标记细胞膜表面及研究细胞-细胞相互作用的酶和方法

摘要

本发明公开了一种标记细胞膜表面及研究细胞‑细胞相互作用的酶和方法，涉及经过基因工程进化的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，这类突变体可以实现临近效应介导的标记反应，基于此可以实现未经基因改造的细胞膜表面的标记，并且可以体内和体外对细胞‑细胞相互作用进行精准捕捉与标记。

权利要求

1.一种细胞‑细胞相互作用的检测方法，通过基因改造的方法使将金黄色葡萄球菌分选酶A突变体展示在第一种细胞的表面，在pH 6.5 7.5的PBS缓冲液中室温共孵育第一种细~

胞和第二种细胞，并加入带有LPXTG序列的标记分子进行标记，其中X代表任意氨基酸；孵育一定时间后清洗细胞，检测第二种细胞表面是否被标记分子标记，若是，说明第一种细胞和第二种细胞之间发生了相互作用；

所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是下述突变体之一：突变体1：P94R/ D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；

突变体2：P94R/ D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；

突变体3：P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；

突变体4：P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；

突变体5：P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；

突变体6：P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；

其中突变体1、3、5是截去氮端25个氨基酸残基的截短体；突变体2、4、6是截去氮端59个氨基酸残基的截短体；

所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是序列表中SEQ ID No：1至SEQ ID No：6中任意一个所示氨基酸序列的蛋白质。

说明书

标记细胞膜表面及研究细胞‑细胞相互作用的酶和方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，特别涉及酶促标记技术，具体涉及酶促的细胞膜标记方法，以及利用酶促反应研究、发现细胞‑细胞相互作用的方法。

背景技术

[0002] 细胞膜的标记是研究细胞功能的一项重要手段，通常要完成细胞膜的标记需要对细胞进行基因改造，这也大大限制了细胞膜标记技术的应用。另外，细胞‑细胞的相互作用
对于生命过程有至关重要的作用，其介导了许多重要的生命过程。然而发现细胞与细胞间
的相互作用是相对困难的一件事情，因此开发可以研究/检测细胞‑细胞相互作用的技术对
于揭示生命过程中的一些信号传导具有很高的意义。

[0003] 金黄色葡萄球菌分选酶A(Sa‑SrtA)是革兰氏阳性菌中普遍存在的一类半胱氨酸转肽酶，典型的，其可以催化底物LPXTG(X代表任意氨基酸)与α‑Glyn(寡聚甘氨酸)之间的
连接反应，这一反应因此被命名为分选酶介导的连接反应(Sortase‑Mediated Ligation，
SML)。同时，分选酶A还可以催化LPXTG与α‑Gly之间的反应，然而，相对于其催化α‑Glyn的反
应，反应活性更低。

[0004] 利用分选酶A介导的连接反应，可以实现各种蛋白质的定点标记与偶合。由于野生型分选酶A催化效率较低，基于高通量筛选的定向进化以及理性设计的方法提升分选酶A的
活性成为一种必要。Chen等发现了5个点突变P94R、D160N、D165A、K190E和K196T(Chen I.et 
al.ProcNatl AcadSci USA 2011,108,11399‑11404)，可以在一定程度上提升其活性。中国
发明专利申请公开文本CN106191015A中发现了另外4个点突变D124G、Y187L、E189R和
F200L，获得了金黄色葡萄球菌分选酶A高效突变体。此外，野生型金黄色葡萄球菌分选酶A
是一个包含206个氨基酸残基的蛋白酶，截掉氮端25个氨基酸残基的截短体可以在大肠杆
菌中高水平、可溶性的表达(Ton‑That H.et al.ProcNatl AcadSci USA 1999,96,12424–
12429)，因此在现有研究中分选酶A基本上都以这种截短体的形式存在。

发明内容

[0005] 本发明的目的是基于金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体，实现对于未基因改造的细胞膜表面的标记，将金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体表达于感兴趣的细胞表面，进而可
以实现临近效应介导的标记反应，利用这些特性可以实现对细胞‑细胞之间相互作用的检
测与发现。

[0006] 具体的，本发明所提供的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体包含以下突变中的一种或多种：P94R、E105K、E108A或E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T、
F200L。这些突变体可以更好的催化LPXTG与α‑Gly或α‑Glyn之间的连接反应，特别是大大提
升了分选酶A催化LPXTG与非典型底物α‑Gly的连接效率。

