一株高产乙醇酵母及其与产酯酵母共生发酵提高传统发酵食品品质的方法

摘要

本发明涉及一株高产乙醇的酿酒酵母Y3401菌株及其与一株高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母Y3604菌株的共生发酵培养方法与应用，酿酒酵母Y3401已于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.14828；酿酒酵母Y3401菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株酿酒酵母的26S rDNA D1/D2序列相似性较高；在高粱酶解液培养基中，以静置或摇动培养方式，两酵母菌株共生发酵不仅有利于提高乙酸乙酯含量，而且还能提高总酯含量、β‑苯乙醇和异戊醇等风味物质含量；在固态酿造体系中，两菌共生发酵能够强化大曲提酯增香的特性。本发明所涉及的双菌株共生发酵方法可应用于对乙酸乙酯有需求的白酒、黄酒、酱油等酿造工业中。

权利要求

1.一株酿酒酵母菌株，其特征在于：该酿酒酵母菌株命名为酿酒酵母菌株Y3401，已于

2017年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14828。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株Y3401和保藏号为CGMCC No.13103的异常威克汉姆酵母Y3604共生发酵在提高乙酸乙酯含量中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在高粱酶解液培养基中，采用静置方式培养，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵所产乙酸乙酯含量、总酯含量、风味物质含量高于异常威克汉姆酵母Y3604单独发酵。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母Y3604先培养12h后再接入异常威克汉姆酵母Y3401共生发酵培养。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在高粱酶解液培养基中，采用摇动方式培养，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵所产乙酸乙酯含量高于异常威克汉姆酵母Y3604单独发酵。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604同时接入共生发酵方式。

7.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，在高粱酶解液培养基中，采用静置方式培养，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照不同的接种比例同时接入进行共生发酵提高乙酸乙酯含量。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604以1：2的接种比例进行接种。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在高粱酶解液培养基中，采用摇动方式培养，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照不同的接种比例同时接入进行共生发酵提高乙酸乙酯含量。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604以3：1的接种比例进行接种。

11.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，其用于固态模拟酿造体系中，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604强化大曲提酯增香的特性。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604以1：1的比例添加到大曲中，两者总的添加比例为10％。

说明书

一株高产乙醇酵母及其与产酯酵母共生发酵提高传统发酵食

品品质的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体地说涉及一株新分离高产乙醇的酿酒酵母菌株及其与产酯酵母共生发酵的培养方法与应用。

背景技术

[0002] 乙酸乙酯是一种具有苹果香、菠萝香等水果香味的液体，它广泛应用在食品行业中。在传统酿造食品品质方面具有重要的影响作用。乙酸乙酯的含量是决定白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品品质好坏的重要因素。乙酸乙酯是我国白酒中含量较多的香味物质之一，尤其是对清香型、凤香型和米香型等白酒的风格及成型具有重要作用；在清爽型黄酒中具有重要的风味贡献作用；乙酸乙酯是酱油中的重要香气成分，对酱油的香气有举足轻重的影响。在这些传统发酵食品中，乙酸乙酯主要来源于微生物发酵产生，少量源于发酵过程中物质的化学反应和原料带入，可见，高产乙酸乙酯的微生物对于白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品的品质具有重要影响。在产乙酸乙酯微生物中，酵母是最为重要的菌株。产酯酵母是传统发酵食品中酯类物质主要产生菌株。从白酒、黄酒和酱油等酿造体系中获得能高产乙酸乙酯的功能微生物，并将其强化应用到白酒酿造体系中，对于提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造中乙酸乙酯含量，提升其品质具有重要意义。

