一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法转让专利
申请号 : CN201910237315.0
文献号 : CN109825440B
文献日 : 2021-02-19
发明人 : 王亮 , 温馨 , 陈卓雅 , 王雯 , 陆军 , 郑元林
申请人 : 江苏师范大学
摘要 :
本发明涉及一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法，该方法是利用由啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟组成的混合抗菌剂在莱茵衣藻培养过程中除真菌与细菌的方法。本发明的优点是利用啶酰菌胺和头孢噻肟去除真菌、氨苄青霉素去除细菌，三种有效配合使用，具有广谱性，解决利用莱茵衣藻进行实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，能够良好的保存珍稀藻种。
权利要求 :
1.一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法，其特征是：将被杂菌污染的衣藻接种至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/
10 h明暗光，光强8000 Lx的条件下除菌培养5-8天，最终实现染菌衣藻的除菌；所述的混合抗菌剂包括：100 μg/ml啶酰菌胺、500 μg/ml氨苄青霉素和100 μg/ml头孢噻肟；所述的衣藻即实验藻种为莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii；所述TAP固体培养基平板为： TAP盐溶液25 ml/L，磷酸盐溶液0.375 ml/L，Hutner微量元素1 ml/L，乙酸1 ml/L，Tris
2.42 g/L，琼脂粉15 g/L，高压蒸汽灭菌121℃20 min，倒平板备用；所述的含有混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂啶酰菌胺使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基配制过程时添加，抗细菌剂氨苄青霉素使用终浓度500μg/ml，头孢噻肟使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基经由高压蒸汽灭菌后，冷却至约55℃后再添加；
TAP盐溶液为NH4Cl 15 g/L, MgSO4•7H2O 4 g/L, CaCl2•2H2O 2 g/L；磷酸盐溶液为K2HPO4 288 g/L, KH2PO4 144 g/L；Hutner微量元素为EDTA二钠盐 50 g/L, ZnSO4•7H2O 22 g/L, H3BO3 11.4 g/L, MnCl2•4H2O 5.06 g/L, CoCl2•6H2O 1.61 g/L, CuSO4•5H2O 1.57 g/L, (NH4)6Mo7O24•4H2O 1.1 g/L, FeSO4•7H2O 4.99 g/L，用KOH或者HCl 调节pH至7.0。
说明书 :
一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法。
背景技术
[0002] 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，简称衣藻，是一种单倍体真核细胞，具有结构简单、生长周期短、易于培养等特点，是光合作用、黑暗异养代谢、细胞调控与凋亡、细胞骨架、厌氧代谢和生物制氢、营养和能量代谢等研究领域的重要模式生物。目前，衣藻已完成全基因组测序，其相关基因的功能分析也在深入研究，基因编辑技术的发展更加推动了以衣藻为模式生物的研究，且具有实际应用价值，如纤毛疾病、生物柴油、生物去污等。然而，在衣藻的培养、研究与应用过程中会存在着杂菌污染藻种的危险，这种杂菌污染会影响实验结果，阻碍衣藻的生长，甚至会造成藻种的失活，不利于藻种的保存与应用，尤其是稀有藻种，所以找到一种有效去除杂菌又不能对藻的生长状态产生抑制作用的方法是很有必要的。
[0003] 常见的除菌方法主要可分为物理法和化学法；
[0004] 物理法：单克隆划线或铺板法，与离心沉淀洗脱法等。单克隆划线法或铺板法主要就是通过稀释分离的原理，使得杂菌与衣藻分离，获得没有杂菌污染的衣藻；而离心沉淀洗脱法是通过多次离心分离杂菌和衣藻。但是，这些方法都不能有效应用于杂菌污染严重的衣藻藻种，且离心沉淀洗脱法对于高粘附性的细菌也是无用的。
[0005] 化学法：主要是利用抗真菌和细菌的药物来去除杂菌。如20-40μg/ml的多菌灵、甲基托布津、苯菌灵三种苯并咪唑类除真菌剂均可有效去除衣藻的真菌污染(Mahan,2005,BioTechniques)；多菌灵(40μg/ml)、氨苄青霉素(500μg/ml)、头孢噻肟(100μg/ml)可有效去除细菌和真菌的混合污染(Kan,2009,Journal of Phycology)。我们也报道了戊唑醇或者嘧菌酯，与萘啶酮酸搭配的混合抗菌剂能在一定范围能去除杂菌的污染，醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟也可以杀死混合杂菌。然而，持续使用一种或者两种组合抗菌剂去除杂菌污染，可能会造成使细菌或者真菌产生耐药性，无法彻底的去除杂菌污染。因而，多种组合的抗菌剂(除细菌+除真菌)急需探究与发现，而其中真菌的抑制最为困难(休眠的真菌孢子不容易被杀死，在条件适宜以后又开始萌发)。因此我们在已知的抗真菌剂类别中筛选了多种抗真菌剂，其中多数是对衣藻生长具有强烈抑制作用的。
