本发明提出了一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，采用植物组织培养的方法繁殖大花蕙兰，不仅可以摆脱外界条件的影响，四季都能够进行生产，并且能够节约育苗的占地面积，降低企业的成本；本发明在不同的阶段通过提供不同的培养基等一系列人为条件的控制，保存了母体的全部优良性状，并且遗传性状稳定；本发明经过诱导分化，高效获得不定芽，生根形成的试管苗经过驯化作用的处理，不仅能够缩短生长周期，而且能够有效的提高存活率，适宜规模化工业化生产。
1.一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，外植体的选取与准备：在温度为15-25℃，空气湿度为45-60%的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为1-3厘米的小段，每段至少带一对腋芽；
S2，外植体消毒：用灭菌水清洗3-5次，滤纸吸干，在质量百分浓度为65-75%的酒精中浸泡30-60s，在质量百分浓度为0.5-1.5%的次氯酸钠中浸泡5-15min，在质量百分浓度为0.1-
0.5%的氯化汞中浸泡10-15min，在质量百分浓度为10-20%的漂白粉中浸泡5-10min，灭菌水冲洗5-10次，滤纸吸干；
S3，腋芽诱导：将消毒好的大花蕙兰茎段切成0.5-1.5厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为20-25℃，光照强度为1500-3500lx，光照时间为8-12h，空气湿度为30-45%的条件下培养，所述培养基1的配方成分按照重量比为水100份，水和硝酸钙0.6-1.5份，硝酸钾
0.2-2份，盐酸硫胺素0.1-0.5份，蔗糖10-30份，琼脂5-8份，用NaOH调节pH至5-8，在121℃下灭菌30-45min；
S4，腋芽培养：将腋芽萌发后培养20-25d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为25-28℃，光照强度为2500-5500lx，光照时间为12-20h，空气湿度为45-65%的条件下培养；
S5，丛生芽诱导：将生长至5-10厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为15-20℃，光照强度为2000-4000lx，光照时间为8-10h，空气湿度为55-
65%的条件下培养25-35d，所述培养基2的配方成分按照重量比为水100份，水和硝酸钙2-5份，硝酸钾1-2份，盐酸硫胺素0.6-1份，蔗糖20-30份，琼脂5-10份，吲哚乙酸3-5份，6-苄基腺嘌呤0.1-1份，萘乙酸2-5份，用NaOH调节pH至6-7，在121℃下灭菌30-45min；
S6，生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，接种到培养基3中，在温度为25-28℃，光照强度为5000-8000lx，光照时间为8-10h，空气湿度为35-45%的条件下培养50-60d，所述培养基3的配方成分按照重量比为水100份，硝酸铵0.3-1.5份，氯化钙1.5-2.5份，钼酸钠
2.5-5份，肌醇0.1-0.5份，甘氨酸1-2份，蔗糖45-60份，琼脂10-20份，鱼肝油1-5份，松花粉
0.5-1.5份，6-苄基腺嘌呤2-5份，用NaOH调节pH至7-8，在121℃下灭菌45-60min；
S7，炼苗移栽：将组培瓶盖打开，添加10-15ml蒸馏水，有菌驯化3-5d，将组培苗取出，移栽到灭菌的培养基质中，遮阴驯化3-5周，所述培养基质由蛭石，锯木屑，蚯蚓粪按照质量比为（3-5）：（1-3）：（2-6）混合，121℃灭菌30-45min。
2.如权利要求1所述的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤S1中，在温度为22℃，空气湿度为50%的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为2厘米的小段，每段至少带一对腋芽。
3.如权利要求1所述的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤S2中，用灭菌水清洗4次，滤纸吸干，在质量百分浓度为70%的酒精中浸泡45s，在质量百分浓度为1%的次氯酸钠中浸泡10min，在质量百分浓度为0.3%的氯化汞中浸泡12min，在质量百分浓度为15%的漂白粉中浸泡8min，灭菌水冲洗8次，滤纸吸干。
4.如权利要求1所述的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤S3中，将消毒好的大花蕙兰茎段切成1厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为22℃，光照强度为2500lx，光照时间为10h，空气湿度为40%的条件下培养。