[0003] 在前期，我们获得一株高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母Y3604，该菌株所产乙酸乙酯含量能够达到19.17 g/L，属于目前已报道产乙酸乙酯最高菌株（专利名称为：一株高产乙酸乙酯酵母菌株及其培养方法与应用，专利号为：CN201611038082.4）。但该菌株产乙酸乙酯需要有人为添加乙醇前体，这对于实际生产带来安全隐患和成本投入。众所周知，在我国白酒、黄酒和酱油等多数传统发酵食品酿造过程中，大多是多种微生物共同培养。在这些微生物中存在产生乙醇的酿酒酵母，通过筛选获得一株高产乙醇的酿酒酵母，利用该酵母协同产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母共生发酵提高白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品的品质，具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

[0004] 针对利用功能微生物提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品中乙酸乙酯含量，提升其品质的实际应用，本发明目的在于提供一种从白酒大曲中新分离的高产乙醇的菌株，命名为Y3401，并提供Y3401协同高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母Y3604共生发酵产乙酸乙酯的培养方法与应用。

[0005] 本发明涉及的酵母是通过梯度稀释法结合平板涂布法从白酒大曲中筛选获得，为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该菌株已于申请日前保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14828。

[0006] 上述所述菌株Y3401菌落特征和生化特性如下：该菌株在固体YPD培养基上菌落呈白色，表面光滑，边缘规则，中央突起，湿润易挑起，细胞为圆形；该菌株在WL培养基呈现淡黄色，边缘规则，中央微突起；所述的酿酒酵母Y3401主要用于微生物发酵制备乙醇，在乙醇发酵培养基中培养3 d，乙醇产量达到70 g/L，可以作为协同产酯酵母Y3604共同提高白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品中乙酸乙酯含量的功能微生物菌株应用到实际生产中。

[0007] 上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401菌株的26S rDNA D1/D2序列与其它多株酿酒酵母的26S rDNA D1/D2序列有99%的相似性。

[0008] 上述酿酒酵母菌株Y3401协同异常威克汉姆酵母Y3604共生发酵在提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品中乙酸乙酯含量的应用。

[0009] 上述应用，具体方法如下：

[0010] 方法1：将活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604分别都按照1×106 CFU/mL接种量接种于高粱酶解液培养基中，采用静置培养方式于30 oC培养6 d，接种方式采用同时接入和先后接入（先接入Y3401后接入Y3604和先接入Y3604后接入Y3401）三种方式进行液体产香培养；

[0011] 方法2：将活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604分别都按照1×106 CFU/mL接种量接种于高粱酶解液培养基中，采用摇动培养方式于30 oC培养6 d，接种方式采用同时接入和先后接入（先接入Y3401后接入Y3604和先接入Y3604后接入Y3401）三种方式进行液体产香培养；

[0012] 方法3：将活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照不同的比例同时接种于高粱酶解液培养基中，进行液体产香培养，采用静置培养方式于30 oC培养6 d；

[0013] 方法4：将活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照不同的比例同时接种于高粱酶解液培养基中，进行液体产香培养，采用摇动培养方式于30 oC培养6 d；

[0014] 方法5：将活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604加入到大曲中，模拟发酵体系进行固态产香培养，从而起到强化大曲提酯增香的功能。

[0015] 根据本发明优选的，所述方法1中，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604分别都按照1×106 CFU/mL的接种量接入到高粱酶解液培养基中，采用静置方式培养时，先接入异常威克汉姆酵母Y3604培养12 h后，再接入酿酒酵母Y3401的共生发酵方式所产的乙酸乙酯含量高。

[0016] 根据本发明优选的，所述方法2中，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604分别都按照1×106 CFU/mL的接种量接入到高粱酶解液培养基中，采用摇动方式培养时，以同时接入两种酵母的共生发酵方式所产乙酸乙酯含量高。

[0017] 根据本发明优选的，所述方法3中，采用静置方式培养时，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照1：2的接种比例同时接入到高粱酶解液培养基中所产乙酸乙酯含量高。

[0018] 根据本发明优选的，所述方法4中，采用摇动方式培养时，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照3：1的接种比例同时接入到高粱酶解液培养基中所产乙酸乙酯含量高。

