PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的应用

摘要

本发明公开了PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的应用，所述PUB41基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄PUB41基因编辑突变体，发现该突变体能够显著增强番茄对灰霉病和青枯病的抗性，证明了PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的用途，可用于抗灰霉病和青枯病番茄品种的选育。

权利要求

1.PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病抗性中的应用，其特征在于，所述PUB41基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.PUB41基因编码的蛋白作为负调控因子在提高番茄灰霉病抗性中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.PUB41基因作为负调控因子在提高番茄青枯病抗性中的应用，其特征在于，所述PUB41基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种培育抗灰霉病和青枯病的番茄的方法，其特征在于，包括：(1)在番茄PUB41基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20bp为依据，进行引物设计，构建CRIPR/Cas9载体；

(2)构建含步骤(1)所述CRIPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系；

所述PUB41基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

构建所述CRIPR/Cas9载体的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

说明书

PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性

中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的应用。

背景技术

[0002] 随着我国现代农业的进步与发展，蔬菜产业也蓬勃发展。然而，由于植物暴露在细菌、病毒和真菌等病原微生物环境中，病虫害对蔬菜的产量及品质造成了严重的危害。同时，全球气候变化进一步加剧了生物胁迫以及非生物胁迫的发生，设施蔬菜病害发生愈加频繁。

[0003] 番茄(Solanum lycopersicum L.)是世界性经济作物，是目前设施栽培面积最大的蔬菜品种之一，但各种细菌性、病毒性以及真菌性病害发生十分猖獗，给番茄生产造成了极为严重的经济损失。番茄灰霉病和青枯病是设施栽培中极易发生的两种典型病害。

[0004] 番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的真菌病害，是一种世界性病害，同时也是番茄上的一种主要病害。番茄灰霉病在各种保护地内都会发生，且传播速度快，特别是在冬春季节低温、高湿的温室大棚内发病更加严重，一般造成减产20％-40％。

[0005] 番茄青枯病是一种细菌型病害，在我国南方各省(市)番茄种植区域均有严重发生。该病害是由茄科劳尔氏菌引起的一种世界范围的毁灭性土传细菌病害，在高温、高湿的条件下容易暴发，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，甚至在部分低温地区同样发现青枯菌的存在，给全球农作物生产带来了极大的威胁。该病害一旦发生就难以控制，往往造成作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，导致番茄产量严重下降，严重制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。

[0006] 目前，生产上大量使用化学药物进行灰霉病和青枯病的防治，导致具有抗药性的菌株在自然选择的作用下被筛选成为优势群体，进行大量繁殖，从而使化学药剂的药效下降，甚至丧失。并且，化学药物防治对环境造成了严重的危害，破坏了生态环境，危害人类健康。通过基因编辑技术可以将农作物本身的一些“不良基因”敲除，达到去劣存优的目的。并且，基因编辑技术不转入外源基因，只是对作物内部存在的基因进行修饰。在最终获得的植株中，并没有残留一点外源成分，具有与常规诱变品种无异的优点，因此在作物改良的生产应用上更为安全。目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经比较成熟，通过基因编辑技术可以敲除植物体内灰霉病和青枯病的负调控基因，从而对番茄灰霉病和青枯病进行精准调控，实现种质创新。因此，寻找并研究对番茄灰霉病和青枯病抗性具有负调控功能的关键基因对于植物抗病品种改良具有重要意义。