5.如权利要求1所述的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤S4中，将腋芽萌发后培养22d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为26℃，光照强度为3000lx，光照时间为15h，空气湿度为50%的条件下培养。
6.如权利要求1所述的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤S5中，将生长至6厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为18℃，光照强度为3000lx，光照时间为9h，空气湿度为60%的条件下培养30d。
一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物的人工繁殖和栽培方法技术领域，尤其涉及一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法。
背景技术
[0002] 随着人民生活水平的不断提高，花卉已经走进寻常老百姓的日常生活，消费需求也越来越大。自古以来，兰花就是高雅与超凡脱俗的化身，具有很高的观赏和经济价值。在国际市场上，无论是切花品种还是盆花，都占有重要的地位，深受广大消费者的欢迎。
[0003] 大花蕙兰，叶长碧绿，花姿粗犷，豪放壮丽，是世界著名的“兰花新星”，它的植株和花朵分为大型和中小型，花朵硕大，有黄、白、绿、红、粉红以及复色等多种颜色，色彩鲜艳，异彩纷呈，花型整齐且质地坚挺，经久不凋，属于豪华高雅型兰花，它不仅具有国兰的幽香典雅，也具有洋兰的丰富多彩，在国际花卉市场上十分畅销。
[0004] 兰花的传统繁殖为分株繁殖，然而，一株健壮的兰花一年只能怪繁殖几个芽，繁殖系数极低，增殖倍数只有1-3倍，许多的珍稀品种不能够进行大量的繁殖，远远不能够满足市场的需求，并且价格长期的居高不下，每个叶芽高达上万元。不少品种在栽培条件下不能够或者很少结种子，如果通过有性繁殖，由于兰花的种子小，胚发育不完全，不能够提高有营养的胚乳和其他组织，不容易发芽，需要借助一些特定的共生的菌类提供营养才有可能发芽；许多名贵品种实际上是一些自然突变体，如果借助有性生殖过程产生种子，再由种子繁殖后代，那么，这个品种的绝大多数个体将失去原有品种的独特的观赏价值，另外，长期的无性繁殖，造成带病毒的植株日益增多，使得兰花的品种严重下降。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明提出了一种繁殖速度快，存活效率高，能够四季生产，并且遗传性状稳定的大花蕙兰的离体快速繁殖的方法。
[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0007] S1，外植体的选取与准备：在温度为15-25℃，空气湿度为45-60％的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为1-3厘米的小段，每段至少带一对腋芽；
[0008] S2，外植体消毒：用灭菌水清洗3-5次，滤纸吸干，在质量百分浓度为65-75％的酒精中浸泡30-60s，在质量百分浓度为0.5-1.5％的次氯酸钠中浸泡5-15min，在质量百分浓度为0.1-0.5％的氯化汞中浸泡10-15min，在质量百分浓度为10-20％的漂白粉中浸泡5-10min，灭菌水冲洗5-10次，滤纸吸干；
[0009] S3，腋芽诱导：将消毒好的大花蕙兰茎段切成0.5-1.5厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为20-25℃，光照强度为1500-3500lx，光照时间为8-12h，空气湿度为30-45％的条件下培养；
[0010] S4，腋芽培养：将腋芽萌发后培养20-25d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为25-28℃，光照强度为2500-5500lx，光照时间为12-20h，空气湿度为45-65％的条件下培养；
[0011] S5，丛生芽诱导：将生长至5-10厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为15-20℃，光照强度为2000-4000lx，光照时间为8-10h，空气湿度为55-65％的条件下培养25-35d；
[0012] S6，生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，接种到培养基3中，在温度为25-28℃，光照强度为5000-8000lx，光照时间为8-10h，空气湿度为35-45％的条件下培养50-60d；
