一种西北奇异球菌R15及其应用

摘要

本发明涉及一种西北奇异球菌R15，其于2019年3月14日保藏于CCTCC，保藏编号为CCTCC No:M 2019143。本发明利用西北奇异球菌R15催化合成5‑羟甲基糠酸，首先将西北奇异球菌R15接种于TGY培养基，进行活化、培养后，收集菌体细胞；接着将5‑羟甲基糠醛加入到pH 6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后加入菌体细胞，在20～60℃下反应3～48h，得到5‑羟甲基糠酸。本发明利用西北奇异球菌R15对5‑羟甲基糠醛具有高耐受性，能够催化高浓度底物选择性氧化合成目标产物，产率达90％以上。本发明的合成方法具有底物浓度更高、反应效率更优异，选择性好的特点。

权利要求

1.一种西北奇异球菌(Deinococcus xibeiensis)R15，保藏于CCTCC，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCC No:M 2019143。

2.权利要求1所述西北奇异球菌R15在5-羟甲基糠酸合成中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用方法包括如下步骤：(1)将西北奇异球菌R15接种于TGY培养基，活化后，按1％的接种量接入新鲜TGY培养基中培养，收集菌体细胞；

(2)将5-羟甲基糠醛加入到pH 6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后，加入步骤(1)收集的菌体细胞，在温度20～60℃下反应3～48h，得到5-羟甲基糠酸；

步骤(1)中，所述TGY培养基配方为：酵母膏质量浓度0.3％，蛋白胨质量浓度0.5％，葡萄糖质量浓度0.1％。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述活化温度为30℃，转速为

200r/min，活化时间为30h。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述培养温度为30℃，转速为

200r/min，时间为48h。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液中的任意一种。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述5-羟甲基糠醛在缓冲液中的浓度为100～500mM。

8.如权利要求3至7任一项所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述菌体细胞的加入量为20～200mg/mL。

说明书

一种西北奇异球菌R15及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株西北奇异球菌及其应用，尤其是西北奇异球菌R15在催化5-羟甲基糠醛选择性氧化合成5-羟甲基糠酸中的应用，属于生物催化及化学工程领域。

背景技术

[0002] 随着21世纪倡导以绿色能源替代石油资源以及在化学工业中寻求环保替代品的可持续发展理念的深入，生物质能源和生物技术在资源与环境问题日益严峻的当代占据着愈来愈关键的地位。5-羟甲基糠醛(HMF)是一种由葡萄糖或果糖脱水生成的化学物质，分子中含有一个呋喃环，一个醛基和一个羟甲基，其化学性质比较活泼，可以通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是重要的精细化工原料，也被认为是最具价值和潜力替代石化工业中基础化学品的生物基平台化学品。

[0003] 由于HMF分子呋喃环上带有醛基和羟甲基等高活性官能团，因此可以催化氧化生成一系列呋喃类芳香化合物，根据氧化的位置和氧化程度，可以分别氧化成5-羟甲基-2-呋喃甲酸(5-hydroxymethylfuroic acid，HMFCA)，2，5-呋喃二甲醛(2，5-diformylfuran，DFF)，5-甲酰基-2-呋喃甲酸(5-formylfuroic acid，FFCA)，2，5-呋喃二甲酸(2，5-furandicarboxylic acid，FDCA)，当环上醛基被还原为羟基，得到HMF的还原产物2,5-呋喃二甲醇(2,5-Furandimethanol，BHMF)。这些氧化还原衍生物都是关键的合成桥梁化合物，在农业、能源、医药、高分子等领域有着广泛应用。例如，HMFCA自身带有羧基和羟甲基，可以自身或者与其他化合物聚合成多种聚酯，同时还可以作为白介素抑制剂。