[0007] 本发明优选的分选酶A突变体是下述突变体之一：

[0008] 突变体1：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

[0009] 突变体2：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

[0010] 突变体3：

[0011] P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

[0012] 突变体4：

[0013] P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

[0014] 突变体5：

[0015] P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

[0016] 突变体6：

[0017] P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

[0018] 通过以上的突变体，首先可以实现细胞膜表面的标记(图1中(a))，同时，通过将以上分选酶A突变体展示到感兴趣的细胞膜表面(展示的方法包括基因改造的方法或者其他
非基因改造的方法)，可以实现与其相互作用的细胞临近标记，从而记录‑检测两种细胞之
间的相互作用。图1中(b)展示了在配体‑受体介导的细胞‑细胞相互作用下，金黄色葡萄球
菌分选酶A突变体基于临近效应介导的标记反应。本发明所述细胞‑细胞相互作用包括配
体‑受体介导的细胞‑细胞相互作用，但不仅限于此。

[0019] 本发明提供的细胞膜标记方法，利用金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体将带有LPXTG序列(X代表任意氨基酸)的标记分子连接到细胞膜表面(见图1中(a))。所述标记分子
可以是小分子或生物大分子，例如：生物素(Biotin)、荧光染料、增强型绿色荧光蛋白
(eGFP)、其他功能蛋白、核酸等。

[0020] 具体的，所述细胞膜标记方法是将所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体、带有LPXTG序列的标记分子与待标记细胞在pH 5～9的缓冲液(优选为pH 6.5～7.5的缓冲液，例
如pH 7.4左右的PBS缓冲液或Tris缓冲液)中混匀，室温下反应一定时间，然后用缓冲液清
洗细胞，得到表面标记了所述标记分子的细胞。

[0021] 本发明还提供了一种细胞‑细胞相互作用的检测方法，将所述金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体展示在第一种细胞的表面，共孵育第一种细胞和第二种细胞，并加入带有
LPXTG序列的标记分子进行标记，一定时间后清洗细胞，检测第二种细胞表面是否被标记分
子标记，若是，说明第一种细胞和第二种细胞之间发生了相互作用。

[0022] 上述细胞‑细胞相互作用的检测方法中，优选的，将两种细胞和带有LPXTG序列的标记分子在PBS缓冲液中室温共孵育一段时间，如30分钟。当所述标记分子是生物素时，将
清洗后的细胞与链霉亲和素‑荧光色素偶联物(如Streptavidin PE)在冰上孵育一定时间，
然后利用流式细胞分选仪进行表征。

[0023] 本发明使用的分选酶A为金黄色葡萄球菌分选酶A(GenBank登录号：BA000018，ORFID:SA2316)，本发明涉及的分选酶A的突变体可以是截去氮端25～59个氨基酸残基的任
一截短体。其中，突变体1‑6的氨基酸序列分别对应SEQ ID No：1至SEQ ID No：6，其中突变
体1、3、5包含181个氨基酸残基，对应截去氮端25个氨基酸残基的序列；突变体2、4、6包含
147个氨基酸残基，对应截去氮端59个氨基酸残基的序列。上述突变体位点是相对于全长野
生型金黄色葡萄球菌分选酶A而言。本发明中涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体统一命
名为mgSrtA。

[0024] 序列表中SEQ ID No：1至SEQ ID No：6所示氨基酸序列对应的基因序列依次可以分别如SEQ ID No：7至SEQ ID No：12所示，当然，根据密码子的简并性，也可以是利用同一
氨基酸的不同密码子而获得的编码相同蛋白质的其他核苷酸序列。

[0025] 含有这些基因序列的载体、细胞和宿主菌也在本发明的保护范围内。

[0026] 细胞膜表面本身寡聚甘氨酸很少，存在的基本是都是单甘氨酸，本发明利用经过基因工程进化的金黄色葡萄球菌分选酶A(Staphylococcus aureus Sortase A，Sa‑SrtA)
突变体，大大提高对于单甘氨酸残基的标记效率，基于临近效应介导的标记反应，可以实现
未经基因改造的细胞膜表面的标记，并且可以对细胞‑细胞相互作用进行精准捕捉与标记。
本发明提供的细胞‑细胞相互作用的检测方法既可以在体外实现，也可以用于活体内细胞‑
细胞相互作用的检测。

附图说明

[0027] 图1是本发明的细胞膜表面标记方法和细胞‑细胞相互作用检测方法的示意图，其中：

[0028] (a)是利用本发明涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体进行细胞膜标记的示意图，其中mgSrtA为本发明涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，target molecule为带有
LPXTG序列的标记分子，标记分子可以是小分子或生物大分子；

[0029] (b)显示了利用本发明涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体进行细胞‑细胞相互作用检测的示意图，其中：Cell of Interest代指我们感兴趣的细胞，Interacting Cell代
指与我们感兴趣的细胞存在相互作用的细胞。

[0030] 图2显示了实施例一利用本发明的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体mgSrtA对细胞膜标记eGFP‑LPETG后流式细胞分选仪表征结果。