[0006] 细菌和真菌的生物类型、细胞结构、细胞器组成、增殖与代谢方式等均存在差异，所以除细菌、真菌需用不同的方法，通过分别选用针对细菌的抗菌剂和针对真菌的抗菌剂，再将两者相互配合使用，可有效清除细菌、真菌，具有广谱性。但是经过实践，多次使用多菌灵/氨苄青霉素/头孢噻肟，醚菌酯/氨苄青霉素/头孢噻肟，戊唑醇或者嘧菌酯/萘啶酮酸组合剂进行莱茵衣藻污染藻种的除菌后，发现杂菌不能有效的去除，从而影响莱茵衣藻的保种与后续的实验。
[0007] 本发明涉及的抗真菌剂啶酰菌胺属于烟酰胺类杀真菌剂，通过抑制线粒体琥珀酸酯脱氢酶、阻碍三羧酸循环而杀除真菌，对孢子的萌发有很强的抑制能力,杀菌作用由母体活性物质直接引起，没有相应代谢活性，且与其它抗菌剂无交互抗性，杀菌谱较广。抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟均属于β-内酰胺类抗生素，均主要是通过抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成来有效抗细菌。氨苄青霉素对大多数革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌效果不佳；而头孢噻肟对革兰阴性菌有较强的抗菌效能，但对革兰氏阳性菌效果不佳，所以二者联合使用能够有效抗细菌，可有效对于多菌灵/氨苄青霉素/头孢噻肟，醚菌酯/氨苄青霉素/头孢噻肟，戊唑醇或者嘧菌酯/萘啶酮酸这些组合除菌剂无效的衣藻污染藻种的除菌。
发明内容
[0008] 本发明的目的是要提供一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法，有效解决在衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染问题。该方法既不影响衣藻的生长状况，又能有效去除细菌和杂菌的污染，操作简单且能广泛应用。
[0009] 本发明的目的是这样实现的：该除菌方法如下：将被杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000 Lx的条件下除菌培养5-8天，实现衣藻的除菌；然后转接至普通TAP固体培养基保种或进行后续实验；所述的混合抗菌剂包括：100μg/ml啶酰菌胺、500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟，其中啶酰菌胺和头孢噻肟是抗真菌剂、氨苄青霉素是抗细菌剂。
[0010] 所述的衣藻即实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。
[0011] 所述TAP固体培养基平板为：TAP盐溶液(NH4Cl 15g/L,MgSO4·7H2O 4g/L,CaCl2·2H2O 2g/L)25ml/L，磷酸盐溶液(K2HPO4 288g/L,KH2PO4 144g/L)0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO4·7H2O 22g/L,H3BO3 11.4g/L,MnCl2·4H2O 5.06g/L,CoCl·6H2O 1.61g/L,CuSO4·5H2O 1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L,FeSO4·7H2O
4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，琼脂粉15g/L，高压蒸汽灭菌121℃20min，倒平板备用。
4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，琼脂粉15g/L，高压蒸汽灭菌121℃20min，倒平板备用。
[0012] 所述的含有混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂啶酰菌胺使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基配制过程时添加，抗细菌剂氨苄青霉素使用终浓度500μg/ml，头孢噻肟使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基经由高压蒸汽灭菌后，冷却至约55℃后再添加。