[0019] 根据本发明优选的，所述方法5中，采用固态模拟发酵体系培养时，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照1：1的接种比例加入到大曲中，两者总和达到10%的接种量强化效果明显。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] （1）本发明筛选出的菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401来源于白酒酿造环境中，具有乙醇产量高的特点，经检测，该菌株乙醇产量可达到70 g/L；

[0022] （2）本发明通过对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604共生发酵特性的研究，优化了双菌共生发酵培养条件，提高了双菌发酵乙酸乙酯的产量。

[0023] （3）本发明中的双菌共生发酵方法有利于其在白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品中的应用。

附图说明

[0024] 图1是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401菌株在WL培养基上的菌落形态照片；

[0025] 图2是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401菌株的细胞形态照片（放大400倍）；

[0026] 图3是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401菌株系统进化发育树；

[0027] 图4是高粱酶解液培养基中，采用静置方式培养条件下，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株以不同接种方式培养产乙酸乙酯情况；

[0028] 图5是高粱酶解液培养基中，采用摇动方式培养条件下，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株以不同接种方式培养产乙酸乙酯情况；

[0029] 图6是高粱酶解液培养基中，采用静置方式培养条件下，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株按不同接种比例接种培养产乙酸乙酯情况；

[0030] 图7是高粱酶解液培养基中，采用摇动方式培养条件下，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604菌株按不同接种比例接种培养产乙酸乙酯情况。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0032] 下述实施例所用培养基如下：

[0033] YPD培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，蒸馏水定容。

[0034] WL培养基：酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，琼脂20 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，氯化铁0.0025 g/L，硫酸镁0.125 g/L，硫酸锰0.0025 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，pH值为6.5，蒸馏水定容。

[0035] 乙醇发酵培养基：葡萄糖200 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，硫酸铵1 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁1 g，蒸馏水定容至1 L。配制好后于115 ℃灭菌20 min。

[0036] 高粱酶解液培养基：称取250 g高粱粉碎，将粉末与水1:4混合，待煮沸后，保持90 ℃条件下加入耐高温α-淀粉酶于液化1 h，再加入糖化酶于60 ℃下糖化2 h。糖化后，离心取上清，通过4层纱布将其过滤，得到滤液，将浸出液的糖度调至10 Brix，分装于三角瓶中，灭菌备用。

[0037] 高粱稻壳培养基：取高粱40 g（破碎成4-5瓣），稻壳10 g，水20 mL于250 mL三角瓶中，在121 ℃下灭菌40 min。

[0038] 实施例中所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401，2017年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14828。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

[0039] 实施例中所述乙酸乙酯和2-甲基-3-庚酮标准品购自美国Sigma公司。

[0040] 实施例1 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401的分离

[0041] 将大曲粉碎并混合均匀后，称取25 g，加入225 mL无菌水，充分振荡后浸泡15 min，制成悬液。在无菌操作条件下，取0.1 mL悬液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4、10-5、10-6。取各梯度悬液0.1 mL于YPD平板上，每个稀释梯度做三个平行，由低浓度至高浓度依次涂布。将培养基平板置于30 oC的恒温培养箱中培养2 d，观察菌落生长情况。挑起平板上为球形、表面突起、乳白色、不透明的单菌落，多次划线接种于YPD平板上，直至在显微镜下观察菌体形态一致。将单菌落接种于50 mL乙醇发酵培养基中，30 oC、静置培养3 d。发酵液中乙醇含量测定采用生物传感分析仪进行。采用标配的乙醇标准液进行标定，重复三次，待系统稳定后进行样品的测定。将发酵液稀释100倍，取25 μL进行测定，重复三次并记录。最终获得一株高产乙醇的菌株，即酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401。

[0042] 实施例2 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401的保存

[0043] 上述所获得的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401通过以下方法进行保存：

[0044] （1）斜面保存：将纯化后的菌种接种至YPD斜面，放置培养箱中培养48-72 h后，在4 oC冰箱中保存。

[0045] （2）甘油管保存：取6 mL 20%甘油于已纯化的菌种平板中，将菌落刮净并与20%甘油混合，将混合液分装于1.5 mL无菌PE管中，于-80 oC下保存。