[0013] S7，炼苗移栽：将组培瓶盖打开，添加10-15ml蒸馏水，有菌驯化3-5d，将组培苗取出，移栽到灭菌的培养基质中，遮阴驯化3-5周。
[0014] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S1中，在温度为22℃，空气湿度为50％的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为2厘米的小段，每段至少带一对腋芽。
[0015] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S2中，用灭菌水清洗4次，滤纸吸干，在质量百分浓度为70％的酒精中浸泡45s，在质量百分浓度为1％的次氯酸钠中浸泡10min，在质量百分浓度为0.3％的氯化汞中浸泡12min，在质量百分浓度为15％的漂白粉中浸泡8min，灭菌水冲洗8次，滤纸吸干。
[0016] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S3中，将消毒好的大花蕙兰茎段切成1厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为22℃，光照强度为25000lx，光照时间为10h，空气湿度为40％的条件下培养。
[0017] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述培养基1的配方成分按照重量比为水100份，水和硝酸钙0.6-1.5份，硝酸钾0.2-2份，盐酸硫胺素0.1-0.5份，蔗糖10-30份，琼脂5-8份，用NaOH调节pH至5-8，在121℃下灭菌30-45min。
[0018] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S4中，将腋芽萌发后培养22d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为26℃，光照强度为3000lx，光照时间为15h，空气湿度为50％的条件下培养。
[0019] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述培养基2的配方成分按照重量比为水100份，水和硝酸钙2-5份，硝酸钾1-2份，盐酸硫胺素0.6-1份，蔗糖20-30份，琼脂5-10份，吲哚乙酸3-5份，6-苄基腺嘌呤0.1-1份，萘乙酸2-5份，用NaOH调节pH至6-7，在121℃下灭菌30-45min。
[0020] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S5中，将生长至6厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为18℃，光照强度为3000lx，光照时间为9h，空气湿度为60％的条件下培养30d。
[0021] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S6中，培养基3的配方成分按照重量比为水100份，硝酸铵0.3-1.5份，氯化钙1.5-2.5份，钼酸钠2.5-5份，肌醇0.1-0.5份，甘氨酸1-2份，蔗糖45-60份，琼脂10-20份，鱼肝油1-5份，松花粉0.5-1.5份，6-苄基腺嘌呤2-5份，用NaOH调节pH至7-8，在121℃下灭菌45-60min。
[0022] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S7中，培养基质由蛭石，锯木屑，蚯蚓粪按照质量比为(3-5)：(1-3)：(2-6)混合，121℃灭菌30-45min。
[0023] 本发明的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法相对于现有技术具有以下有益效果：
[0024] (1)本发明采用植物组织培养的方法繁殖大花蕙兰，不仅可以摆脱外界条件的影响，四季都能够进行生产，并且能够节约育苗的占地面积，降低企业的成本，保存了母体的全部优良性状，并且遗传性状稳定；
[0025] (2)本发明在腋芽诱导阶段使用添加含有盐酸硫胺素的培养基1，能够有效的缓解茎尖伤口的愈合与感染；在腋芽培养和丛生芽诱导阶段使用添加有6-苄基腺嘌呤的培养基2，能够快速的促进腋芽的生长发育；在生根培养中添加含有鱼肝油的培养基3，能够使幼根在炼苗阶段能够充分快速的吸收基质中的无机盐成分，提高存活率；
[0026] (3)本发明经过诱导分化，高效获得不定芽，生根形成的试管苗经过炼苗驯化作用的处理，不仅能够缩短生长周期，而且能够有效的提高存活率，适宜规模化工业化生产。
具体实施方式