[0004] 目前，由HMF制备HMFCA主要有化学转化法和生物转化法。化学转化法已经取得较多进展，主要是以金属催化剂催化HMF氧化制备，然而，化学法反应需要较高温度和压力，存在产物选择性和底物耐受性差的问题；利用生物催化剂可在温和的反应条件下以HMF为底物，转化生成HMFCA，具有高产率和高选择性，同时保持高化学纯度，低副产物，但由于5-羟甲基糠醛对微生物细胞有毒害作用，大部分微生物通常对HMF的底物耐受性浓度较低、且催化HMF转化速度慢，因此，迫切需要筛选出一种对底物HMF具有高耐受性，并且能高效催化HMF选择性氧化合成HMFCA的菌株。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种西北奇异球菌(Deinococcus xibeiensis)R15菌株，其对底物HMF具有高耐受性，并且能高效催化HMF选择性氧化合成HMFCA。

[0006] 技术方案

[0007] 一种西北奇异球菌R15，保藏于CCTCC，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCC No:M 2019143。该菌株是从新疆核爆实验区受核辐射污染的土样中分离筛选出的，经微生物分类鉴定，确定该菌株属于异常球菌属(Deinococcus)的新种，命名为Deinococcus xibeiensis R15,研究表明，该菌株对高剂量辐射和紫外线具有极强的耐受性。

[0008] 上述西北奇异球菌R15在5-羟甲基糠酸合成中的应用。所述应用方法包括如下步骤：

[0009] (1)将西北奇异球菌R15接种于TGY培养基，活化后，按1％的接种量接入新鲜TGY培养基中培养，收集菌体细胞；

[0010] (2)将5-羟甲基糠醛加入到pH 6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后，加入步骤(1)收集的菌体细胞，在温度20～60℃下反应3～48h，得到5-羟甲基糠酸。

[0011] 进一步，步骤(1)中，所述TGY培养基配方为：酵母膏质量浓度0.3％，蛋白胨质量浓度0.5％，葡萄糖质量浓度0.1％。

[0012] 进一步，步骤(1)中，所述活化温度为30℃，转速为200r/min，活化时间为30h。

[0013] 进一步，步骤(1)中，所述培养温度为30℃，转速为200r/min，时间为48h。

[0014] 进一步，步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液中的任意一种。

[0015] 进一步，步骤(2)中，所述5-羟甲基糠醛在缓冲液中的浓度为100～500mM。

[0016] 进一步，步骤(2)中，所述菌体细胞的加入量为20～200mg/mL。

[0017] 本发明的有益效果：与现有的技术相比，本发明利用西北奇异球菌作为催化剂，能高效、高选择性地催化HMF转化为目标产物HMFCA，并且克服了化学催化剂环境不友好的缺点；本发明采用的生物催化剂西北奇异球菌对HMF具有高耐受性，能够催化高浓度底物(200mM)选择性氧化合成目标产物，产率达90％以上，与已报道的生物催化工艺相比，本发明不仅底物浓度更高、反应效率更优异，而且选择性也更好；本发明合成5-羟甲基糠酸的反应过程简单，无需添加培养基(添加培养基会使反应体系更加复杂)，易控、条件温和，有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺；本发明采用的西北奇异球菌对辐射、高温、干燥、化学试剂毒性等极端环境有明显的耐受性，因此可不受工业生产条件的限制。

附图说明

[0018] 图1为西北奇异球菌R15菌落形态图；

[0019] 图2为实施例1合成产物的液相色谱图。

具体实施方式

[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。

[0021] 下述实施例中使用的生物材料西北奇异球菌R15，是从新疆核爆实验区受核辐射污染的土样中分离筛选出的，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCC No:M 2019143。

[0022] 实施例1

[0023] 西北奇异球菌R15在5-羟甲基糠酸合成中的应用方法，包括如下步骤：

[0024] (1)将西北奇异球菌R15接种于TGY培养基(酵母0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.1％)，在30℃及200r/min的条件下活化30h(西北奇异球菌R15的菌落形态图见图1)，按
1％的接种量接入新鲜TGY培养基中，30℃、200r/min下培养48h，收集菌体细胞；