[0046] 实施例3 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401的鉴定

[0047] 上述所涉及的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401的鉴定包括以下步骤：

[0048] 步骤1：形态学特征

[0049] 为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察：

[0050] （1）YPD培养基菌落形态：将实施例1中所获得的菌株纯培养体接种于YPD培养基上，于48 h后观察其形态特征，结果如表1。

[0051] （2）WL培养基菌落形态观察和细胞观察：将筛选出的菌种接种至YPD上进行活化，培养24-48 h后接种至WL培养基，30 oC下培养，5 d后进行观察，结果如表1和图1。将其在光学显微镜下放大400倍后观察，结果如图2，呈现圆形，芽殖。

[0052] 表1 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401形态培养特征

[0053] 培养基种类 YPD WL形态特征 白色，表面光滑，边缘规则，中央微突起，湿润易挑起 淡黄色，边缘规则，中央微突起[0054] 步骤2：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401生理生化鉴定

[0055] 为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下生理生化测定：

[0056] （1）糖发酵实验

[0057] 本发明所测试的糖类包括以下糖源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、乳糖和海藻糖。

[0058] 本发明所进行的糖发酵实验由以下步骤组成： 配制糖发酵培养基，分装于试管o中，并加入杜氏管，121  C灭菌20 min；将上述糖浓度配成50 mmol/L，经过滤（0.22 μm）除菌，并将其加入含有杜氏管的培养基中； 将活化好的菌种液接入以上发酵管中，每种糖类做三个平行实验，以不加测试糖、不接菌的发酵管作为空白对照，置于25 oC下静置培养，每天观察杜氏小管中气泡量，以及颜色变化，并连续观察两周，以杜氏管中有气泡记为阳性（+），表示该酵母能利用该糖进行发酵；无气泡记为阴性（-），表示该酵母不能利用该糖进行发酵。

[0059] （2）碳同化实验

[0060] 本发明为鉴定所需同化碳源包括琥珀酸、山梨醇、木糖、鼠李糖、乙醇、赤藓糖醇、葡萄糖酸、乳酸、核糖、甲醇、甘油、D-葡糖酸-1, 5-内酯。

[0061] 本发明所进行的碳同化实验包括以下步骤： 将上述物质配成溶液，经过滤（0.22 μm）除菌后，分别加入到含有杜氏管的碳源同化培养基中，使终浓度达到50 mmol/L； 将活化后的酵母菌分别加入上述培养基中，每种碳源做三个平行，以不含碳源的试管作为空白对照，置于25 oC培养两周，两周后观察，充分振荡试管，若试管中培养基变浑浊，则记为阳性（+），反之为阴性（-）。

[0062] （3）氮同化实验

[0063] 本发明鉴定所需氮源同化物质包括硝酸钾、硫酸铵、乙胺、亚硝酸钾、L-赖氨酸和肌酐。

[0064] 本发明所进行的氮同化实验包括以下步骤： 将上述物质配成溶液，经过滤（0.22 μm）除菌后，分别加入到氮源同化培养基中，使终浓度达到50 mmol/L； 将活化的酵母分别接入到上述试管中，每个氮源做三个平行，以不加氮源的培养基作为空白对照，置于25 oC条件下培养一周，一周后观察。若试管中培养基变浑浊则记为阳性（+），反之记为阴性（-）。

[0065] 上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401菌株的生理生化实验结果如表2，可发酵葡萄糖和蔗糖，利用琥珀酸、乙醇、乳酸、核糖、甘油和葡萄糖酸，能利用硝酸钾、硫酸铵、乙胺和L-赖氨酸。