[0007] PUBs家族是一类含有U-box结构域的E3泛素连接酶，除了保守结构域U-box外，还存在ARM重复序列，激酶等其他结构域。PUB基因家族在调控植物生长发育、生物及非生物胁迫中具有重要意义。拟南芥AtPUB4基因能影响花粉绒毡层细胞的生长发育，pub4突变体出现绒毡层不完全退化以及花粉壁外膜不正常表型(Wang H等“, The Arabidopsis U-box/ARM repeat E3ligase AtPUB4influences growth and degeneration of tapetal cells,and its mutation leads to conditional male sterility.”The Plant Journal,2013,74(3):511-523)。除此之外，U-box泛素连接酶通过调节ABA信号通路以及ABA合成，从而在种子萌发和叶片衰老过程中起到重要作用。拟南芥pub9的突变体在种子萌发过程中表现出对ABA敏感，abi3pub9双突变体对ABA的敏感性丧失。说明U-box泛素连接酶PUB9在ABI3的上游行使功能(Raab S等，“Identification of a novel E3ubiquitin ligase that is required for suppression of premature senescence  in Arabidopsis.Plant Journal for Cell&Molecular Biology,2010,59(1):39-51)。在辣椒上，CaPUB1作为E3泛素连接酶负调控植物脱水和高盐胁迫。CaPUB1通过泛素化途径促进26S蛋白酶体亚基RPN6的降解，在过表达CaPUB1的转基因材料中，干旱胁迫的标志性基因RD29a的表达量明显上调(ChoS.K等，“Heterologous Expression and Molecular and Cellular Characterization of CaPUB1Encoding a Hot Pepper U-Box E3Ubiquitin Ligase Homolog.Plant Physiology,2006,142(4):1664-1682)。并且，含有U-box结构域的E3泛素连接酶从植物免疫反应的最初，即病原物的识别到下游信号途径的各个过程中，发挥着正调控或负调控作用。在鞭毛蛋白的诱导下，拟南芥PUB22/23/24表达量上升。在pub22/23/24三突变体中，通过增强PAMP引起的PTI免疫路径，从而提高了对细菌性叶斑病的抗性(Trujillo M等“Negative Regulation of  PAMP-Triggered Immunity by an E3Ubiquitin Ligase Triplet in Arabidopsis.Current Biology,2008,18(18):1396-1401)。

[0008] 番茄PUB基因家族的功能还鲜有人报道，PUB41在番茄免疫防御中的功能还未有研究报道。因此，研究番茄PUB41基因在灰霉病和青枯病中的抗性机制具有理论和实际应用价值。

发明内容

[0009] 本发明提供了PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的新用途，为培育抗灰霉病和青枯病的番茄品种提供依据。

[0010] 具体技术方案如下：

[0011] 本发明提供了PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病抗性中的应用，所述PUB41基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白编码区长度为1689bp，全基因序列同SEQ ID NO.1所示。

[0012] 该PUB41基因编码的蛋白为含有U-box结构域的E3泛素连接酶，由560个氨基酸组成，其序列如SEQ ID NO.2所示，可以特异性识别靶标蛋白，通过泛素化途径降解底物蛋白。

[0013] 本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对番茄PUB41基因进行序列分析，查找PAM序列，将NGG前的20个bp的序列定义为sgRNA，选定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgRNA序列。该特异性靶向番茄PUB41基因蛋白编码区的sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

[0014] 本发明通过体外泛素化实验发现，PUB41可以特异性识别番茄蛋白激酶，通过泛素化途径降解底物蛋白；番茄蛋白激酶是防御灰霉病菌的关键基因，沉默番茄蛋白激酶后植株对番茄灰霉病的防御能力下降。PUB41通过泛素化番茄防御灰霉病菌的关键基因，从而削弱番茄对灰霉病的抗性。

[0015] 所以，进一步地，PUB41基因编码的蛋白作为负调控因子在提高番茄灰霉病抗性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0016] 进一步地，所述蛋白通过与番茄蛋白激酶特异性结合，进而负调控番茄对灰霉病的抗性。

[0017] 所述的负调控是指PUB41基因通过与番茄蛋白激酶特异性结合，通过泛素化途径降解免疫防御关键蛋白番茄蛋白激酶，从而削弱番茄对灰霉病的抗性。

[0018] PUB41基因作为负调控因子在提高番茄青枯病抗性中的应用，所述PUB41基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0019] 本发明还提供了一种培育抗灰霉病和青枯病的番茄的方法，包括：

[0020] (1)在番茄PUB41基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以靶标片段PAM结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建CRIPR/Cas9载体；

[0021] (2)构建含步骤(1)所述CRIPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；

[0022] (3)将步骤(2)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系。

[0023] 进一步地，所述靶标片段PAM结构前20个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述PAM结构为NGG，N代表任意碱基。