[0013] 有益效果，由于采用了上述方案，利用抗真菌剂啶酰菌胺与抗细菌剂氨苄青霉素、头孢噻肟混合去除衣藻杂菌。抗真菌剂啶酰菌胺属于烟酰胺类杀真菌剂，通过抑制线粒体琥珀酸酯脱氢酶、阻碍三羧酸循环而杀除真菌，对孢子的萌发有很强的抑制能力,与其它抗菌剂无交互抗性，杀菌谱较广。抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟均属于β-内酰胺类抗生素。都主要是通过抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成来有效抗细菌。氨苄青霉素对大多数革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌效果不佳；而头孢噻肟对革兰阴性菌有较强的抗菌效能，但对革兰氏阳性菌效果不佳。所以二者联合使用能够有效抗细菌。目前未见报道使用啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟的混合抗菌剂进行衣藻污染的去除，该方法具有广谱杀菌特性，适用于各个研究环境下细菌真菌污染的去除，特别是对于多菌灵/氨苄青霉素/头孢噻肟，醚菌酯/氨苄青霉素/头孢噻肟，戊唑醇或者嘧菌酯/萘啶酮酸这些组合除菌剂无效的衣藻污染藻种的除菌。该方法不影响衣藻生长状况，且除菌能力强，操作方法简便，易于推广应用等，能够有效解决衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染问题，达到了本发明的目的。
[0014] 优点：利用啶酰菌胺去除真菌、氨苄青霉素和头孢噻肟去除细菌污染的特性，三者联合使用，能有效解决衣藻培养过程中产生的杂菌污染问题，利于稀有的莱茵衣藻藻种的保存，提高藻种存活率，且不影响衣藻自身的生长状况，具有良好的应用前景。
[0015] 1、本发明所采用的除菌剂啶酰菌胺、氨苄青霉素、头孢噻肟的三种混合试剂未曾报道用于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的除菌。莱茵衣藻具有结构简单、生长较快、易于培养、功能保守、遗传分析与生化分析简单等特点，它作为模式生物被广泛应用。
[0016] 2、啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟的混合抗菌剂的可以与其他类别的混合除菌剂交替使用，有效避免杂菌产生抗性无法除菌的状况。
[0017] 3、本发明能有效解决利用莱茵衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，利于稀有莱茵衣藻藻种的保存，提高藻种存活率，且对衣藻的生长无不良影响，无毒无害，可广泛应用病推广。
附图说明
[0018] 图1是污染莱茵衣藻细胞在普通TAP固体培养基平板上生长状况图。
[0019] 图2是污染莱茵衣藻细胞在本发明的啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟的混合除菌方案的平板上生长状况图。
[0020] 图3是在醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟除菌剂组合下，使用第7次时，衣藻细胞中仍具有污染的藻落，表明其杂菌具有对应的抗性。
[0021] 图4是将图3具有抗性不容易杀死的藻细胞涂布在含有啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟的平板上，可以有效的去除抗性杂菌。
[0022] 图5是在嘧菌酯、萘啶酮酸除菌剂组合下，使用第5次时，衣藻细胞中仍具有污染的藻落，表明其杂菌具有对应的抗性。
[0023] 图6是将图5具有抗性不容易杀死的藻细胞涂布在含有啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟的平板上，可以有效的去除抗性杂菌。
具体实施方式
[0024] 该除菌方法如下：将被杂菌污染的衣藻转接划线至含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000 Lx的条件下除菌培养5-8天，实现衣藻的除菌；然后转接至普通TAP固体培养基保种或进行后续实验；所述的混合抗菌剂包括：100μg/ml啶酰菌胺、500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟，其中啶酰菌胺和头孢噻肟是抗真菌剂、氨苄青霉素是抗细菌剂。
[0025] 所述的衣藻即实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。
[0026] 所述TAP固体培养基平板为：TAP盐溶液(NH4Cl 15g/L,MgSO4·7H2O 4g/L,CaCl2·2H2O 2g/L)25ml/L，磷酸盐溶液(K2HPO4 288g/L,KH2PO4 144g/L)0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO4·7H2O 22g/L,H3BO3 11.4g/L,MnCl2·4H2O 5.06g/L,CoCl·6H2O 1.61g/L,CuSO4·5H2O 1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L,FeSO4·7H2O