[0066] 表2 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401生理生化实验结果

[0067] 糖源 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 半乳糖 棉子糖 乳糖 海藻糖结果 + + - - - - -
碳源 琥珀酸 山梨醇 木糖 鼠李糖 赤藓糖醇 乙醇 D-葡萄糖酸-1, 5-内酯
结果 + - - - - + -
碳源 乳酸 核糖 甲醇 甘油 葡萄糖酸    
结果 + + - + +    
氮源 硝酸钾 硫酸铵 乙胺 肌酐 L-赖氨酸 亚硝酸钾  
结果 + + + - + -  

[0068] 步骤3：分子生物学鉴定

[0069] 为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行的分子生物学测定包括以下步骤：

[0070] （1）菌体培养

[0071] 上述涉及酵母是按照以下步骤进行培养：将实施例1中酵母菌株在YPD固体培养基中进行活化，在30 oC条件下培养48 h后接种于YPD液体培养基中，置于28 oC、160 r/min摇床中，培养48 h。

[0072] （2）PCR扩增

[0073] 上述涉及的酵母菌株基因组DNA提取方法按照真菌DNA提取试剂盒方法。

[0074] 本发明为鉴定所用的扩增引物为酵母26S rDNA基因D1/D2区序列扩增引物，由以下引物组成： 正向引物，NL1：5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´； 反向引物，NL4：5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´。

[0075] 上述所涉及酵母菌株鉴定的PCR条件包括以下： PCR反应体系：LA PCR Buffer 2.5 μL、正反引物各1 μL、dNTP 2 μL、LAtaq酶 0.2 μL、DNA 2 μL、ddH2O补至25 μL； PCR扩增程序：94 oC预变性5 min，94 oC变性30 s，58 oC退火30 s，72 oC延伸1 min，共30次循环，最后72 oC延伸10 min； PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。

[0076] （3）序列测定及系统发育树的构建

[0077] 将（2）中的PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，得到菌株PCR扩增片段的原始序列。采用序列图谱软件BioEdit，参照正向序列图谱，对序列人工校对。用校对后的26S rDNA D1/D2区序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），与其它多株酿酒酵母的26S rDNA D1/D2区序列有99%的相似性；为进一步显示供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树；所构建的系统进化发育树如图3所示，将该菌鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

[0078] 该菌株已于2017年10月20日日送至中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14828。

[0079] 实施例4 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604双菌液体共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法[0080] 本发明所涉及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌液体共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，具体方法如下：

[0081] 方法1：静置培养条件下，不同接种方式的培养方法

[0082] 本发明所涉及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604分别都按照1×106 CFU/mL接种量采用同时接入和先后接入（先接入Y3401 12 h后接入Y3604和先接入Y3604 12 h后接入Y3401）三种方式接入到高粱酶解液培养基中进行液体产香培养，接种后在30 ℃下静置培养6 d，每隔1 d取样进行发酵液中乙酸乙酯含量的测定，在发酵结束后，对发酵液中的风味物质进行测定。

[0083] 乙酸乙酯含量的测定采用高效液相色谱法，高效液相色谱（Agilent 1260 infinity）仪器参数为：C-18反相色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇：KH2PO4=1：1（v/v），流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 oC，进样量10 μL。

[0084] （1）乙酸乙酯标准曲线的绘制

[0085] 准确称取0.3632 g乙酸乙酯，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10 mL，即得36.2837 mg/mL的标准贮备液。分别移取30 μL、60 μL、120 μL、200 μL、300 μL和400 μL的标准贮备液，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后得0.1089-1.4513 mg/mL 6个浓度水平的乙酸乙酯标准溶液。

[0086] 将上述不同浓度梯度的乙酸乙酯标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐2
标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。根据该曲线获得的方程式为y=346.19x+3.6866（R =
0.9984）。

[0087] （2）样品的制备

[0088] 取8 mL发酵液于10 mL离心管中，经8000 r/min离心5 min，取上清液1 mL，经0.22 μm水系滤膜过滤得到样品。样品采用上述高效液相色谱法条件进行，将高效液相色谱测定样品的峰面积带入上述标准曲线方程中，计算出样品中乙酸乙酯浓度。