[0031] 图3是实施例二利用mgSrtA介导的临近标记实现HER2阳性细胞与表达HER2配体ZHER细胞间的相互作用的记录与检测的示意图。

[0032] 图4显示了实施例二的流式细胞分选仪表征结果。

[0033] 图5显示了实施例二中流式细胞分选仪的细胞分选全图。

[0034] 图6是实施例三利用mgSrtA介导的临近标记实现细胞‑细胞相互作用的记录与检测的示意图。

[0035] 图7显示了实施例三中的流式细胞分选仪的细胞分选全图。

具体实施方式

[0036] 下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。虽然附图中显示了本发明的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实
施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发
明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

[0037] 实施例一、细胞膜的标记

[0038] 利用克隆的方法分别在pet28a载体上同时表达eGFP‑LPETG和本发明中涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，利用6×His标签进行蛋白纯化。细胞膜标记反应在PBS缓冲
液或Tris缓冲液(30mM Tris，150mM NaCl，5mM CaCl2，pH 7.4)中进行，反应条件如下：20μM 
7
mgSrtA，20μM eGFP‑LPETG，室温1小时,细胞密度2×10cells/mL。反应完成后使用缓冲液
清洗三遍，然后利用流式细胞分选仪进行表征。结果如图2所示，可以看出在加入mgSrtA(+
mgSrtA)后与只加eGFP‑LPETG(‑mgSrtA)相比，细胞eGFP荧光强度更强，证明eGFP‑LPETG被
标记到细胞表面。序列表中SEQ ID No：1至6所示的六个突变体的实验结果一致。

[0039] 实施例二、模型HER2阳性细胞‑细胞相互作用的记录与检测

[0040] 首先，利用基因改造的方式将ZHER和/或mgSrtA展示到HEK293T细胞的表面，并标记eFluor670作为后期分选的信号。MDA‑MB‑231细胞通过慢病毒转染的方法稳转HER2受体
(人表皮生长因子受体‑2)作为Her2阳性细胞(Her2+cells)。将以上两种细胞(细胞密度2×
7
10cells/mL)在PBS缓冲液中室温共孵育30分钟，并加入100μM的biotin‑LPETG进行标记，
同时以MDA‑MB‑231细胞本身为Her2阴性细胞(Her2‑cells)作为对照。标记完成后使用PBS
清洗三次，然后在冰上与Streptavidin PE孵育15min，最后利用流式细胞分选仪进行表征。

[0041] 本实验中，Her2阳性细胞与表达Her2配体ZHER的细胞之间发生相互作用，使得mgSrtA能够将生物素标记到Her2阳性细胞表面(如图3所示)，从而利用mgSrtA介导的临近
标记可以实现细胞‑细胞相互作用的记录与检测。流式细胞分选仪的表征结果如图4和图5
所示，由图4看出，只有Her2阳性细胞可以被同时表达ZHER和mgSrtA的HEK293T细胞标记，证
明只有两个相互作用的细胞才能实现mgSrtA介导的标记。图5展示的是图4中细胞分选的全
图，Q2代表被Biotin标记的Her2阳性或阴性细胞。图4和图5结果说明只有相互作用的细胞
能够被mgSrtA介导的标记记录。序列表中SEQ ID No：1至6所示的六个突变体都得到了相类
似的实验结果。

[0042] 实施例三、模型Raji细胞‑细胞相互作用的检测

[0043] 首先，利用基因改造的方式将CD40L(或CD40L*或CTLA4)与mgSrtA展示到HEK293T细胞的表面，表达CD40L或CTLA4的细胞可以通过与Raji细胞表面的CD40或B7配对诱导
HEK293T与Raji细胞的相互作用，CD40L*为CD40L的突变体，不与CD40L相互作用，作为阴性
对照。将上述表达不同配体的HEK293T细胞与Raji细胞(Raji细胞预先标记eFluor670)在
PBS缓冲液中室温共孵育30分钟，同时加入100μM的biotin‑LPETG进行标记。标记完成后使
用PBS清洗三次，然后在冰上与Streptavidin PE孵育15min，最后利用流式细胞分选仪进行
表征。

[0044] 本实验中，表达CD40L、CD40L*或CTLA4的细胞与表达CD40和B7的Raji细胞之间发生相互作用，使得mgSrtA能够将生物素标记到Raji细胞表面(如图6所示)。流式细胞分选仪
的细胞分选全图如图7所示，Q2代表被Biotin标记的Raji细胞，可以看出只有同时表达
CD40L(或CTLA4)与mgSrtA时Raji细胞才能被标记，而无论是同时表达CD40L*与mgSrtA或同
时表达ZHER与mgSrtA的HEK293T细胞都无法诱导Raji细胞的标记。说明只有相互作用的细
胞能够被mgSrtA介导的标记记录。序列表中SEQ ID No：1至6所示的六个突变体都得到了相
类似的实验结果。