[0027] 下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0028] 实施例一
[0029] 本发明提供了一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0030] S1，外植体的选取与准备：在温度为15℃，空气湿度为45％的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为1厘米的小段，每段至少带一对腋芽；
[0031] S2，外植体消毒：用灭菌水清洗3次，滤纸吸干，在质量百分浓度为65％的酒精中浸泡30s，在质量百分浓度为0.5％的次氯酸钠中浸泡5min，在质量百分浓度为0.1％的氯化汞中浸泡10min，在质量百分浓度为10％的漂白粉中浸泡5min，灭菌水冲洗5次，滤纸吸干；
[0032] S3，腋芽诱导：将消毒好的大花蕙兰茎段切成0.5厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为20℃，光照强度为1500lx，光照时间为8h，空气湿度为30％的条件下培养；培养基1的配方成分按照重量比为水100kg，水和硝酸钙0.6kg，硝酸钾0.2kg，盐酸硫胺素0.1kg，蔗糖10kg，琼脂5kg，用NaOH调节pH至5，在121℃下灭菌30min；
[0033] S4，腋芽培养：将腋芽萌发后培养20d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h，空气湿度为45％的条件下培养；培养基2的配方成分按照重量比为水100kg，水和硝酸钙2kg，硝酸钾1kg，盐酸硫胺素0.6kg，蔗糖20kg，琼脂5kg，吲哚乙酸3kg，6-苄基腺嘌呤0.1kg，萘乙酸2kg，用NaOH调节pH至6，在121℃下灭菌30min；
[0034] S5，丛生芽诱导：将生长至5厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为8h，空气湿度为55％的条件下培养25d；
[0035] S6，生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，接种到培养基3中，在温度为25℃，光照强度为5000lx，光照时间为8h，空气湿度为35％的条件下培养50d；培养基3的配方成分按照重量比为水100kg，硝酸铵0.3kg，氯化钙1.5kg，钼酸钠2.5kg，肌醇0.1kg，甘氨酸1kg，蔗糖45kg，琼脂10kg，鱼肝油1kg，松花粉0.5kg，6-苄基腺嘌呤2kg，用NaOH调节pH至7，在121℃下灭菌45min；
[0036] S7，炼苗移栽：将组培瓶盖打开，添加10ml蒸馏水，有菌驯化3d，将组培苗取出，移栽到灭菌的培养基质中，培养基质由蛭石，锯木屑，蚯蚓粪按照质量比为3：1：2混合，121℃灭菌30min，遮阴驯化3周。
[0037] 实施例二
[0038] 本发明提供了一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0039] S1，外植体的选取与准备：在温度为22℃，空气湿度为50％的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为2厘米的小段，每段至少带一对腋芽；
[0040] S2，外植体消毒：用灭菌水清洗4次，滤纸吸干，在质量百分浓度为70％的酒精中浸泡45s，在质量百分浓度为1％的次氯酸钠中浸泡10min，在质量百分浓度为0.3％的氯化汞中浸泡12min，在质量百分浓度为15％的漂白粉中浸泡8min，灭菌水冲洗8次，滤纸吸干；
[0041] S3，腋芽诱导：将消毒好的大花蕙兰茎段切成1厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为22℃，光照强度为25000lx，光照时间为10h，空气湿度为40％的条件下培养；培养基1的配方成分按照重量比为水100kg，水和硝酸钙0.8kg，硝酸钾1.5kg，盐酸硫胺素0.3kg，蔗糖20kg，琼脂6kg，用NaOH调节pH至6，在121℃下灭菌40min；
[0042] S4，腋芽培养：将腋芽萌发后培养22d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为26℃，光照强度为3000lx，光照时间为15h，空气湿度为50％的条件下培养；培养基2的配方成分按照重量比为水100kg，水和硝酸钙3kg，硝酸钾1.5kg，盐酸硫胺素0.8kg，蔗糖25kg，琼脂8kg，吲哚乙酸4kg，6-苄基腺嘌呤0.5kg，萘乙酸3kg，用NaOH调节pH至6.5，在121℃下灭菌40min；
[0043] S5，丛生芽诱导：将生长至6厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为18℃，光照强度为3000lx，光照时间为9h，空气湿度为60％的条件下培养30d；