[0089] 发酵液中风味物质的分析采用气质联用方法，具体方法如下：

[0090] （1）样品前处理：采用顶空固相微萃取法（SPME），取7 mL发酵液倒入顶空瓶中，并加入3 g NaCl和5 µL浓度为0.5 µL /mL的2-甲基-3-庚酮（内标），加盖密封。置于恒温（60 oC）水浴30 min平衡样品，将老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中吸附30 min，再将其移入高温汽化室中解吸5 min，进行气质分析。

[0091] （2）气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-WAX，规格为（60 m×250 μm×0.25 μm）；手动无分流进样，进样口温度为230 ℃；程序升温50 ℃，保留2 min，以6 ℃/min的速率升至120 ℃，保留2 min；再以10 ℃/min升至200 ℃，稳定5 min；最后以5 ℃/min升至230 ℃，稳定3 min；检测器温度230 ℃；载气为氦气，流速1 mL/min。

[0092] （3）质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV；扫描范围20-500 u；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃。

[0093] （4）数据分析

[0094] 定性：检出挥发性物质的质谱图，通过GC-MS数据分析软件系统对未知化合物进行检索，通过与NIST11谱库进行对比，仅当匹配度大于800（最大值为1000）时予以报道。

[0095] 半定量：以2-甲基-3-庚酮为内标，将发酵液中挥发性物质的浓度与2-甲基-3-庚酮的浓度作比进行计算。

[0096] 在上述培养条件下，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵产乙酸乙酯具体情况如图4，可以看出，无论何种接菌方式培养，双菌共生发酵所产乙酸乙酯含量明显高于产酯酵母Y3604单独发酵，发酵液中挥发性风味物质种类和含量也都有所改善，影响白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品品质的总酯、β-苯乙醇和异戊醇含量得到提高（表3）；根据结果，优选异常威克汉姆酵母Y3604先接入12 h后，再接入酿酒酵母Y3401进行双菌共生发酵培养方法，乙酸乙酯产量达到2.86 g/L。

[0097] 表3 静置培养下不同接种方式对发酵液中主要风味物质的影响（g/100 mL）[0098]

[0099] 注：-记为未检出。

[0100] 方法2：摇动培养条件下，不同接种方式的培养方法

[0101] 本发明所涉及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604分别都按照1×106 CFU/mL接种量采用同时接入和先后接入（先接入Y3401 12 h后接入Y3604和先接入Y3604 12 h后接入Y3401）三种方式接入到高粱酶解液培养基中进行液体产香培养，接种后在30 ℃下摇动培养6 d，每隔1 d取样进行发酵液中乙酸乙酯含量的测定，在发酵结束后，对发酵液中的风味物质进行测定。

[0102] 样品中乙酸乙酯含量的测定采用高效液相色谱法，具体方法按照上述方法1中所描述的进行。

[0103] 样品中风味物质含量的测定采用气质联用方法，具体方法按照上述方法1中所描述的进行。

[0104] 在上述培养条件下，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵产乙酸乙酯具体情况如图5，可以看出，无论何种接菌方式培养，双菌共生发酵所产乙酸乙酯含量明显高于产酯酵母Y3604单独发酵，根据结果，优选酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604同时接入进行双菌共生发酵培养方法，乙酸乙酯产量达到5.28 g/L，影响白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品风味的总酯和异戊醇等风味物质含量得到提高（表4）。

[0105] 表4 摇动培养条件下不同接种方式对发酵液中主要风味物质的影响（g/100 mL）[0106]

[0107] 注：-记为未检出。

[0108] 方法3：静置培养条件下，不同接种比例的培养方法

[0109] 本发明所涉及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照不同比例的接种量采用同时接入方式接入到高粱酶解液培养基中进行液体产香培养，接种后在30 ℃下静置培养6 d，每隔1 d取样进行发酵液中乙酸乙酯含量的测定，在发酵结束后，对发酵液中的风味物质进行测定。