[0024] 进一步地，构建所述CRISPR/Cas9载体的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0026] 本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄PUB41基因编辑突变体，发现该突变体能够显著增强番茄对灰霉病和青枯病的抗性，证明了PUB41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的用途，可用于抗灰霉病和青枯病番茄品种的选育。

附图说明

[0027] 图1为实施例2中获得的pub41#1纯合缺失突变体的突变点的测序分析图；

[0028] 其中，“-”表示碱基缺失；与未经过基因编辑的普通番茄相比，突变体在sgRNA的位置发生碱基缺失；以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。pub41#1比对照少两个碱基。

[0029] 图2为实施例3中对照与pub41#1纯合缺失突变体接种灰霉病2天后的病级指数柱形图；

[0030] 其中，发病越严重，病级指数越高；空心柱代表普通型番茄，斜纹柱代表pub41#1纯合缺失突变体植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著；结果表明，对照的病级指数显著高于突变体材料。

[0031] 图3为实施例3中对照与pub41#1纯合缺失突变体接种灰霉病2天后的发病叶片台盼蓝染色图；

[0032] 其中，斑点代表死细胞数量，普通番茄的斑点多于突变体材料，说明对照发病比突变体材料严重。

[0033] 图4为实施例4中普通番茄与pub41#1纯合缺失突变体接种青枯病7天后的表型图；结果表明，对照发病比突变体材料严重。

[0034] 图5为实施例4中普通番茄与pub41#1纯合缺失突变体接种青枯病7天后的病级指数柱形；

[0035] 其中，发病越严重，病级指数越高；空心柱代表普通型番茄，斜纹柱代表pub41#1纯合缺失突变体植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。结果表明，对照的病级指数显著高于突变体材料。

[0036] 图6为实施例5中体外泛素化试验的结果图；

[0037] 体外泛素化体系包括E1，E2，E3，底物蛋白以及泛素分子(ubiqutin)；其中，E1表示泛素激活酶；E2表示泛素结合酶；PUB41作为E3泛素连接酶，带有GST标签；番茄蛋白激酶作为E3作用底物蛋白，带有MBP标签，泛素分子带有HA标签；不同标签蛋白可被不同抗体检测；蛋白被泛素化后分子量发生变化，一个泛素8.5kDa，蛋白可能被一个、两个或者多个泛素标记，所以会出现如图所示泛素化条带；体系中不含E3泛素连接酶作为阴性对照。

具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人所熟知，所用原料、试剂盒均为市售商品。

[0039] 下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种CR(Condine Red)，以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照。

[0040] 实施例1突变体材料CRISPR/Cas9载体的构建

[0041] (1)在https://solgenomics.net/tools/blast/网站上输入番茄PUB41基因序列编号Solyc06g051090，找到其DNA序列如SEQ  ID  NO.6所示，输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR网站，找出on score得分高，且GC含量>40％，位置在CDS区的一段含NGG的20bp碱基序列(SEQ ID NO.3)，设计CRISPR引物，如下所示：

[0042] CRISPR-PUB41-前引物(SEQ ID NO.4):5’-GATTGCACTTGACAT TTTACCTCTG-3’[0043] CRISPR-PUB41-后引物(SEQ ID NO.5):5’-AAACCAGAGGTAAA ATGTCAAGTGC-3’[0044] (2)取上述前引物和后引物各5μl，混匀后，用PCR仪退火成双链，作为单导向RNA(sgRNA)。

[0045] (3)将中间载体pMD18-T经BbsI单酶切，纯化后与退火成双链的sgRNA相连，用T4连接酶连接后，42℃热击转化涂板，pMD18-T载体抗性为氨苄霉素。

[0046] (4)挑单克隆菌落，用CRISPR前引物(SEQ  ID  NO.4)：GATTGCA CGGCGGCGGTATTTGTGG和载体后引物(SEQ ID NO.7)：CTACTTATC GTCATCGTCTTTG，进行PCR验证。