[0044] S6，生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，接种到培养基3中，在温度为26℃，光照强度为6000lx，光照时间为9h，空气湿度为40％的条件下培养55d；培养基3的配方成分按照重量比为水100kg，硝酸铵0.8kg，氯化钙2kg，钼酸钠3kg，肌醇0.3kg，甘氨酸1.5kg，蔗糖50kg，琼脂15kg，鱼肝油3kg，松花粉1.2kg，6-苄基腺嘌呤3kg，用NaOH调节pH至7.5，在121℃下灭菌55min；
[0045] S7，炼苗移栽：将组培瓶盖打开，添加12ml蒸馏水，有菌驯化4d，将组培苗取出，移栽到灭菌的培养基质中，培养基质由蛭石，锯木屑，蚯蚓粪按照质量比为4：2：3混合，121℃灭菌40min，遮阴驯化4周。
[0046] 实施例三
[0047] 本发明提供了一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0048] S1，外植体的选取与准备：在温度为25℃，空气湿度为60％的条件下剪取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为3厘米的小段，每段至少带一对腋芽；
[0049] S2，外植体消毒：用灭菌水清洗3-5次，滤纸吸干，在质量百分浓度为75％的酒精中浸泡60s，在质量百分浓度为1.5％的次氯酸钠中浸泡15min，在质量百分浓度为0.5％的氯化汞中浸泡15min，在质量百分浓度为20％的漂白粉中浸泡10min，灭菌水冲洗10次，滤纸吸干；
[0050] S3，腋芽诱导：将消毒好的大花蕙兰茎段切成1.5厘米的带芽节段，接种到培养基1中，在温度为25℃，光照强度为3500lx，光照时间为12h，空气湿度为45％的条件下培养；培养基1的配方成分按照重量比为水100kg，水和硝酸钙1.5kg，硝酸钾2kg，盐酸硫胺素0.5kg，蔗糖30kg，琼脂8kg，用NaOH调节pH至8，在121℃下灭菌45min；
[0051] S4，腋芽培养：将腋芽萌发后培养25d的无菌苗茎尖剪下，接种到培养基2中，在温度为28℃，光照强度为5500lx，光照时间为20h，空气湿度为65％的条件下培养；培养基2的配方成分按照重量比为水100kg，水和硝酸钙5kg，硝酸钾2kg，盐酸硫胺素1kg，蔗糖30kg，琼脂10kg，吲哚乙酸5kg，6-苄基腺嘌呤1kg，萘乙酸5kg，用NaOH调节pH至7，在121℃下灭菌45min；
[0052] S5，丛生芽诱导：将生长至10厘米的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段，接种到培养基2中，在温度为20℃，光照强度为4000lx，光照时间为10h，空气湿度为65％的条件下培养35d；
[0053] S6，生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，接种到培养基3中，在温度为28℃，光照强度为8000lx，光照时间为10h，空气湿度为45％的条件下培养60d；培养基3的配方成分按照重量比为水100kg，硝酸铵1.5kg，氯化钙2.5kg，钼酸钠5kg，肌醇0.5kg，甘氨酸2kg，蔗糖60kg，琼脂20kg，鱼肝油5kg，松花粉1.5kg，6-苄基腺嘌呤5kg，用NaOH调节pH至8，在121℃下灭菌60min；
[0054] S7，炼苗移栽：将组培瓶盖打开，添加15ml蒸馏水，有菌驯化5d，将组培苗取出，移栽到灭菌的培养基质中，培养基质由蛭石，锯木屑，蚯蚓粪按照质量比为5：3：6混合，121℃灭菌45min，遮阴驯化5周。
[0055] 运用实施例一、实施例二和实施例三的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，分别选取100株外植体进行腋芽感染、丛生芽感染、生根感染和成活数量进行统计，统计结果如下表：
[0056]
[0057] 根据上述表格，运用实施例一的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，腋芽感染率为6％，丛生芽感染率为4.3％，生根阶段的感染率为3.3％，成活率为87％；运用实施例二的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，腋芽感染率为3％，丛生芽感染率为2.1％，生根阶段的感染率为3.2％，成活率为92％；运用实施例三的一种大花蕙兰的离体快速繁殖的方法，腋芽感染率为2％，丛生芽感染率为9.2％，生根阶段的感染率为5.6％，成活率为84％。
[0058] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