[0110] 样品中乙酸乙酯含量的测定采用高效液相色谱法，具体方法按照上述方法1中所描述的进行。

[0111] 样品中风味物质含量的测定采用气质联用方法，具体方法按照上述方法1中所描述的进行。

[0112] 在上述培养条件下，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵产乙酸乙酯具体情况如图6，可以看出，不同的接种比例接种发酵所产乙酸乙酯不同，根据结果，优选酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照1：2的比例接入进行双菌共生发酵培养方法，乙酸乙酯产量达到2.99 g/L，总酯含量高（表5）。

[0113] 表5 静置培养不同菌种比例对发酵液中主要风味物质的影响（g/100 mL）[0114]

[0115] 注：-记为未检出。

[0116] 方法4：摇动培养条件下，不同接种比例的培养方法

[0117] 本发明所涉及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照不同比例的接种量采用同时接入方式接入到高粱酶解液培养基中进行液体产香培养，接种后在30 ℃下摇动培养6 d，每隔1 d取样进行发酵液中乙酸乙酯含量的测定，在发酵结束后，对发酵液中的风味物质进行测定。

[0118] 样品中乙酸乙酯含量的测定采用高效液相色谱法，具体方法按照上述方法1中所描述的进行。

[0119] 样品中风味物质含量的测定采用气质联用方法，具体方法按照上述方法1中所描述的进行。

[0120] 在上述培养条件下，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵产乙酸乙酯具体情况如图7，可以看出，不同的接种比例接种发酵所产乙酸乙酯不同，根据结果，优选酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604按照3：1的比例接入进行双菌共生发酵培养方法，乙酸乙酯产量达到6.41 g/L，总酯、总酸、总醇等多种风味物质含量高（表6）。

[0121] 表6 摇床培养不同菌种比例对发酵液中主要风味物质的影响（g/100 mL）[0122]

[0123] 注：-记为未检出。

[0124] 实施例5 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y3604双菌固态模拟发酵体系共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法

[0125] 本发明所涉及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌固态模拟发酵体系共生发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，具体方法如下：

[0126] 将酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604在YPD培养基中活化，细胞个数达到1×106 CFU/mL。活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604以1:1的比例，按照10%的接种量接入到高粱稻壳培养基中，作为实验组A；将活化好的酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604以1:1的比例混合后，按照10%的接种量同大曲一起接入高粱稻壳培养基中，大曲添加量为12.5%，作为实验组B；以仅接大曲的（大曲添加量为12.5%）和不接菌的高粱稻壳培养基作为对照组C和D。置于常温下静置培养10 d。

[0127] 样品中风味物质含量的测定采用气质联用方法，具体方法按照上述的实施例4中所描述的方法进行。

[0128] 表7中的数据已扣除空白对照高粱稻壳培养基中的挥发性物质，比较实验组A（酿酒酵母Y3401+异常威克汉姆酵母Y3604）和B（酿酒酵母Y3401+异常威克汉姆酵母Y3604+大曲），两组实验样品中的挥发性化合物种类和数量均较为丰富。其中，将酿酒酵母Y3401、异常威克汉姆酵母Y3604和大曲共同加入到高粱稻壳培养基中进行模拟固态发酵，样品中的挥发性物质最多，检测到了以乙醇、β-苯乙醇为主的5种醇类，12种酯类，主要包括乙酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯等；酸类、酮类、烷烃类等40余种化合物。其中乙酸乙酯含量比仅有大曲的固态发酵提高了约10倍。根据本发明，酿酒酵母Y3401和异常威克汉姆酵母Y3604双菌共生发酵能够强化大曲，使得发酵中的挥发性化合物种类和含量有所提高。

[0129] 表7 不同菌种模拟固态发酵挥发性成分结果（mg/kg）

[0130]

[0131] 注：-记为未检出。