[0047] (5)测序正确后，提质粒，经Hind III与Kpn I双酶切后，连至终载体pCAMBIA1301上。pCAMBIA1301载体抗性为卡那霉素。测序正确的质粒电击进GV3101农杆菌感受态里，获得可用于构建其CRISPR材料的载体。

[0048] 实施例2PUB41基因突变体材料的制备与鉴定

[0049] (1)培养无菌苗

[0050] 番茄种子用自来水浸泡(或用摇床28℃200rpm/min摇6-8小时)，然后用75％酒精消毒30秒，之后在10％NaClO中消毒15分钟(用摇床28℃200rpm/min)，灭菌蒸馏水冲洗3次并转移到灭菌器皿，接种于1/2Murashige and Skoog(MS)培养基。25℃黑暗条件下培养至发芽。

[0051] (2)准备外植体

[0052] 种子发芽后6天，将无菌苗的子叶用刀切下，子叶带有一小段叶柄，置入看护培养基中预培养1天(避光，过夜即可，看护培养时间过长容易导致侵染过度)。

[0053] (3)农杆菌侵染

[0054] 将实施例1中培养至对数中期(OD600≈1.0)的农杆菌菌液离心后，去上清，加入悬浮培养基MS0.2，摇匀。将子叶外植体转移到有MS0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液至暗下接种感染4-5分钟，并轻轻晃动培养皿。将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，将子叶外植体反面朝上转移到看护培养基上，22℃避光共培养2天。

[0055] (4)选择培养、再生

[0056] 共培养后，将外植体小心的转入MRS1(2Z+)上，2-3周后转入MRS2(0.2Z+)中培养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽。

[0057] (5)再生芽生根、移栽

[0058] 待再生芽长至1厘米左右时，将芽切下(可以不切，以免伤害生根部位)，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，成活后移栽至花盆中，得到T0代基因编辑材料。

[0059] (6)番茄pub41#1纯合突变体材料验证

[0060] 利用CTAB法提取T0代植株的基因组DNA并以其为模板，在包含sgRNA的DNA序列前后约200bp处设计如下引物，进行PCR扩增测序验证：

[0061] 验证前引物(SEQ ID No.8):GCTCTTTGTGGAACCTCATG

[0062] 验证后引物(SEQ ID No.9):CCTATCACAGTTAGTAGCCA

[0063] 将上述选取的包含20bp sgRNA的序列扩增出来后，送测序公司测序，测序结果利用DNAMAN软件比对。选取sgRNA序列发生碱基缺失、且测序显示单峰的植株，进行自交繁种，获得T0代的种子。

[0064] 将T0代的种子播种后得到T1代植株，利用上述方法检测T1代植株的sgRNA序列碱基编辑情况。同时，利用CRISPR前引物(SEQ ID NO.4)和载体后引物(SEQ ID NO.7)对DNA进行PCR扩增，检测T1代植株是否含有Cas9。选取不含Cas9，但sgRNA发生变异的T1代植株，在温室繁种，自交获得不含外源基因Cas9，且稳定遗传的T1代纯合突变体植株1个株系，命名为pub41#1，其基因编辑位点如图1所示。

[0065] pub41#1比对照少两个碱基。对上述株系进一步自交繁种，获得T1代种子。将T1代种子播种后，获得不含外源基因Cas9，且sgRNA发生变异的稳定遗传的T2代植株。

[0066] 以下实施例均以T2代纯合株系作为材料进行实验。

[0067] 实施例3番茄pub41#1基因编辑突变体对灰霉病抗性影响

[0068] 灰霉体接种实验：灰霉菌(BO5-10)培养用V8固体培养基(36％V8果汁，0.2％CaCO3，2％琼脂粉)在16℃避光条件下培养15天左右，待皿内长满孢子后，4℃避光保存。使用时，将菌丝块放入接种培养基(1％蛋白胨，4％一水合麦芽糖)中，组培刀片将菌丝刮下，剧烈涡旋震荡释放孢子，用纱布过滤，血球计数板在显微镜下调整孢子浓度至2×105spores/ml。接种前，加入万分之二的有机硅作为表面延伸剂，用喷壶均匀地将悬浮液喷施在叶片上，以接种培养基作为对照。接种后，植株置于95％以上湿度的空间中，温度一般控制在22℃左右，2天后观察叶片发病情况。