[0025] (2)在2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH 7.4)中加入0.25mmol HMF(100mM)，混合均匀后，按120mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入步骤(1)收集的菌体细胞，在20℃、850r/min下反应，利用液相色谱监控反应，8h后，液相色谱图见图2(HMFCA及HMF的保留时间分别为2.81及6.15min)，HMF转化率为76.94％，HMFCA产率为99.44％。

[0026] 其中，液相色谱检测的方法与条件分别为：仪器为Thermo Fisher ultimate 3000，检测器为UV检测器；检测波长为230nm；色谱柱为Sepax GP-C18 column(4.6mm×
250mm,5μm)；流动相为A：20mM KH2PO4；B：100％乙腈；梯度洗脱(0min:10％B；7min:24％；
10min:10％B)；流速为1.0ml min-1；柱温为25℃；进样量为5μl。

[0027] 实施例2

[0028] 将步骤(2)中反应温度改为40℃，其余与实施例1相同。反应8h后，HMF转化率为99.85％，HMFCA产率为98.22％。

[0029] 实施例3

[0030] 将步骤(2)中反应温度改为60℃，其余与实施例1相同。反应8h后，HMF转化率为48.59％，HMFCA产率为97.38％。

[0031] 实施例4

[0032] 将步骤(2)中磷酸盐缓冲液的pH 7.4改为pH 6.0，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。反应8h后，HMF转化率为56.90％，HMFCA产率为99.84％。

[0033] 实施例5

[0034] 将步骤(2)中磷酸盐缓冲液的pH 7.4改为pH 7.0，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。反应8h后，HMF转化率为74.4％，HMFCA产率为99.07％。

[0035] 实施例6

[0036] 将步骤(2)中磷酸盐缓冲液的pH 7.4改为pH 8.0，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。反应8h后，HMF转化率为58.83％，HMFCA产率为98.85％。

[0037] 实施例7

[0038] 将步骤(2)中的2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)改为2.5mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 9.0)，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。反应8h后，HMF转化率为60.06％，HMFCA产率为97.80％。

[0039] 实施例8

[0040] 将步骤(2)中菌体细胞的加入量120mg/mL改为40mg/mL，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。反应12h后，HMF转化率为29.1％，HMFCA产率为98.42％。

[0041] 实施例9

[0042] 将步骤(2)中菌体细胞的加入量120mg/mL改为80mg/mL，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。反应12h后，HMF转化率为59.75％，HMFCA产率为98.63％。

[0043] 实施例10

[0044] 将步骤(2)中2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)改为5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)，0.25mmol HMF(100mM)改为0.75mmol HMF(150mM)，菌体细胞的加入量120mg/mL改为200mg/mL，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。24h后，HMF转化率为89.13％，HMFCA产率为98.79％。

[0045] 实施例11

[0046] 将步骤(2)中2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)改为5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)，0.25mmol HMF(100mM)改为1.0mmol HMF(200mM)，菌体细胞的加入量120mg/mL改为200mg/mL，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。24h后，HMF转化率为70.71％，HMFCA产率为98.24％。

[0047] 实施例12

[0048] 将步骤(2)中2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)改为5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)，0.25mmol HMF(100mM)改为1.5mmol HMF(300mM)，菌体细胞的加入量120mg/mL改为200mg/mL，反应温度改为30℃，其余与实施例1相同。36h后，HMF转化率为53.88％，HMFCA产率为97.63％。

[0049] 实施例13

[0050] 将步骤(2)中2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)改为5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)，0.25mmol HMF(100mM)改为1.5mmol HMF(300mM)，菌体细胞的加入量120mg/mL改为200mg/mL，反应温度改为30℃，每隔3h时，加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0，其余与实施例1相同。36h后，HMF转化率为75.90％，HMFCA产率为99.34％。

[0051] 实施例14

[0052] 将步骤(2)中2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)改为5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)，0.25mmol HMF(100mM)改为2.5mmol HMF(500mM)，菌体细胞的加入量120mg/mL改为200mg/mL，反应温度改为30℃，每隔3h时，加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0，其余与实施例1相同。36h后，HMF转化率为49.61％，HMFCA产率为98.72％。