4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，琼脂粉15g/L，高压蒸汽灭菌121℃20min，倒平板备用。
4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，琼脂粉15g/L，高压蒸汽灭菌121℃20min，倒平板备用。
[0027] 所述的含有混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂啶酰菌胺使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基配制过程时添加，抗细菌剂氨苄青霉素使用终浓度500μg/ml，头孢噻肟使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基经由高压蒸汽灭菌后，冷却至约55℃后再添加。
[0028] 实施例1：A.配制TAP固体培养基，备用；B.将被混合杂菌污染的衣藻划线接种到TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000 Lx的条件下培养3-5天；C.配制含有100μg/ml啶酰菌胺、500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟的混合抗菌剂TAP固体培养基平板,待用；D.杂菌污染的衣藻培养好后转接划线到含有混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000Lx的条件下培养5-8天除去杂菌；E.挑取除菌后的单克隆衣藻，在普通的TAP固体培养基平板上进行转接划线，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000Lx的条件下培养3-5天，待后续实验或者保种备用。
[0029] 具体步骤为：
[0030] 1、污染衣藻活化：将被杂菌污染的衣藻划线接种到TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000 Lx的条件下培养3-5天，使衣藻处于生长能力较强的状态；所述的TAP固体培养基平板包括：TAP盐溶液(NH4Cl 15g/L,MgSO4·7H2O 4g/L,CaCl2·2H2O 2g/L)25ml/L，磷酸盐溶液(K2HPO4 288g/L,KH2PO4 144g/L)0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO4·7H2O 22g/L,H3BO3 11.4g/L,MnCl2·
4H2O5.06 g/L,CoCl·6H2O 1.61g/L,CuSO4·5H2O 1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L,FeSO4·7H2O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，琼脂粉15g/L，高压蒸汽灭菌121℃20min，倒平板备用。
4H2O5.06 g/L,CoCl·6H2O 1.61g/L,CuSO4·5H2O 1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L,FeSO4·7H2O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，琼脂粉15g/L，高压蒸汽灭菌121℃20min，倒平板备用。
[0031] 2、污染衣藻除菌：配制含有100μg/ml啶酰菌胺、500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟的TAP固体培养基平板。挑取上述培养好的被污染的衣藻划线转接至含有上述混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000 Lx的条件下培养5-8天，去除杂菌。
[0032] 3、去除菌后的衣藻转接：将去除杂菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上，在温度23±0.5℃，光照周期14/10h明暗光，光强8000 Lx的条件下培养3-5天，进行后续实验或者保种备用。
[0033] 进一步污染衣藻除菌时，选用步骤：如果衣藻杂菌污染较为严重，可通过上述第2步处理后，重复第二步以保证污染杂菌的彻底去除。
[0034] 实施例2：
[0035] 参照CN108485982A中实施例1方法，使用第7次时，杂菌该组合剂(醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟)具有对应的抗性，如图3所示。
[0036] 实施例3：
[0037] 对于经实施例2的衣藻除菌后，继续用实施例1的方法重新除菌，结果如图4。
[0038] 实施例4：
[0039] 参照CN104893979A中实施例1方法，使用第5次时，杂菌该组合剂(嘧菌酯、萘啶酮酸)具有对应的抗性，如图5所示。
[0040] 实施例5：
[0041] 对于经实施例4的衣藻除菌后，继续用实施例1的方法重新除菌，结果如图6。