[0069] 根据叶片发病情况统计病级指数，如图2所示，对照的发病情况明显较突变体更严重；取发病叶片进行台盼蓝染色，如图3所示，对照的斑点数明显多于突变体。

[0070] 病级指数的统计方式为：将发病的番茄叶片进行分级，分级标准为：0级表示未发病，1级表示叶片下表皮可见少数病斑，2级表示叶片下表皮局部密集病斑，3级表示叶片下表皮多部位密集病斑，4级表示叶片下表皮全叶可见病斑分布。0-4级别分别赋值0-4分。根据每个植株每个叶片的发病情况按分级进行分类，每个处理至少统计50片番茄叶片。病情指数的计算公式如下：

[0071] 病情指数DI＝∑(各级叶片数×相应级数)×100％/(总叶片数×最高发病级数)[0072] 综上，番茄pub41#1基因突变体材料能够显著提高其对番茄灰霉病的抗性。

[0073] 实施例4番茄pub41#1基因编辑突变体对青枯病抗性影响

[0074] 菌液在TTC筛选培养基(Peptone 10g/L；Casamino Acid 1g/L；Glucose 5g/L；Agar 15g/L；高温高压灭菌后，加入1％TTC 5ml/L)上划板，放于28℃培养箱中培养2天后，检测菌液致病力，致病性强的菌株，菌落白色，中间粉红色，形状不规则，带粘性。菌液在扩繁培养基(MgSO4·7H2O 0.3g/L；K2HPO4 2.0g/L；Yeast extract 4.0g/L；Casamino Acid 
8.0g/L；Sucrose 10.0g/L；Agar 15.0g/L)上划板，放于28℃培养箱中培养2天后，用接菌环挑取带粘性具有流动性的乳白色菌液于NA培养基中(牛肉浸膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 
10g/L)，在28℃、200rpm/min的摇床中培养48h，4℃、4000rpm/min离心10min，用无菌水重悬，调节菌液OD600＝1.0-1.5，灌根接种，每株40ml菌液，放于28℃的保湿环境中，7天后观察植株发病情况。

[0075] 番茄pub41#1基因编辑突变体材料以及对照进行青枯病病菌接种7天后表型如图4所示。根据叶片发病情况，统计病级指数，如图5所示，对照的发病情况明显较突变体更严重。

[0076] 病级指数统计方式为：植株发病症状按轻重程度依次分为五个等级，分级标准为：0级，叶片正常没有病症发生；1级，1％-25％的叶片发生萎蔫；2级，26％-50％的叶片发生萎蔫；3级，51％-75％的叶片发生萎蔫；4级，76％-100％的叶片发生萎蔫。每个实验至少重复3次。病情指数的计算公式如下：

[0077] 病情指数DI＝∑(各级病株数×相应级数)×100％/(调查总株数×最高发病级数)

[0078] 综上，番茄pub41#1基因突变体材料能够显著提高其对番茄青枯病的抗性。

[0079] 实施例5PUB41对番茄蛋白激酶泛素化作用鉴定

[0080] 体外泛素化反应发生在30μl体系中，包括：在泛素化缓冲液(0.1M Tris-Cl，PH＝7.5，25mM MgCl2，2.5mM DTT，10mM ATP)中加入0.25μg E1(Boston Biochem)，0.5μg E2(Boston Biochem)，1.25μg HA-tagged ubiquitin(Boston Biochem)，1μg GST-PUB41纯化蛋白作为E3泛素连接酶。1μg MBP-番茄蛋白激酶纯化蛋白作为底物蛋白。

[0081] 反应在30℃孵育2h，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃金属浴煮5min。样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用HA、GST、和MBP抗体进行杂交。结果如图6所示。

[0082] 结果表明，当体系中存在E1，E2，泛素分子，PUB41以及番茄蛋白激酶时，番茄蛋白激酶可以被PUB41泛素化。