大大促进相关药物代谢评价及相关基因功能的研究，极具临床推广潜力和应用价值。

附图说明

[0034] 图1为绿色荧光蛋白靶基因敲入机理示意图。

[0035] 图2为流式细胞仪筛选绿色荧光蛋白表达的单细胞克隆。

[0036] 图3为筛选获得的阳性p73报告基因细胞系表达绿色荧光蛋白。

[0037] 图4为PCR鉴定p73报告基因细胞系。

[0038] 图5为免疫印迹法鉴定p73报告基因细胞系。

[0039] 图6为shRNA敲减p73与EGFP的共同表达。

具体实施方式

[0040] 以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

[0041] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0042] 实施例1大肠癌p73报告基因细胞系的建立

[0043] 步骤1：设计合适的p73-sgRNA序列，并进行评估：

[0044] 通过筛选和评估，得到sgRNA序列，为：

[0045] p73-sgRNA：CGGAGGCCGAGATCCACTGA(>chr1:3733060-3733079)，如SEQ ID NO.1[0046] 所示。

[0047] 步骤2：构建pX459-sgRNA质粒，包括以下步骤：

[0048] 根据p73-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/p73-sgRNA。

[0049] 步骤3：整合L-EGFP-R片段，包括以下步骤：

[0050] 根据p73基因的同源臂和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R，序列如SEQ ID NO.2所示；构建流程如附图1所示。

[0051] 步骤4：筛选具绿色荧光的大肠癌p73报告基因细胞系，包括以下步骤：

[0052] 将上述质粒pX459/p73-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段L-EGFP-R按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；

[0053] 先用96孔板在流式细胞仪单细胞筛选(见图2)，每个96孔板可获得7-10个具有EGFP表达的细胞株，EGFP敲进效率达到7-8％，比本领域通常1％的敲进效率有显著提高。

[0054] 扩增培养挑选的单克隆细胞系(见图3)，提取并获得具有EGFP表达的细胞的基因组DNA，进行基因组PCR，获得阳性扩增说明插入成功，为p73报告基因细胞系。PCR鉴定引物序列如下所示：

[0055] 正向引物F-GT：GGGGGCCCTGAAGATCCCCGAGCAG，如SEQ ID NO.3所示；

[0056] 反向引物R-GT：CCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGC，如SEQ ID NO.4所示。

[0057] 野生型细胞同样进行基因组PCR，PCR鉴定引物序列如下所示：

[0058] 正向引物F-WT：GGGGGCCCTGAAGATCCCCGAGCAG，如SEQ ID NO.5所示；

[0059] 反向引物R-WT：GCTGCAGCCAGGCGAGGCCC，如SEQ ID NO.6所示。

[0060] 通过PCR鉴定比对结果如图4所示，获得了4株p73报告基因细胞系；

[0061] 最后再将筛选获得的EGFP表达的细胞通过免疫印迹方法进一步鉴定阳性p73基因报告细胞系，鉴定结果如图5所示，最终获得了4株p73报告基因细胞系。

[0062] p73报告基因细胞系稳定传代30代后，测序显示，基因敲进序列依然保持遗传稳定。

[0063] 实施例2大肠癌p73报告基因细胞系的功能验证

[0064] 设计2条不同的特异靶向p73基因小分子干扰RNA，如图6所示shRAN-1、shRAN-2，分别转染p73报告细胞系，72小时后，转录水平分析显示相对于未敲减对照，两条特异小分子干扰RNA均有效降低p73基因表达水平(大约敲减掉了70-80％)；同时EGFP基因表达也随着p73基因敲减而相应的降低了70-80％。该实验结果从分子水平证明了本发明构建的大肠癌p73报告基因细胞系中报告基因EGFP与p73基因能够同步共表达，受到shRNA同步抑制，可以用于p73基因的抑制或过表达的示踪。

[0065] 最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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